血浆白蛋白分离实验报告

血浆白蛋白分离实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称血浆白蛋白分离实验报告实验日期2018-12-27实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5.了解柱层析技术二、实验原理蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。三、材料与方法：以流程图示意材料：人混合血清、葡聚糖凝胶G-25(SephadexG-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)、纤维素离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、各不同浓度的醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸溶液、1%BaCl2溶液器材：层析柱、电泳仪、电泳槽等操作方法：取血清0.8ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白）约0.8ml过葡聚糖凝胶G-25层析柱（加样）过葡聚糖凝胶G-25层析柱（加样）（1.0╳7cm）（1.0╳7cm）用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁，继续用0.02mol/LPH6.5层析柱内壁，继续用0.02mol/LPH6.5NH4AC缓冲液（2ml）洗脱，流出液NH4AC缓冲液（2ml）洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白量约1ml时开始检测蛋白磺基水杨酸检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液12滴收集含有蛋白质的峰液12滴继续用0.02mol/LNH4AC缓冲液洗涤继续用0.02mol/LNH4AC缓冲液洗涤BaCl2检测至SO4-阴BaCl2检测至SO4-阴用2-3ml0.02mol/LNH4AC用2-3ml0.02mol/LNH4AC缓冲液再生平衡缓冲液再生平衡过DEAE-纤维素层析柱（1.0╳6cm）过DEAE-纤维素层析柱（1.0╳6cm）用1ml0.02molNH4AC缓冲液清洗用1ml0.06mol/LNH4AC缓冲液清层析柱内壁，继续用0.02mol/LpH6.5洗层析柱内壁，用约5ml0.06mol/LNH4AC缓冲液（3ml）洗脱，流出液量NH4AC缓冲液流洗，除去α球蛋白和约1ml开始检测蛋白质.β球蛋白磺基水杨酸检测蛋白质用0.3mol/LNH4AC缓冲液（约3ml）洗脱，流出液量约2ml开始检测蛋白质收集含有蛋白质的洗脱液每管10滴，磺基水杨酸检测蛋白质连续收集三管DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于收集含有清蛋白的洗脱液每管10滴，纯化清蛋白连续收集两管取浓度最高的一管做纯度鉴定。2管均作纯度鉴定最后DEAE-纤维柱先用6ml1.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4AC溶液流洗，再用10ml0.02mol/LNH4AC缓冲液流洗再生平衡。醋酸纤维素薄膜电泳：点样（粗面）→电泳→染色和漂洗注意：①点样线尽量点得细窄而均匀②电泳时薄膜粗面朝下、点样端置阴极端、两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平，切勿使点样处与电泳槽接触③电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜色脱净为止。取出膜，用滤纸吸干即可。四、结果与讨论：结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。从上到下分别为血清、清蛋白一、清蛋白二、球蛋白。从上图可以看出，此次实验结果不太理想，血清电泳结果只有两条带，推测原因有①血清点样时量不足②点样时手法不恰当③血清不新鲜同样清蛋白提取液只出现了一条不明显的条带，球蛋白提取液未出现条带，推测可能的原因是①提取时错使蛋白质峰液流失②上一组同学使用层析柱时将液体流干使柱内进入空气③血清不新鲜，有细菌滋生思考题：（1）硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?因为清蛋白和球蛋白的盐析浓度不一样，使用半饱和硫酸铵溶液可以使球蛋白沉淀而清蛋白不沉淀，0.8ml血清和0.8ml饱和硫酸铵混合可以形成半饱和硫酸铵溶液从而达到分离的目的。（2）为什么实验中DEAE纤维素柱分离γ-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白?因为DEAE纤维素带正电荷，是一种阴离子交换剂，而γ-球蛋白带正电荷，不与DEAE纤维素结合，会从层析柱中首先洗脱出来。所以DEAE纤维素柱分离γ-球蛋白后可直接用于纯化清蛋白。（3）应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度,根据什么来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么?血清中含有清蛋白，α-球蛋白，β-球蛋白，γ-球蛋白等蛋白质，每种蛋白质均具有其不同的等电点、氨基酸立体构象和相对分子质量，因此在同一电场中也具有不同的泳动速度。据此分离后将薄膜置于染色液中使蛋白质固定并染色，可见清晰的条带。根据上图数据分析，用此方法分离的蛋白条带从阳极至阴极的顺序应为：清蛋白、α1-球蛋白、α2