Elisa原理及应用解读

会计学1Elisa原理及应用解读内容一.Elisa的发展二.ELISA的定义三.ELISA的原理四.ELISA的基本方法五.ELISA的应用六.ELISA类别七.ELISA的特点八.ELISA实验中使用的仪器第1页/共17页一.Elisa的发展

免疫标记技术免疫荧光技术（IFA）放射免疫测定法（RIA）免疫酶测定法（EIA）酶联免疫吸附试验（ELISA）酶免疫组化法第2页/共17页二.ELISA的定义

是一类常用的免疫酶技术，将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，用酶标记抗原或抗体，使抗原抗体反应在固相表面进行，检测液体中未知抗体或抗原的方法。第3页/共17页三.ELISA的原理

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。第4页/共17页在ELISA方法中有三个必要的试剂：固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）酶反应的底物（显色剂）第5页/共17页酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色360,450

420第6页/共17页四.ELISA的基本方法基本实验流程：微孔板包被抗体加样品(抗原)孵育洗涤加酶联二抗(辣根过氧化物酶)孵育洗涤孵育加终止液(硫酸溶液)加底物(邻苯二胺)显色比色第7页/共17页四.ELISA的基本方法包被抗体的酶标反应板加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去未结合的其他物质加酶标抗体生成抗体-待测抗原-酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行抗原的定性或定量测定第8页/共17页五.ELISA的应用ELISA法在生物医学各领域的应用范围概括为四个方面：免疫酶染色各种细胞内成份的定位研究抗酶抗体的合成显现微量的免疫沉淀反应定量检测体液中抗原或抗体成份

第9页/共17页六.ELISA类别

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法，主要类型有：双抗体夹心法间接法竞争法捕获法亲和素-生物素-ELISA法第10页/共17页双抗体夹心法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，先将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶标二抗结合，形成抗体-待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体原成正比。第11页/共17页间接法

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。第12页/共17页竞争法

当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的抗体结合位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。第13页/共17页七.ELISA的特点：灵敏度高：ELISA测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。由于酶的催化效率很高，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。特异性高：ELISA的特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果