实验一有丝分裂标本制备

有丝分裂染色体制片及观察一、实验目的1.学习并掌握根尖处理、染色、压片及制片观察的方法。2.观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。二、实验原理

高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎尖生长点及幼叶等器官的分生组织(分生区),其中根尖是最常用的材料：①根尖取材容易，操作和鉴定也比其它器官与组织方便；②实验室内采用种子萌发后所长出的新鲜幼嫩根尖，不受植物生长季节的影响和限制，并且可以大量获得；③对于某些珍贵而又稀少的试验材料，取用自然条件下生长植株的根尖，比取用茎尖、花器等对材料的伤害要小得多；④采用实验室内种子发根，切取根尖后的种苗通常还可以进行正常种植，利于后续研究进行。有丝分裂期在整个细胞周期中所占的时间相对比较短，有丝分裂制片的主要目的是进行染色体鉴定，希望观察到更多分裂相，尤其是分裂中期相，通常要对材料进行不同的预处理。预处理：主要通过抑制和破坏纺锤丝的形成来获得更多的中期分裂相；预处理还可改变细胞质的粘度，促使染色体缩短和分散，便于压片和观察。常用的预处理有物理法、化学法、混合处理法等。植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁结构将分生细胞结合成一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离，这一操作称为解离。解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。常用的解离方法主要有酸解法和酶解法。酸解法：步骤简便、容易掌握。根尖分生组织经过酸解和压片后，都呈单细胞，但大部分分裂细胞的染色体还包在细胞壁中间。酸解法广泛用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察及相关分析。酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换研究。通过解离和压片，分生细胞的原生质体能够从细胞壁里压出，使染色体周围不带有细胞质或仅有少量细胞质，让后续制片处理直接作用于染色体。在普通光学显微镜下观察染色体形态结构还需要对材料进行染色，通常采用染色体染色效果好而细胞质着色少的碱性染料、酸性染料或孚尔根试剂染色。三、实验材料

洋葱（2n=16）根尖四、实验试剂

0.1％秋水仙素或饱，卡诺氏固定液，醋酸洋红染液，冰乙酸，无水乙醇，70％乙醇，１mol/L盐酸。①水培法②砂培法五、实验方法1.发根取材：上午10:00～11:00下午4:00～5:002.预处理

将剪下的根尖立即放入0.1％秋水仙碱水溶液中，以药液浸没根尖为度，处理3～4h。抑制和破坏纺锤丝的形成，使根尖细胞延迟其染色体的分离，增加中期分裂相，并使染色体分散于细胞中，以便观察计数。3.固定①什么叫固定？为什么要固定？②固定液

乙醇:冰乙酸=3:14.保存70%的乙醇可以长期保存材料5.解离1mol/LHCl60℃水浴中解离4′±15″6.水洗7.染色及压片①取分生组织1/3左右于载片上，解剖针碾碎，并铺展开；②在材料上滴一滴醋酸洋红

，染色10-15分钟；③盖片，用滤纸覆盖盖片，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分散压平，便于观察。3.固定

材料经预处理后用流水冲洗，然后投入卡诺液(3份甲醇:1份冰乙酸，现配现用)中固定20～24h，用95％的乙醇洗两次，转入70％乙醇中保存备用。固定的目的是将材料迅速杀死，并使染色体形态、结构尽可能保持不变和便于染色。4.解离

常用酸解法：从70％乙醇中取出固定好的根尖→流水冲洗3min→吸水纸吸干→放入盛有适量1mol/LHCl，60±0.5℃水浴保温的青霉素瓶中→解离10min。5.染色

改良石炭酸品红染色：

解离后材料水洗3min并吸干，取1/2个根尖的乳白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴加1～2滴染液，染色10～15min，压片。8.镜检

通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少数，因此压片后要认真仔细地进行镜检。先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。调节可变光栏与反光镜，使光线明暗合适，视场亮度适中。注意观察有丝分裂全过程的染色体形态变化，找出染色体分散好的中期细胞进行染色体计数，对好的分裂图像作上标记，以便再观察。六、结果间期：在光学显微镜下，只看到均匀一致的细胞核及许多的丝状染色质。实质上间期的核是处于高度活跃的生理生化的代谢阶段，正为细胞分裂准备条件。

前期：

核内染色质逐渐浓缩为细长而卷曲的染色体，每一染色体含有两个染色单体，它们具有一个共同的着丝点；核仁和核膜逐渐模糊不明显。中期：

核仁、核膜逐渐消失，各染色体排列在赤道板上，纺锤丝与染色体的着丝点相连。染色体分散，易于鉴定形态、数目。后期：

各染色体着丝点分裂为二，其每条染色单体也相应地分开，并各自随着纺锤丝的收缩而移向两极，每极有一组染色体，数目和原来的相同。

末期：分开在两极的染色体各自组成新的细胞核，在细胞质中央赤道板处形成新的细胞壁，使细胞分裂为二，形成二个子细胞。这时细胞进入分裂间期。

七、注意事项1.酒精和解离液都要清洗干净，并认真吸干，否则影响染色效果。2.染色时间10分钟是个参考时间，应以实际染色效果判断，不太长也不能太短。3.镊子敲打时，应用力均匀，开始不要太重，避免细