DNA重组技术的基本工具上课用

会计学1DNA重组技术的基本工具上课用苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。普通棉花抗虫棉第1页/共37页提取目的基因基因表达载体的构建目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定第2页/共37页第3页/共37页1.1DNA重组技术的基本工具基本工具：限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA连接酶——“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”第4页/共37页（一）限制性核酸内切酶——“分子手术刀”①来源：主要从原核生物中分离纯化出来。②种类：已从近300种微生物中分离出4000种限制酶。③作用：1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。第5页/共37页磷酸二酯键：第6页/共37页T磷酸二酯键1234512345A第7页/共37页具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，④作用特点：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成⑤限制酶的识别序列：第8页/共37页EcoRI限制酶的切割：黏性末端黏性末端在G与A之间切割

大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。第9页/共37页什么叫黏性末端？

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。第10页/共37页CCCG

GGGGGCCC中轴线SmaI限制酶的切割：CCCG

GGG

GGCCC平末端平末端只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。第11页/共37页产生黏性末端或平末端。⑥限制酶的作用结果：第12页/共37页如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？

会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。思考?第13页/共37页（二）“分子缝合针”——DNA连接酶1、种类：⑴E·coliDNA连接酶⑵T4DNA连接酶2、作用：第14页/共37页

可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键第15页/共37页

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低第16页/共37页③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别第17页/共37页将外源基因送入受体细胞。(三)基因进入受体细胞的载体

——“分子运输车”①载体的作用：质粒λ噬菌体的衍生物动植物病毒等②载体的种类：第18页/共37页1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2.具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3.具有某些标记基因，便于进行筛选。4.对受体细胞无害、容易提取

③作为载体的必要条件：第19页/共37页质粒：

裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。第20页/共37页质粒：能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别。第21页/共37页限制酶DNA解旋酶区别限制性内切酶与DNA解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键将DNA两条链的氢键打开形成两条单链限制酶DNA水解酶区别限制性内切酶与DNA水解酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。第22页/共37页比较：DNA连接酶与DNA聚合酶DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板第23页/共37页相同点：形成磷酸二酯键不同点：1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2）DNA聚合酶需要以一条DNA链为模板；而DNA连接酶不需要模板。不是一回事。第24页/共37页1）不属于质粒被选为基因载体的理由是（）

A、能复制

B、有多个限制酶切点

C、具有标记基因

D、它是环状DNAD练习第25页/共37页2）有关基因工程的叙述中，正确的是（）

A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列

B、质粒是基因工程中唯一的载体

C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与目的基因连接

D、DNA连接酶使黏性末端的碱基之间形成氢键C第26页/共37页3.下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是

A．①②B．②③C．③④D．②④答案：D第27页/共37页４、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是G—A之间的氢键C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中答案：C第28页/共37页５.（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是

A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种

B、重组DNA的形成在细胞内完成

C、目的基因须由运载体导入受体细胞

D、质粒都可作为运载体答案：BD第29页/共37页思考与探究P72、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？

通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。第30页/共37页3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：第31页/共37页1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。第32页/共37页4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？

迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。第33页/共37页DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板第34页/共37页

限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的