上一届课件-重组dna技术

1binantDNATechnology重组DNA技术2重组DNA技术的建立和发展：1970年,Smith等发现的限制性核酸内切酶;Khorana发现T4DNA连接酶为基因工程提供了有力的工具。

1972年,Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功。

1973年,Cohen创立了体外重组DNA技术的模式。

1979年,美国基因公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素。概述3克隆（clone）

在细胞学中，指通过无性繁殖过程产生成千上万个与亲代完全相同的子代群体。这一群体中的所有细胞具有完全相同的基因型和表型。（或指一个亲本细胞产生成千上万个相同细胞群体的过程）

DNA克隆的概念4“克隆”在分子生物学中，是指通过重组DNA(binantDNA)技术获得具有相同DNA序列的单一基因或DNA片段的多个拷贝(copy)。

重组DNA技术是对DNA或基因进行操作，又是在分子水平上操作，因此又称为

DNA克隆DNAcloning

基因克隆genecloning

分子克隆molecularcloning

5重组DNA技术的概念（binantDNAtechnology）应用酶学方法，按照人的意愿，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作组装成新的DNA分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子、以获得该

DNA分子的大量拷贝的过程。不同来源的DNA共价连接形成的新的DNA分子称为重组DNA（binantDNA）。6DNA克隆（DNAcloning）技术是分子生物学的核心技术，其中的关键技术是重组DNA技术。

DNA克隆的主要目的是获得某一基因或DNA的大量拷贝。7DNA克隆的策略与技术路线1、获得目的基因/目的DNA

2、目的基因与载体的酶切

3、目的基因与载体的连接

4、重组DNA分子导入受体细胞

5、筛选和鉴定含重组DNA分子的受体细胞

克隆89

DNA克隆的基本过程1、分：分离目的基因2、切：对目的基因和载体适当切割3、接：目的基因与载体连接4、转：重组DNA转入受体菌5、筛：筛选出含有重组体的受体菌10第一节基因克隆重要的工具酶11

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶ⅠKlenow片段逆转录酶

TaqDNA聚合酶

T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶DNA聚合酶

修饰酶

工具酶在重组DNA技术中有特殊的用途12

一、限制性核酸内切酶

（restrictionendonuclease，限制酶）

定义:一类能识别双链DNA分子中特定DNA碱基序列，并水解该序列内部或附近的磷酸二酯键的核酸内切酶。

特点:

识别特定碱基顺序（限制位点）

切割双链DNA（磷酸二酯键）

核酸内切酶

13

根据限制性酶的识别切割特性、催化条件以及是否具有修饰酶活性，分为I、II、

III型。通常所指的限制酶为II型限制性内切酶。（一）限制酶的分类141.I型限制酶:

具有限制和修饰活性

辅助因子:Mg2+、ATP和SAM

识别和切割位点不一致:

在DNA链上没有固定的切割位点，一般在识别位点外1Kb至7Kb处随机切割，不产生特异片段。有甲基化作用152.II型限制酶：

即通常所用的限制性内切酶；分子量小。辅助因子:Mg2+

切割位点在识别位点内

：能识别和切割双链

DNA的特异序列，产生特异的DNA片断。无甲基化作用163.III型限制酶：

具有限制和修饰活性

分子量大辅助因子:Mg2+、ATP和SAM

特异切割位点在识别位点3’末端外24～26bp处有甲基化作用17第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序；前三个字母用斜体。（二）限制酶的命名HindⅢ

属

系

株

序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶18（三）II型酶的识别、切割功能(1)以核酸内切方式水解磷酸二酯键，产生的

DNA片段，5’端为P基，3’端为OH基。(2)识别序列一般为4～8bp，通常具有回文结构(Palindrome)19(3)切割DNA双链可产生2种末端

平末端（bluntendsorflushends）

5’AGCT3’

AluⅠ5’AGpCT3’

3’TCGA5’3’TCp

GA5’粘性末端（stickyends

orcohesiveends）:

