食品安全课件

第十章维生素的测定海南大学食品学院第一节概述

维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。人体如从膳食中摄入维生素的量不足或者机体由于某种原因吸收或合成发生障碍时，就会引起各种维生素缺乏症。近几年已经查明仅有少数几种维生素可以在体内合成，大多数维生素都必须由食物供给。维生素的分类1、脂溶性维生素：能溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂类共存的一类维生素，包括A、D、E、K，其共同特点是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排除，大剂量摄入时可能引起中毒。由于可储藏在脂肪中，故不需每天供给。2、水溶性维生素：能溶于水，包括B族、C，其共同特点是一般只存在于植物性食品中，满足组织需要后都能从机体排出，需要每天供给。测定食品中维生素的含量的意义评价食品的营养价值；寻找富含维生素的食品资源；指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症或维生素中毒；研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导人们制定合理的工艺及贮存条件；监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而引起维生素中毒。第二节脂溶性维生素的测定VA、VD、VE、VK与类脂物一起存于食物中。脂溶性维生素具有以下理化性质：

1、溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。

2、耐酸碱性：VA、VD对酸不稳定，对碱稳定，VE对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。

3、耐热性、耐氧化性：耐热性好，VA易被氧化，光和热促进其氧化；VE易被氧化，对可见光稳定但易被紫外光氧化；VK易被光、氧化剂及醇氧化。根据上述性质．测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品水洗去除类脂物有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物)浓缩溶于适当的溶剂测定。在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。

一、维生素A的测定

维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。GB/T5009.82—2003中第一法高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的方法，此法能快速分离、同时测定维生素A和维生素E。最小检出量分别为VA：0.8ng；α-E：91.8ng；γ-E：36.6ng；δ-E：20.6ng。（一）高效液相色谱法测定食物中VA、VE1、原理食物中的维生素A及维生素E经皂化提取以后，将其从不可皂化的部分提取到有机溶剂中。用HPLC法测定维生素A及维生素E的含量。

2、分析步骤皂化→提取→洗涤→萃取→浓缩→溶解→离心→测定→结果计算（1）皂化

