仪器分析选论酶免疫分析技术

仪器分析选论酶免疫分析技术第一页，共三十五页，2022年，8月28日2酶免疫技术的分类克隆酶供体免疫测定酶免疫分析技术酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术均相酶免疫测定异相酶免疫测定酶放大免疫测定技术液相酶免疫测定固相酶免疫测定：酶联免疫吸附试验(ELISA)组织切片或其它标本中抗原的定位分析

液体标本中抗原或抗体的定性和定量第二页，共三十五页，2022年，8月28日一、均相酶免疫测定法

酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。Ag+

Ab-EAgAb-E+Ab-E

（以标记Ab检测Ag为例）第三页，共三十五页，2022年，8月28日一、均相酶免疫测定法

基本原理酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，其中的酶活性将发生改变。

因此，不需对反应液中结合和游离的酶标记物进行分离，直接测定反应系统中总酶活性的变化即可推算出被测样品中抗原的含量。Ag+

Ab-EAgAb-E+Ab-E

（以标记Ab检测Ag为例）第四页，共三十五页，2022年，8月28日二、非均相酶免疫测定法基本原理：抗原抗体反应平衡后，需采用适当的方法分离游离的和结合的酶标记物，然后对经酶催化的底物显色程度进行测定，再推算待测样品中抗原（或抗体）的含量。依据测定方法又可分为液相和固相酶免疫测定。目前临床上多用固相酶免疫测定法。Ag+

Ab-EAgAb-E+Ab-E

（以标记Ab检测Ag为例）第五页，共三十五页，2022年，8月28日酶联免疫吸附试验（ELISA）一、基本原理底物显色定性或定量的分析包被将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234第六页，共三十五页，2022年，8月28日方法类型及反应原理（一）检测抗原的方法

将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。1.双抗体夹心法第七页，共三十五页，2022年，8月28日E固相抗体标本（含抗原）酶标抗体EE底物双抗体夹心法检测抗原适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原第八页，共三十五页，2022年，8月28日（1）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）加待检标本,温育，洗涤。（3）加酶标抗体，洗涤。（4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。2．技术要点E固相抗体标本（含抗原）酶标抗体EE底物第九页，共三十五页，2022年，8月28日（+）1、已知抗体包被载体3、加酶标抗体4、加酶作用的底物显色2、加待检抗原4、加酶作用的底物不显色洗涤洗涤洗涤洗涤1、已知抗体包被载体2、加待检物（无抗原）3、加酶标抗体（-）YYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYEYEYEYYYY洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原第十页，共三十五页，2022年，8月28日2.双位点一步法检测抗原

即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。第十一页，共三十五页，2022年，8月28日EEE底物固相抗体标本（含抗原）酶标抗体双位点一步法检测抗原在包被时使用一种单抗，酶标记时使用一种单抗第十二页，共三十五页，2022年，8月28日3.加酶作用的底物显色2.加待检抗原和酶标抗体洗涤1.已知抗体包被载体YYYYEYYEYYYEYYEYY（+）3.加酶作用的底物不显色2.加待检物（无抗原）和酶标抗体洗涤1.已知抗体包被载体YYYYEYYEYY（-）YYY洗涤洗涤双位点一步法测抗原第十三页，共三十五页，2022年，8月28日

如果待检标本中抗原浓度过高，容易形成“钩状效应（hookeffect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。注意事项EE底物固相抗体标本（抗原浓度高）酶标抗体E第十四页，共三十五页，2022年，8月28日3.竞争法检测抗原

酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈反比。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。

第十五页，共三十五页，2022年，8月28日酶标抗原EEEE固相抗体标本（含抗原）底物E竞争法检测抗原第十六页，共三十五页，2022年，8月28日（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。（3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。技术要点第十七页，共三十五页，2022年，8月28日3.加酶作用的底物显色2.加待检抗原和酶标抗原洗涤1.已知抗体包被载体YYYYYY（+）EYYYE3.加酶作用的底物显色2.加待检物（无抗原）和酶标抗原洗涤1.已知抗体包被于载体表面YYYYYY（-）EYYYEEEEEEE洗涤洗涤竞争法测抗原第十八页，共三十五页，2022年，8月28日（二）检测抗体的方法

