生物芯片课件

生物芯片技术及其发展生物芯片的定义生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵(microarray）。生物芯片包括DNA芯片、抗原芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。1998年世界十大科技突破之一。未来十年最具发展潜力的技术。特点高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。自动化：降低成本，保证质量。研究历史1991Affymatrix公司StephenFodor:光刻与光化学技术、多肽和寡聚核苷酸微阵列。DNAChip概念Stanford大学Brown实验室：预先合成，机械手阵列1995Schena等：基因表达谱1996Cheeetal：DNA测序1996Croninetal：突变检测1996Sapolsley&Lipshutz：基因图克隆1996Shalonetal：复杂DNA样本分析1996Shoemakeretal：缺省突变定量表型分析分类（根据应用）基因变异检测芯片疾病检测(如HIV、P53基因、结核杆菌)法医鉴定(如DNA指纹图谱)表达谱芯片肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表达差异)药物筛选(培养细胞药物刺激前后表达差异)发育(同一组织不同发育时期基因表达差异)组织发生(不同组织或器官的基因表达差异)分类（根据工艺和载体）原位合成法：密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸，但特异性较差，寡聚核苷酸合成长度有限，且随长度增加，合成错误率增高。成本较高，设计和制造较烦琐费时。DNA微矩阵法：成本低，易操作，点样密度通常能满足需要。芯片的载体需表面紧质、光滑的固体，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩阵芯片常用玻片为载体。基因芯片的种类ScienceChip：生物分析和诊断。NutriChip：食物分析、转基因、污染检测。LeukoChip：血液分析、病毒分析、HLA分析。AquaChip：水质分析。SecureChip：含DNA的物质鉴定。ChromoChip：基因分析和染色体序列。ProkaryoChip：原核生物、兽医、环保等。生物芯片技术主要环节芯片制备：微点阵样本制备：DNA提纯、扩增、标记杂交：样本与互补模板形成双链检测：共聚焦扫描，双色激光数据处理：定量软件，数据库检索，RNA印迹等。结果

生物芯片分析1、测定过程应包括五个基本步骤：需解决的生物学问题样本制备生物化学反应检测数据分析9、两种或以上平行数据组比较应受到单

个实验所固有特性的限制。

10、绝对比例关系只存在于组合实验的平

行数据组内。

11、平行格式包括内在和外部的整个系统

误差的分析因素。

12、在每个系统模块中采集到该系统所有

变量的四维数据时，才能称为完成生

物系统平行基因分析。

生物芯片技术的12条原则只是一个基本框架。其术语的详细定义和有关理论可参见

芯片制备原位合成法（insitusynthesis):又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适用于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。合成后交联（post-syntheticattachment):利用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸或cDNA样品点在经特殊处理过的玻片或其他材料上。主要用于诊断、检测病原体及其他特殊要求的中、低密度芯片的制备。杂交是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链反应。选择杂交条件时，必须满足检测时的灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因，且能保证每条探针都能与互补模板杂交。合适长度的DNA有利于与探针杂交。温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。最好在封闭循环条件下杂交，杂交炉。样本制备制备高质量样本是困难的但又是极其重要的。制备细胞、组织或整个器官样本应特别小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成分等轻微改变都会使基因表达的结果发生明显变化。用于基因类型分析的样本是DNA，用于表达研究的样本是cDNA。样本制备后应进行标记，通常为酶标记、荧光标记和核素标记。结果分析

芯片与标记的靶DNA或RNA杂交后，或与标记的靶抗原或抗体结合后，可采用下列方法分析处理数据：共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度较低。质谱法：快速、精确，可准确判断是否存在基因突变和精确判断突变基因的序列位置。探针合成较复杂。化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷变化检测等。图象分析复杂的杂交图谱一般需由图象分析软件来完成。分析软件的功能：鉴定每个点阵、最大限度消除本底荧光的干扰、解析多种颜色图象、可标记或排除假阳性、识别和分析对照实验是否成功、可将信号标准化等。图象处理软件必须具备提取基因库和数据库的能力。质量控制实验对照：体外转录从cDNA合成mRNA，参入标本中作为对照。此mRNA不与点阵的核酸杂交。将不同浓度的不同基因参入标本中，可作为标本间标准化的参照。用两种不同吸收光谱的荧光素同时分析两个标本，如果两种荧光强度一致，可排除标本间变异因素。用单一碱基错配的寡核苷酸做对照可排除交叉杂交。