称取1－10g样品（含维生素A约3μg)于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加50mL10％抗坏血酸，苯并[e]芘标准液2.00mL，混匀。加10mL(1+1)氢氧化钾，混匀。于沸水浴上回馏30min使皂化完全。皂化后立即于水中冷却。（2）提提取取将皂皂化化后后的的样样品品移移入入分分液液漏漏斗斗中中，，用用50mL水分分2－3次洗洗皂皂化化瓶瓶，，洗洗液液并并入入分分液液漏漏斗斗中中。。用用约约100mL乙醚醚分分两两次次洗洗皂皂化化瓶瓶及及其其残残渣渣，，乙乙醚醚液液并并入入分分液液漏漏斗斗中中。。如如有有残残渣渣，，可可将将此此液液通通过过有有少少许许脱脱脂脂棉棉的的漏漏斗斗滤滤入入分分液液漏漏斗斗。。轻轻轻轻振振摇摇分分液液漏漏斗斗2min，静静置置分分层层，，弃弃去去水水层层。。（3）洗洗涤涤用约约50mL水洗洗分分液液漏漏斗斗中中的的乙乙醚醚层层，，水水洗洗至至水水层层不不显显碱碱性性，，（（最最初初水水洗洗轻轻摇摇，，逐逐次次振振摇摇强强度度可可增增加加））。。（4）浓缩将乙醚提提取液经经过无水水硫酸钠钠（约5g）滤入与与球形蒸蒸发瓶内内，用约约10mL乙醚冲洗洗分液漏漏斗及无无水硫酸酸钠3次，入蒸蒸发瓶内内，并将将其接至至旋转蒸蒸发器上上，于55°C水浴中减减压蒸馏馏并回收收乙醚，，待瓶中中剩下约约2mL乙醚时，，取下蒸蒸发瓶，，立即用用氮气吹吹掉乙醚醚。加入入2.00mL乙醇，充充分混合合，溶解解提取物物。将乙乙醇液移移入一小小塑料离离心管中中，离心心5min（5000rpm)。上清液液供色谱谱分析。。（5）标准曲曲线的制制备将维生素素A和维生素素E标准品配配置成标标准溶液液（约1mg/mL），制备备标准曲曲线前用用紫外分分光光度度法标定定其准确确浓度。。标准浓度度的标定定方法：：取维生生素A和维生素素E标准液若若干微升升，分别别稀释至至10.00mL乙醇中，，并分别别按给定定波长测测定各维维生素的的吸光值值。用比比吸光系系数计算算该维生生素的浓浓度。绘制标准准曲线：：标准和和内标物物进行色色谱分析析，以维维生素A峰面积与与内标物物峰面积积之比为为纵坐标标，维生生素A浓度为横横坐标绘绘制标准准曲线。。（6）高效液液相色谱谱分析预柱:ultrasphereODS10μm,4mm××4.5cm分析柱:ultrasphereODS5μμm,4.6mm××25cm流动相:甲醇:水＝98:2混匀,于临用前前脱气紫外检测测器波长长：300nm进样量：：20μL流速：1.7mL/min（7）注意事事项维生素A极易被破破坏，实实验操作作应在微微弱光线线下进行行，或用用棕色玻玻璃仪器器。在皂化过过程中，，应每5分钟摇一一下皂化化瓶，使使样品皂皂化完全全提取过程程中，振振摇不应应太剧烈烈，避免免溶液乳乳化而不不易分层层。洗涤时，，最初水水洗轻摇摇，逐次次振摇强强度可增增加。无水硫酸酸钠如有有结块，，应烘干干后使用用。在旋转蒸蒸发时乙乙醚溶液液不应蒸蒸干，以以免被测测样品含含量损失失。用高纯氮氮吹干时时，氮气气不能开开的太大大，避免免样品吹吹出瓶外外结果偏偏低。GB/T5009.82——2003中第二法法原理：在在氯仿溶溶液中，，VA与三氯化化锑可生生成蓝色色可溶性性络合物物，在620nm波长处有有最大吸吸收峰，，其吸光光度与VA的含量在在一定的的范围内内成正比比，故可可比色测测定。适用范围围及特点点：本法法适用于于维生素素A含量较高的的各种样品品(高于5—10μμg／g)，对低含量量样品，因因受其他脂脂溶性物质质的干扰．．不易比色色测定：主要缺点：：生成的蓝蓝色络合物物的稳定性性差。