沿识别序列的对称轴，对DNA的双链同时交错切割，产生具有互补碱基顺序的游离的单链末端。205'端突出的粘性末端

5′

GGATCC3′

BamHI5′

GpGATCC3′3′

CCTAGG5′3′

CCTAGpG5′３′端突出的粘性末端

5′

GAGCTC3′

SacⅠ5′

GAGCTpC3′3′

CTCGAG5′3′

CpTCGAG5′21异源同裂酶（isoschizomer）

1、定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶

2、特点：1）识别相同顺序

2）切割位点相同

KpnIGGTACC

Asp718GGTACCSstICCGCGG

SacICCGCGG

BamHIGGATCC

BstIGGATCC22

同尾酶（isocaudarner）5’G3’CAGCTTCGAG3’C5’+5’GTCGAG3’3’CAGCTC5’2、特点：1）识别不同顺序

2）切割后的配伍末端相同SalIGTCGACCAGCTGXhoICTCGAGGAGCTC

1、定义：酶的来源不同，识别序列不同，但切割DNA后可产生相同的粘性末端（称为:配伍末端compatibleend）23（四）影响限制酶切割效率的因素

1、底物纯度

2、底物甲基化程度

3、底物结构

4、反应温度

5、反应体系组成24内切酶的缓冲液：

10×Tris-HCl、NaCl、MgCl2pH为7.2-7.6

离子强度分为三个级别低盐（10mmol/LNaCl）中盐（50mmol/LNaCl）高盐（100mmol/LNaCl）25

反应体系和反应终止

10XBuffer1ul

内切酶1ulDNA样品XuldH2Oto10ul26（五）限制酶的用途

1、DNA重组（基因克隆及亚克隆）

2、DNA限制酶（物理）图谱绘制

3、突变分析（RFLP分析）

DNA限制性片段长度多态性分析

4、限制酶的部分酶切与完全酶切

5、DNA杂交与序列分析27

二、DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol)

指以dNTP为底物，催化dNTP聚合生成DNA

的一类酶。

281、大肠杆菌DNA聚合酶I

（E.coliDNApolymeraseI，全酶）

分子量为109kD，具有三种活性的多功能酶

5’→3’聚合酶活性

3’→5’外切酶活性

5’→3’外切酶活性用途(1)用切口平移方法标记DNA探针

(2)合成第二条cDNA(3)DNA测序29大肠杆菌聚合酶I的3种酶活性：1．5’→3’DNA聚合酶的活性

302．3’→5’外切酶活性313．5’→3’外切酶活性32

是由大肠杆菌聚合酶I全酶，经枯草杆菌蛋白酶（或木瓜蛋白酶）处理之后,产生出分子量为76kD的大片段分子,又称Klenow聚合酶。2、Klenow片段（大肠杆菌DNA聚合酶I大片段）33323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸（76kD）DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ

Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

34

作用：5’→3’聚合酶活性

3’→5’外切酶活性

用途：（1）标记DNA片段的3’末端（2）在cDNA克隆中，用于cDNA第二链的合成（3）DNA序列测定

353、TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase)

特点：耐热的DNA聚合酶，最佳作用温度75-80C。具有5’3’聚合酶和5’3’外切酶活性，缺乏3’5’

外切酶活性，因而无校正阅读功能。用途：（1）PCR

（2）DNA序列测定364、逆转录酶(ReverseTranscriptase,RTase)

特点以mRNA作为模板,以dNTP为底物，RNA指导的DNA聚合酶(RDDP，RNA-dependentDNApolymerase

)

种类：禽成髓细胞瘤病毒（AMV）

Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV)

用途：（1）逆转录合成cDNA

（2）补平或标记5’粘端（3）DNA测序（4）制备探针3738(二)DNA连接酶(DNAligase)

作用：催化两个相邻DNA片段的3’-OH与5’–

磷酸基之间形成3’，5’磷酸二酯键。种类：T4DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶39HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’4041(三)修饰酶

T4多核苷酸激酶

(T4polynucleotidekinase)

碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）末端转移酶(terminaltransferase)

甲基化酶42

T4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)

催化将ATP的γ-磷酸转移到DNA链的

5’-末端。用途：（1）放射性标记DNA链的5’-末端，用于DNA

测序或探针制备。（2）将人工接头和其它没有5’-末端磷酸的

DNA片段磷酸化，用于连接反应。

4344

碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）

作用：催化切除DNA、RNA的5’

磷酸基团种类：BAP

（bacterialalkalinephosphatase）

CIP

（calfintestinealkalinephosphatase）用途：

1.从RNA或DNA上除去5’磷酸，防止酶切后

DNA的自身环化

2.与T4多核苷酸激酶联合，用于放射性标记

DNA链的5’末端。4546

不依赖于模板的DNA聚合酶

——末端转移酶(terminaltransferase)

作用：催化dNTP掺入到DNA的3’-OH端用途：

1.给载体或cDNA加上互补的多聚体尾巴

2.DNA片段的3’末端标记47481.RNase

用于除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。

1.RNaseA除去DNA样品中的RNA分子

2.核酸酶S7

除去蛋白质合成系统中的内源mRNA(四)核酸酶（nuclease）

DNaseRNase2.RNaseH

作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。

493.DNaseI1.特点：内切酶，作用于ssDNA或dsDNA，但无核苷酸序列特异性(随机切割)，产生5’-磷酸脱氧寡核苷酸。2.用途：

1)切口平移法，制备DNA探针

2)制备RNA样品时除去DNA分子

3)基因突变时产生切口

5051ds-DNA结构:切口,缺口,断口缺口(gap)切口(nick)断口(cut)3'HOP5'3'HOP5'52重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性内切核酸酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除5´末端磷酸基53