结果有效性的证实在表达矩阵上，有时难于区分极其相似的序列，如基因族成员，亚类或异类的存在。比较两种不同DNA序列表达水平时，有些参数如核苷酸的成分、二级结构的存在和矩阵上DNA的长度都会影响杂交。证实矩阵分析的结果可用RT-PCR(区别基因族成员,比较不同DNA种系表达,证实基因变异或突变和精确测定DNA表达水平)、NorthernBlot(证实某一基因的相对表达水平)、WesternBlot(RNA表达是否达到细胞中的蛋白水平)、质谱仪(证实矩阵结果是否在蛋白水平)等。生物芯片技术的发展发展趋势微型化：DNA矩阵越来越小。集成化：矩阵上的基因组越来越大。多样化：测定范围越来越广。微量化：测定所需样本越来越少。全自动化：样品制备到结果显示全部分析过程。定量化：如激光捕获技术，显微解剖技术等可精确测定一个细胞内的一个基因的表达。DNA矩阵数据信息库的完善。生物芯片技术的发展技术毛细管电泳芯片技术PCR芯片技术(PCR-Chip)缩微芯片实验室(lab-on-a-chip)微珠芯片技术(beadArray)抗体和蛋白质阵列技术(Antibodyandprotein-arraytechnology)自我定制芯片技术（makeyourownchip)血气分析芯片毛细管电泳芯片技术Mathies最早报道毛细管电泳芯片测序结果，在10分钟内完成了对433个碱基序列的测定。宾夕法尼亚大学Wilding等成功地利用毛细管电泳芯片分离了用于诊断杜鑫-贝克肌萎缩的多条DNA片段。瑞士Ciba-Geigy公司和加拿大Alberta大学合作利用玻璃毛细管电泳芯片完成了对寡核苷酸的分离。抗体和蛋白质阵列技术蛋白质组学(protiomics)的兴起，促进了抗体和蛋白质阵列技术的发展。PareickBrown使用特异性抗体微矩阵，测定了细胞和体液样本中数千种不同的蛋白质。Leuking等采用蛋白质微阵列技术，测定了10pg的微量蛋白质，并证实假阳性极低。乳腺癌基因芯片Stanford乳腺癌微矩阵(Perouetal.1999)每种基因的数据以行表示，每个实验用列表示。颜色强度表示对照和实验cDNA的比率。比率相同时为1。结果为红色表示mRNA增加，绿色表示减少，灰白色表示缺乏。两种基因的相似性用Pearson相关公式或Euclidian测距公式计算。DNA微矩阵分析软组织肉瘤表达

KavineMaillardetal(1999)cDNAs进行DNA表达矩阵，PCR产物包被在经赖氨酸处理的玻片上，用Cys3-和Cys5-标记的cDNA进行杂交，洗涤后用Scanarray3000扫描仪测定矩阵，表达数据储存在ACeDB数据库中，根据数据表达类型区分不同的基因。微矩阵分析DNA和蛋白表达

HolgerEickhoffetal.(1999)根据已有的序列数据，组合800000人类EST序列，已重矩阵了38000克隆用于RNA表达分析，克隆经PCR扩增后共价结合于玻片上，每张玻片固定19200个基因片段，标记人组织RNAs与被选的38000人基因片段的矩阵进行杂交，比较健康与疾病组织的图象，用软件分析点识别和点定量。使用寡聚核苷酸鉴定新的cDNA克隆，和进入表达载体，使相应蛋白能直接表达，矩阵后可分析蛋白-蛋白和蛋白-DNA的关系。生物芯片相关仪器点阵仪：制备芯片。点样针分为实心和空心两种，点样方式有非接触喷点和接触点样两种。杂交仪：全自动完成调节、加探针、漂洗和热循环的杂交过程。扫描仪：激光共聚焦或CCD直接成像分析结果。微矩阵仪器介绍QBotQPixQArrayQPetQSoft2000QBot超高解析基因筛选暨排列分析仪。基因菌落筛选(ColonyPicking)：3500/h基因排列打点(Gridding)：100000/h基因复制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正确的基因置复制盘基因微矩阵排列(Micro-Arraying)：20000/片全自动液体分注系统(LiquidHandling):96针，注液量1200l，适合PCR产物。分析软件：分析、质控、上网。环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板QPix半敞开式基因筛选暨排列分析仪(经济型)基因菌落筛选(ColonyPicking)：3500/h基因排列打点(Gridding)：100000/h基因复制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正确的基因置复制盘基因微矩阵排列(Micro-Arraying)：20000/片分析软件：分析、质控、上网环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板QArray第三代半敞开式基因微矩阵排列仪。基因微矩阵排列(Microarrying)：同时处理84片玻片，每一打点玻片分4个区域，可安排不同的矩阵排列。可选