c化学发光免疫分析技术

临床免疫学与检验宁夏医科大学检验系临床免疫学检验教研室

Chemiluminescence

ImmuoassayChapter10CLIA

Chemiluminescenceimmunoassay化学发光免疫分析

化学发光免疫分析:化学发光分析+免疫分析标记物化学发光剂（AE）酶（HRP、AP）标记抗原/抗体purposeMaster：1.化学发光剂的种类及发光原理2.化学发光免疫分析技术的类型及其原理Befamiliar：化学发光免疫分析概述Know：

1.化学发光剂标记物的制备

2.化学发光免疫技术的临床应用本章内容1概述化学发光免疫分析技术的类型32化学发光剂与标记技术化学发光免疫技术的应用41.发光：指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再返回到基态，并释放光子的过程。2.化学发光:是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发光。3.化学发光免疫分析:是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术4.类型：分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。小结1．发光、化学发光、CLIA、ECLIA。2．常用的化学发光剂有哪些？3．吖啶酯化学发光的原理和特点是什么？4．酶促反应的发光剂有哪些？其发光原理是什么？5．三联吡啶钌发光的原理和特点是什么？6.试述化学发光免疫分析的常用技术类型。思考题ThankYou!放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术发光免疫技术三大经典标记技术Section1概述一、发光基态（发光剂）激发①光照②荧光素酶③化学反应

激发态基态回复发光发光类型：光照发光、生物发光、化学发光luminescence电子跃迁较低能级（电子）较高能级回复荧光物质萤火虫荧光素化学能

φCL＝电子激发态生成效率(φex)

x发光效率(φL)

不同的发光剂有不同的发光效率，如鲁米诺，化学发光效率可达10-2。化学发光效率越高，单位剂量发光剂的发光强度越高，化学发光检测的灵敏度越高。二、化学发光效率(φCL)在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。一、化学发光剂（chemiluminescencereagent）Section2

化学发光剂与标记技术酶促、直接、电化学（一）酶促反应发光剂发光底物HRP

AP发光eg：鲁米诺、对羟基苯乙酸（HPA）AMPPD、4-MUP鲁米诺发光原理1．HPR的发光底物

（1）鲁米诺（2）对羟基苯乙酸（HPA）荧光（450nm）激发光（350nm）〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕2．ALP的发光底物

（1）AMPPDAMPPD发光反应原理AMPD稳定而持续

波长470nm，15~60min（2）4-MUP荧光（448nm）360nm激发光无需酶的催化，直接参与发光反应有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。如吖啶酯。

（二）直接化学发光剂吖啶酯（AE）N-甲基吖啶酮（发光体）发光剂

（AE）发光促进剂eg：H2O2、OH-发光470nm指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+：它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。三联吡啶钌发光剂电子供体电场电化学反应发光（三）电化学发光剂电化学发光剂发光原理●（三）电化学发光剂（三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+）周而复始二、化学发光剂标记物的制备碳二亚胺（EDC）缩合法过碘酸钠氧化法重氮盐偶联法N-羟基琥珀酰亚胺活化法方式酰胺键Schiff碱酰胺键Section3

化学发光免疫分析技术的类型化学发光酶免疫分析(chemiluminescenceenzymeimmunoassay)化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay)电化学发光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay)。一、发光酶免疫分析酶－Ag/Ab＋Ab/Ag分离B与F发光底物发光检测发光强度同酶标法，只是底物为发光剂常用酶：HRP、AP（一）原理：酶促发光反应类型一：荧光酶免疫分析类型二:化学发光酶免疫分析（二）技术类型1.抗原抗体反应（1）双抗体夹心法：固相抗体—待检抗原—酶标抗体（2）双抗原夹心法：固相抗原—待检抗体—酶标抗原（3）固相抗原竞争法：固相抗原+待检抗原+酶标抗体竞争2.B与F分离---固相分离法固相磁颗粒----磁颗粒分离法----磁场吸附分离无磁微颗粒----微粒子捕获法----纤维膜柱分离聚苯乙烯小珠----包被珠分离法----离心洗涤分离3.酶促发光反应荧光（448nm）360nm激发光4.标准曲线制作和本结果计算按要求进行：标准曲线校准，用质控品验证校准曲线的有效性。根据标本的发光量值自动计算待测物的含量。（三）方法学评价灵敏度较高。易产生较高本底。洗涤不彻底，易产生非特异性酶发光反应若含影响标记酶活性的物质，会影响结果测定。二、化学发光免疫分析AE－Ag/Ab＋Ab/Ag＋磁珠－Ag/Ab磁场分离B与F氧化剂（H2O2）NaOH发光检测发光强度（与待测抗原的量成正比，从标准曲线上计算出待测抗原的含量。）（一）原理发光YYY磁微粒被测抗原+抗体+AE标记抗体YYYYYYYYYYY冲洗后---夹心法加入H2O2（pH<10）加入碱（pH>10）化学发光免疫分析(图解)（二）技术要点1.抗原抗体反应（同酶发光免疫测定技术）（1）双抗体夹心法（2）双抗原夹心法（3）固相抗原竞争法2.B和F的分离常用磁颗粒分离技术3.化学发光反应与结果计算接收----放大---记录1秒钟内所产生的光子能----光强度与被测抗原量成正相关----根据标准曲线仪器自动计算出待测抗原含量。发光YYYY冲洗后加入H2O2（pH<10）加入碱（pH>10）（三）方法学评价1.AE发光反应简单，发光快速而无须催化剂。2.AE可直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标记物的生物学活性和理化特性。3.试剂有效期可达一年。4.分离简便、快捷。5.为瞬间发光，持续时间短，对信号检测仪的灵敏度要求比较高。(Electrochemiluminescence

immunoassay，ECLIA）三、电化学发光免疫分析（一）原理电化学发光（ECL）+免疫测定+磁颗粒分离电化学＋化学发光电化学发光剂[Ru（bpy）3]2+Ab(Ag)标记电化学发光免疫分析技术原理示意图光电倍增管检测（二）技术要点

1.抗原抗体反应（同酶发光免疫测定技术）（1）双抗体夹心法（2）双抗原夹心法（3）固相抗原竞争法[Ru(bpy)3]2+-抗体-待测抗原-抗体-生物素-链霉亲和素-磁珠复合体

2.B和F分离磁与ECL反应颗粒分离技术----电极加电压，启动ECL反应3.结果计算

光电倍增管检测光强度，光强度与待检抗原的浓度呈正相关,根据标准曲线算出待测抗原的含量。（三）方法学评价1.试剂灵敏度高，（pg/ml水平），稳定性好。2.持续发光，信号强，易测定，易控制。3.不影响标记物的理化特性。

1.激素检测：甲状腺激素、生殖激素、垂体激素等

2.肿瘤及病毒标志物检测：AFP、CA类、乙肝两对半、抗HIV

3.感染性疾病：病原体抗原抗体4．贫血因子：维生素B12、叶酸、红细胞叶酸、铁蛋白

5．糖尿病：胰岛素、血清C-肽、血浆胰高糖素。

6．过敏性疾病:总IgE、特异性IgE

7．心脏标志物：肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）等

8．治疗药物监测：茶碱、地高辛、环孢素、巴比妥等。Section4