比色色测定必须须在6秒钟内完成成，否则蓝蓝色会迅速速消退，将将造成极大大误差。（二）比色色法测定VA的含量注意：维生素A见光易分解解，整个实实验应在暗暗处进行，，防止阳光光照射，或或采用棕色色玻璃避光光。三氯化锑腐腐蚀性强，，不能沾在在手上，三三氯化锑遇遇水生成白白色沉淀．．因此用过过的仪器要要先用稀盐盐酸浸泡后后再清洗。。二、β—胡萝卜素的的测定（GB/T5009.83——2003）第一方法法是HPLC；第二方法法为纸层析析法。胡萝卜素是是一种广泛泛存在于有有色蔬菜和和水果中的的天然色素素，有多种种异构体和和衍生物，，总称为类类胡萝卜素素，其中在在分子结构构中含有β一紫罗宁残残基的类胡胡萝卜素，，在人体内内可转变为为维生素A，故称为维维生素A原。如α、β、γ胡萝卜素，，其中以β—胡萝卜素效效价最高。。胡萝卜素原原只存在于于植物性食食品中，但但以胡萝卜卜为食物的的家禽、兽兽类、水产产动物及其其加工产品品，以及为为着色而添添加胡萝卜卜素的食品品也含有胡胡萝卜素。。β—胡萝卜素的的结构如下下：胡萝卜素对对热及酸、、碱比较稳稳定，但紫紫外线和空空气中的氧氧可促进其其氧化破坏坏。因系脂脂镕性维生生素，故可可用有机溶溶剂从食物物中提取。。胡萝卜素本本身是一种种色素，在在450nm波长处有最最大吸收，，故只要能能完全分离离，便可定定性和定量量。在植物体内内，胡萝卜卜素经常与与叶绿素、、叶黄素等等共存，在在提取β一胡萝卜素素时，必须须将胡萝卜卜素与其它它色素分开开。常用的的方法有纸纸层析、柱柱层析和薄薄层层析法法。净化用层析析介质采用用氧化镁、、氧化铝避光三、维生素素D的测定维生素D为固醇类衍生物，，具抗佝偻病作用，其中中最重要的的是D2和D3。植物不含含维生素D，但维生素素D原在动、植植物体内都都存在。植植物中的麦麦角醇为维维生素D2原，经紫外外照射后可可转变为维维生素D2，又名麦角角钙化醇；；人和动物物皮下含的的7-脱氢胆固醇醇为维生素素D3原，在紫外外照射后转转变成维生生素D3，又名胆钙钙化醇。以D3为最重要。。维生素D2药片吃多了了中毒。分析方法中中较好的是是比色法和和高效液相相色谱法。。是AOAC选定的正式式方法。维生素D的结构原理在三氯甲烷溶溶液中，维生生素D与三氯化锑结结合生成一种种黄色化合物物，呈色强度度与维生素D含量呈正比。。食品中维生素素D含量较低，其其他维生素严严重干扰其测测定，因此测测定前必须经经柱层析除去去干扰成分。。层析介质为为硅藻土、中中性氧化铝此法测定的是是维生素D2和维生素D3的总量（一）三氯化化锑比色法（二）液相色色谱法灵敏度较比色色法高30倍以上，且操操作简便，精精度高，分析析速度快。是是目前分析维维生素D的最好方法。。试样经皂化后后，用苯提取取不皂化物，，蒸馏除苯，，先采用反相相C18柱分取维生素素D，除去大部分分杂质。进一一步采用正相相色谱分离，，紫外检测定定量。反相色谱条件件色谱柱：NucleosilC18,7.5mm*300mm流动相：乙腈腈＋甲醇（1＋1）流速：2.0mL/min紫外检测波长长：254nm正相色谱条件件色谱柱：正相相柱ZorbaxSIL,4.5mm*250mm流动相：0.4%异丙酮的己烷烷溶液流速：1.6mL/min紫外检测波长长：254nm注意事项1、VD2与VD3分不开2、皂化时加入入焦性没食子子酸作为抗氧氧化剂2、标样与试样样在同样条件件下皂化，消消除了VD的热异异性化损失。。3、也可用硅藻藻土及皂土柱柱层析，除去去甾醇、VA、胡萝卜素的的干扰。