将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。1.间接法第十九页，共三十五页，2022年，8月28日

固相抗原标本（含抗体）酶标二抗底物EEE间接法检测抗体酶标二抗是针对一类免疫球蛋白(如抗人IgG），因此该法只需要变换固相抗原，即可用一种酶标二抗测各种与抗原相应的抗体，具有更广的通用性第二十页，共三十五页，2022年，8月28日4.加酶作用的底物显色2.加待检抗体洗涤1.已知抗原包被载体（+）YYY3.加酶标二抗洗涤YYYYEYEYEYYYYEYEYE4.加酶作用的底物不显色2.加待检物（无抗体）洗涤1.已知抗原包被载体（-）3.加酶标二抗洗涤YEYEYE洗涤洗涤间接法测抗体第二十一页，共三十五页，2022年，8月28日2.双抗原夹心法

将已知抗原包被固相载体，待检标本中的相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。同双抗体夹心法。技术要点第二十二页，共三十五页，2022年，8月28日E固相抗体标本（含抗体）酶标抗原底物EE双抗原夹心法检测抗体第二十三页，共三十五页，2022年，8月28日4.加酶作用的底物不显色（+）（-）4.加酶作用的底物显色2.加待检抗体洗涤1.已知抗原包被载体3.加酶标抗原洗涤YEYYYYEYEYEYEYE2.加待检物（无抗体）洗涤1.已知抗原包被载体3.加酶标抗原洗涤EEE洗涤洗涤双抗原夹心法测抗体第二十四页，共三十五页，2022年，8月28日3.竞争法检测抗体同竞争法结合抗原。HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。1．原理第二十五页，共三十五页，2022年，8月28日（1）竞争法检测HBcAb：①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。2．技术要点第二十六页，共三十五页，2022年，8月28日固相抗原标本（含抗体）底物酶标抗体EEEEE竞争法检测HBcAb第二十七页，共三十五页，2022年，8月28日3.加酶作用的底物显色3.加酶作用的底物显色2.加待检抗体和酶标抗体洗涤1.已知HBcAg包被载体（+）YYYEYYYE2.加待检物（无抗体）和酶标抗体洗涤1.已知HBcAg包被载体（-）YYYEYYYEEEEEYE洗涤洗涤竞争法检测HBcAb第二十八页，共三十五页，2022年，8月28日（2）竞争法检测HBeAb：①将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。②加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。③加入酶标HBeAb，温育，洗涤。④加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。第二十九页，共三十五页，2022年，8月28日固相抗体标本（含抗体）抗原酶标抗体底物EEE竞争法检测HBeAb第三十页，共三十五页，2022年，8月28日（+）（-）4.加酶作用的底物显色2.加待检抗体和HBeAg洗涤1.已知HBeAb包被载体YYYYYYYYYYYYY3.加酶标HBeAb洗涤YEYEYYYYYYE4.加酶作用的底物显色2.加待检物（无抗体）和HBeAg洗涤1.已知HBeAb包被载体YYYYYYYYY3.加酶标HBeAb洗涤YEYEYYYYEYEYEYE洗涤洗涤竞争法检测HBeAb第三十一页，共三十五页，2022年，8月28日方法评价ELISA具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、实验设备要求简单、应用范围广泛、无反射性同位素污染等优点。发展最快、应用最广，普及。

第三十二页，共三十五页，2022年，8月28日1．病原体及其抗体测定广泛应用于传染病的诊断。2．蛋白质测定各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。3．药物和毒品测定如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。酶免疫测定的应用第三十三页，共三十五页，2022年，8月28日酶增强免疫测定技术EMIT将半抗原（或小分子抗原）与酶结合成酶