第二节基因克隆的载体54定义：

携带目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具（一类DNA分子）。载体的本质：

DNA载体（vector）基因克隆的载体55载体的特征：

1.能自主复制

2.具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定

3.适当大小

4.在细胞中拷贝数高

5.有适当的限制性内切酶酶切位点（称多克隆位点，即MCS-multiplecloningsites）56

载体的分类

功能克隆型载体（扩增）表达型载体宿主细胞真核细胞载体(表达/穿梭)

原核细胞载体(克隆/表达)

载体来源质粒载体、病毒载体、噬菌体载体、昆虫载体等

57克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。58常用的载体：

质粒载体（plasmid）噬菌体载体（phage）粘粒载体（cosmid）酵母人工染色体载体病毒载体

逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒昆虫载体

质粒载体是最常用的载体59一、质粒载体（一）质粒的概念、种类

质粒是游离于细菌染色体外的小型双链环状DNA，能自主复制，是赋予细菌的某些特性的辅助性遗传单位。

功能并非细菌生长所必需，但对细菌的某些代谢活动和抗药性的表型具有一定的作用。60分类(按复制机理):

严密型质粒复制与宿主染色体同步;

在细菌中拷贝数低（1-3/cell）

松弛型质粒（常用于基因工程克隆）可在无蛋白质合成和染色体复制停止的情况下继续复制;在细菌中拷贝数高(10-200/cell)

分子生物学中常用的质粒：

松弛型质粒（须经人工改造）61

质粒载体是在天然质粒基础上经人工改造而成的、携带目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

*质粒载体均带有来源于pMB1（或ColE1）的复制子

*不需要质粒编码的功能蛋白*完全依靠宿主提供的酶（二）常用的质粒载体62

1、pBR322

长度：4.36kb

筛选标记：

AmprTetr

筛选方法：双抗生素对照筛选

63优点：1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。2、具有两种抗菌素抗性基因可作为转化子的选择标记。3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000—3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。642、pUC18/pUC19长度:2.69kb筛选标记:

AmprLacZ筛选方法:

抗生素蓝白筛选6566（三）质粒载体的应用质粒载体克隆载体表达载体原核表达载体真核表达载体克隆载体pMD19-TpMD19-T是由pUC19载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3'端添加"T"而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个"A"的特性，所以载体和目的基因可通过末端的T-A互补较好地进行连接，从而提高了载体与PCR产物之间的连接效率。69克隆载体的用途:

1.保存和扩增小于2kb的DNA片段

2.构建cDNA文库

3.用于目的DNA的测序

4.核酸杂交时的探针来源

表达载体的用途:

表达目的基因（基因治疗，目的基因的研究、重组蛋白质的制备等）质粒载体的缺陷：

插入的外源DNA片段较小(<2kb)

拷贝数相对较少70

噬菌体(bacteriophage)是可以感染细菌的病毒,它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴,尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。二、噬菌体载体71

双链噬菌体（λ噬菌体：改造λ噬菌体DNA）gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（替换型，适用基因组克隆）

单链噬菌体（M13：改造M13噬菌体DNA，含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列72（一）λ噬菌体

1、λ噬菌体的生物学特性

基因组特点：

有长12bp的互补粘性末端（cos位点，粘端）

两种生长方式：溶菌性生长（裂解性生长）溶源性生长

73λ噬菌体的生活史74Cos位点（Cohesive-endsite）：

λDNA为线状双链分子，两端各有12个碱基的单链互补粘性末端，通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。这种由粘末端结合形成的双链区段即Cos位点。coscos头、尾attcIcIIIcrocII非必要区溶菌cosDNA合成头部合成尾部合成762.λ噬菌体载体

（1）插入载体(insertvector)<7Kbλgt10、λgt11

cIEcoRIlacZ’EcoRIλgt10λgt1177（2）替换载体(subsitutionorreplacevector)

基因组中有14kb的非必需区，可被外源DNA替换，可达23Kb。非必需区两侧有一对限制性酶切位点

如：EMBL4E,B,SS,B,EEcoRIBamHISalI78三、粘粒载体（cosmid）

粘粒：由质粒和噬菌体的cos粘性末端构建而成（含λ噬菌体cos区域的质粒）。特点：质粒复制起点限制性内切酶位点抗药性基因噬菌体两端的cos位点优点：相对分子质量小，4~6kb

插入能力大，达40~50kb7980四、M13噬菌体

M13噬菌体是单链环状DNA分子，感染细菌后，其基因组DN