第三三节节水水溶溶性性维维生生素素的的测测定定水溶溶性性维维生生素素B1、B2和C，广广泛泛存存在在于于动动植植物物组组织织中中，，饮饮食食来来源源充充足足。。但但是是由由于于它它们们本本身身的的水水溶溶性性质质，，除除满满足足人人体体生生理理、、生生化化作作用用外外，，任任何何多多余余量量都都会会从从小小便便中中排排出出。。为为避避免免耗耗尽尽，，需需要要经经常常由由饮饮食食来来提提供供。。水溶性维维生素都都易溶于于水，而而不溶于于苯、乙乙醚、氯氯仿等大大多数有有机溶剂剂。在酸酸性介质质中很稳稳定，既既使加热热也不破破坏；但但在碱性性介质中中不稳定定，易于于分解，，特别在在碱性条条件下加加热，可可大部分分或全部部破坏。。它们易易受空气气、光、、热、酶酶、金属属离子等等的影响响；维生素B2对光，特特别是紫紫外线敏敏感，易易被光线线破坏坏；维生生素C对氧、铜铜离子敏敏感，易易被氧化化。根据上述述性质，，测定水水溶性维维生素时时，一般般都在酸酸性溶液液中进行行前处理理。维生素Bl、B2盐酸水解解酶酶解解提取纯纯化化维生素C通常采用用草酸、、草酸—醋酸、偏偏磷酸—醋酸溶液液直接提提取。在在一定浓浓度的酸酸性介质质中，可可以消除除某些还还原性杂杂质对维维生素C的破坏作作用。草草酸价廉廉，使用用方便，，对维生生素C有很好淀粉酶木瓜蛋白酶活性人造浮石硅镁吸附剂一、维生生素B1的测定维生素B1又名硫胺胺素、抗抗神经炎炎素，通通常以游游离态，，或以焦焦磷酸酯酯形式存存在于自自然界。。在酵母母、米糠糠、麦胚胚、花生生、黄豆豆以及绿绿色蔬菜菜和牛乳乳、蛋黄黄中含量量较为丰丰富。分析方法法：GB/T5009.84——2003中唯一的的方法是是荧光计计法此法检出出限0.05μg1、原理硫胺素在在碱性铁铁氰化钾钾溶液中中被氧化化成硫色色素（噻噻嘧色素素），在在紫外线线下，硫硫色素发发出荧光光。在给给定的条条件下，，以及没没有其他他物质干干扰时，，此荧光光强度与与硫色素素量成正正比，即即与溶液液中硫胺胺素量成成正比。。从而测测定其含含量。2、分析步步骤制样→水水解→净净化→氧氧化→干干燥→测测定→结结果计算算（1）提取精确称取取一定量量试样5－20g（硫胺素素含量约约为10－30ug）置于100mL三角瓶中中，加入入50－75mL0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其其溶解，，瓶口加加盖小烧烧杯后放放入高压压锅中加加热水解解10.3×104Pa30min,凉后取出出。用2mol/L乙酸钠调调其pH值为4.5（以0.04%溴甲酚绿绿为指示示剂）按每克试试样加入入20mg淀粉酶的的比例加加入淀粉粉酶。于于45－50℃℃温箱过过夜保保温（（约16h）。冷至室室温，，定容容至100mL，然后后混匀匀过滤滤，即即为提提取液液（2）净化化用少许许脱脂脂棉铺铺于层层析柱柱的底底部，，加水水将棉棉纤维维中气气泡排排出，，再加加约1g活性人人造沸沸石使使之达达到交交换柱柱的三三分之之一高高度。。保持持层析析柱中中液面面始终终高于于活性性人造造沸石石。用移液管加加入提取液液20－80mL（使通过活活性人造沸沸石的硫胺胺素总量约约为2－5μg）加入约10mL热水冲洗交交换柱，弃弃去洗液。。如此重重复三次。。加入25％酸性氯化化钾（温度度为90℃左右）20mL，收集此液液于25mL刻度试管内内，冷至室室温，用25％酸性氯化化钾定容至至25mL,即为试样净净化液。将20mL硫胺素标准准使用液加加入交换柱柱以代替样样品提取液液，即得到到标准净化化液。（3）氧化将5mL试样净化液液分别加入入A、B两个反应瓶瓶。在避光暗环环境中将3mL15%氢氧化钠加加入反应瓶瓶A，振摇约15s，然后加入入10mL正丁醇；将将3mL碱性铁氰化化钾溶液加加入反应瓶瓶B,振摇约15s，然后加入入10mL正丁醇；将将A、B两个反应瓶瓶同时用力力振摇，准准确计时1.5min。重复1－2，用标准净净化液代替替试样净化化液。用黑布遮盖盖A、B反应应瓶瓶，，静静置置分分层层后后下下层层碱碱性性溶溶液液，，加加入入2－3g无水水硫硫酸酸钠钠使使溶溶液液脱脱水水。。（4）荧荧光光强强度度的的测测定定荧光光测测定定条条件件：：激发发波波长长365nm；狭狭缝缝5nm.发射射波波长长435nm；狭缝5nm.依次测定下列列荧光强度：：试样空白荧光光强度（试样样反应瓶A）；标准空白荧光光强度（标准准反应瓶A）；试样荧光强度度（试样反应应瓶B）；标准荧光强度度（标准反应应瓶B）。二、维生素B2的测定维生素B2即核核黄黄素素，，在在食食品品中中以以游游离离形形式式或或磷磷酸酸酯酯等等结结合合形形式式存存在在。。膳膳食食中中的的主主要要来来源源是是各各种种动动物物性性食食品品，，其其中中以以肝肝、、肾肾、、心心、、蛋蛋、、奶奶含含量量最最多多，，其其次次是是植植物物性性食食品品的的豆豆类类和和新新鲜鲜绿绿叶叶蔬蔬菜菜。。分析方法法：GB/T5009.85——2003中第一法法为荧光光法；第第二法为为微生物物法。1、原理核黄素在在440-500nm波长光照照射下发发生黄绿绿色荧光光，在稀稀溶液中中，荧光光强度与与核黄素素浓度成成正比。。在波长长525nm下测定其其荧光强强度。试试液再加加入低亚亚硫酸钠钠(Na2S2O4),将核黄素素还原成成无荧光光的物质质，然后后再测定定试液中中残余荧荧光杂质质的荧光光强度，，两者之之差即为为食品中中核黄素素所产生生的荧光光强度。。2、操作步步骤样品均制制→水解解→过滤滤定容→→氧化去去杂质→→净化→→测定→→结果计计算（1）水解:称取2-10g样品（约约含10-200ug核黄素））于100ml三角瓶中中，加入入50mL0.1mol/L盐酸，搅搅拌直至至颗粒分分散均匀匀。用40mL瓷坩埚为为盖扣住住瓶口,置于高压压锅内高高压水解解，10.3X104Pa(15lb/in2)30min。水解液液冷却后后，滴加加1mol/L氢氧化钠钠，取少少许水解解液，用用0.04%溴甲酚绿绿检验呈呈草绿（（pH为4.5）（2）酶解:含有淀粉粉的水解解液：加加入3ml10%淀粉酶溶溶液,于37-40℃保温16h。含高蛋蛋白的水水解液：：加入3ml10%木瓜蛋白白酶溶液液,于37-40℃保温16h。过滤上上述酶解解液定容容至100mL,用干滤纸纸过滤。。此提取取液在4°C冰箱中保保存一周周。（3）氧化去去杂质视样品中中核黄素素的含量量取一定定体积的的样品提提取液及及核黄素素标准使使用液（（约含1-10ug核黄素））分别于于20mL的带刻度度试管中中，加水水至15mL。各管加加0.5mL冰乙酸，，混匀。。加3%高锰酸钾钾溶液5mL，混匀，，放置2min，使氧化化去杂质质。滴加加3%双氧水溶溶液数滴滴，直到到高锰酸酸钾颜色色褪掉。。剧烈震震摇此管管，使多多余的氧氧气逸出出。（4）核黄素素的吸附附与洗脱脱核黄素吸吸附柱：：硅镁吸附附剂约1g用湿法装装入柱，，占柱长长1/2-2/3（约5cm）为宜（（吸附柱柱下端用用一团脱脱脂棉垫垫上），，勿使柱柱内产生生气泡，，调节流流速为60滴/min。过柱与洗洗脱：将全部氧氧化后的的央液及及标准液液通过吸吸附柱后后，用约约20mL的热水洗洗去样液液中的杂杂质，然然后用5.0mL洗脱液（（丙酮：：冰乙酸酸：水＝＝5：2：9）将样品品中核黄黄素洗脱脱并收集集于一带带盖10mL刻度试管管中，再再用水洗洗吸附柱柱，收集集洗出液液并定容容至10mL，混匀后后待测荧荧光。（5）测定于激发波波长440nm，发射波波长525nm，测量样样品管及及标准管管的荧光光值。待测品及及标准的的荧光值值测定后后，在各各管的剩剩余液（（约5-7mL）中加0.1mL20%次亚硫酸酸钠溶液液，立即即混匀，，在20s内测出各各管的荧荧光值，，作为各各自的空空白值（6）计算X=(A-B/C-D)××S/m×f××100/1000式中：X———样品中含含核黄素素的量,mg/100gA———样品管荧荧光值B———样品管空空白荧光光值C———标准管荧荧光值D———标准管空空白管荧荧光值f———稀释倍数数m———样品的质质量，gS———标准管中中核黄素素的含量量,μg100/1000———将样品中中核黄素素量由μg/g折算mg/100g的折算系系数三、维生生素C的测定维生素C是一种己己糖醛基基酸，有有抗坏血血病的作作用，所所以又称称作抗坏坏血酸。。维生素素C广泛存在在于植物物组织中中，新鲜鲜的水果果、蔬菜菜，特别别是枣、、辣椒、、苦瓜、、柿子叶叶、猕猴猴桃、柑柑桔等食食品中含含量尤丰丰富。维生素C具有较强强的还原原性，对对光敏感感，氧化化后的产产物称为为脱氢抗抗坏血酸酸，仍然然具有生生理活性性。进一一步水解解则生成成2，3-二酮古乐乐糖酸，，失去生生理作用用。根据它具具有的还还原性质质可以测测定维生生素C的含量。。常用的的测定方方法有：：（1）2，6-二氯靛酚酚法（（还原原型VC）（2）2，4-二硝基苯苯肼法（（总总VC）（3）碘酸法法（4）碘量法（5）荧光分光光光度法（一）2，6—二氯靛酚滴定定法1、原理还原型抗坏血血酸可以还原原染料2，6-二氯靛酚。该该染料在酸性性溶液中呈粉粉红色(在中性或碱性性溶液中呈蓝蓝色)，被还原后颜颜色消失。还原型抗坏血血酸还原染料料后，本身被被氧化成脱氢氢抗坏血酸。。在没有杂质质干扰时，一一定量的样品品提取液还原原标准染料液液的量，与样样品中抗坏血血酸含量成正正比。2、试剂1%草酸酸溶溶液液：：称称取取10g草酸酸，，加加水水至至1000mL；2%草酸酸溶溶液液：：称称20g草酸酸，，加加水水至至1000mL；维生生素素C标准准液液：：准准确确称称20mgVC溶于于1%草酸酸中中，，并并稀稀释释至至100mL，吸吸5mL于50mL容量量瓶瓶中中，，加加入入1%草酸酸至至刻刻度度，，此此溶溶液液每每毫毫升升含含有有0.02mgVC；0.02%2，6-二氯氯靛靛酚酚溶溶液液：：称称取取2，6-二氯氯靛靛酚酚50mg，溶溶于于200mL含有有52mg碳酸酸氢氢钠钠的的热热水水中中，，冷冷却却后后，，稀稀释释至至250mL，过过滤滤于于棕棕色色瓶瓶中中，，贮贮存存于于冰冰箱箱内内，，应应用用过过程程中中每每星星期期标标定定一一次次。。3、样样品品测测定定提取取：：称称样样50g→→加2%草酸酸100mL→→入捣捣碎碎机机中中处处理理→→过过滤滤→→颜颜色色若若深深可可加加白白陶陶土土滴定定：：吸吸5mL样液液→→于于三三角角瓶瓶→→用用染染料料滴滴定定至至粉粉红红色色→→15秒内内不不褪褪色色计算算：：VC（mg/100g）=（V××T）/W××100V-消耗耗染染料料体体积积（（mL）T-1mL染料料所所能能氧氧化化维维生生素素C的毫毫克克数数W-滴定定时时所所有有滤滤液液中中含含有有样样品品的的克克数数4、注意意事项项所有试试剂的的配制