组织工程支架制备有哪些方法

（一）纤维支架纤维支架是组织工程研究中最早采用的细胞外基质替代物之一，主要由PGA或其共聚物等结晶性聚合物纤维构成。利用纺织技术将直径10－15μm的纤维制成织物或无纺物，其孔隙率高达97%，比表面积高达0.05μm-1，但存在力学强度较差、承压时会坍塌的缺点。三、支架制备技术1a改进：（1）雾化或喷雾涂曾采用PLLA或PLGA溶液涂覆织物的方法，可使相邻纤维间形成物理连结，从而使纤维支架稳定、耐压。（2）热处理溶出PGA纤维浸在PLLA/CH2Cl2

溶液中溶剂挥发后PGA嵌入到PLLA中加热到两种聚合物熔点以上，PLLA熔点低，先熔化，充满PGA纤维网络所有空洞（PLLA防止纤维网塌陷作用）。交叉点的PGA纤维熔融后物理缠结在一起。用氯仿溶出PLLA通过织物提高机械性能；类似孔结构2a纤维网状结构加工示意图A:PGAB:PLLA3a(二)多孔支架松质骨结构4a1.粒子致孔法最常用的是溶液浇注/粒子浸滤聚合物溶液与均一的盐晶混合溶剂挥发后形成固体的聚合物/盐复合物浸没在水中去除盐可控孔隙率达93%（厚度<2mm）当盐晶含量为70－90％时，有均匀的联孔结构5a致孔剂粒子可采用氯化钠、酒石酸钠和柠檬酸钠等水溶性无机盐或糖粒子，也可用石蜡粒子或冰粒子。溶液浇铸/粒子浸滤法制备多孔支架时易形成致密的皮层，若浇铸后不断地振动至大部分溶剂挥发，可防止粒子沉降，抑制表面皮层的形成。（非溶剂聚沉）

粒子致孔法简单、适用性广，孔隙率和孔尺寸易独立调节，是一个通用的方法，得到了广泛的应用，但致孔时往往需用到有机溶剂。6a形成气体的盐致孔水溶性致孔剂致孔冰晶致孔GuopingChen,etal.Developmentofbiodegradableporousscaffoldsfortissueengineering.MaterialsScienceandEngineering,2001;C17:63–9Morphologyofcross-sectionsofPLLAsponges7a2.热致相分离（TIPS）

相分离法是指将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻，冷冻过程中发生相分离，形成富溶剂相和富聚合物相，然后经冷冻干燥除去溶剂而形成多孔结构的方法。因而，相分离法又往往称为冷冻干燥法。按体系形态的不同可简单地分为乳液冷冻干燥法、溶液冷冻干燥法和水凝胶冷冻干燥法。8a均向聚合物溶液：高温低温淬火热力学状态参数：溶液浓度、冷冻温度、冷冻时间和冷冻速率等液－液相分离相图9aPorousPDLLA/BioglassscompositescaffoldspreparedbyTIPS：bimodalandanisotropicporestructurescomposedoftubularmacroporesof100m,interconnectedwithmicroporesof10–50mindiameter(冷却到L-S相平衡线以下干燥)溶液冷冻干燥10aWhangK,etal.Anovelmethodtofabricatebioabsorbablescaffolds.Polymer1995,36:837-42真空干燥液氮去离子水乳液聚合物去离子水冷冻干燥乳液冷冻干燥11aMing-HuaHo,etal.Preparationofporousscaffoldsbyusingfreeze-extractionandfreeze-gelationmethods.Biomaterials2004;25:129–38溶液冷冻凝胶温度低于溶液凝结点Morphologyofthechitosanandalginatescaffolds水凝胶冷冻干燥（明胶、藻酸盐和壳聚糖等水凝胶）12a不同温度下，多步相分离粗化，提高孔尺寸、连通性相分离/冷冻干燥法孔尺寸往往偏小，但该法避免了高温，因而得到了研究者的重视。改进：13a3.气体发泡法（1）超临界流体技术（物理发泡法）该法将聚合物压成片,浸泡在高压二氧化碳中直至饱和,甚至超临界状态,然后降至常压,气体的热力学不稳定性导致气泡成核和增长,形成多孔支架。超临界二氧化碳（SCCO2）无残留溶剂制备非晶相聚合物支架14a优点：不使用有机溶剂，因为残留在支架中的有机溶剂对细胞有害;反应体系可以在比较低的温度下进行（30－40C）,便于药物和生长因子的粘附。缺点：支架的孔隙率和孔径不可控，由气体在固体中溶解/释放过程的形态决定；连通率低（10－30％）；闭孔结构，可联合粒子浸滤法改进。15a（2）化学发泡法化学发泡法来制备多孔支架,采用的化学发泡剂主要为碳酸盐类化合物。将聚合物溶液/碳酸氢铵粒子混合物加入到模具中,待溶剂部分挥发后直接浸入热水中发泡,最后经冷冻干燥可得到多孔支架。该法得到的多孔支架孔隙率超过90%,孔相连性好,孔尺寸约100－500μm,并避免了表面皮层的形成。16a4.微球聚集法将可降解聚合物微球加入模具中,加热至玻璃化温度以上,保持一定时间后冷却、脱模可制得烧结微球支架。热处理时微球相互接触处由于链运动而连结在一起,冷却至室温后该结构被固定下来,因而得到多孔的烧结微球支架。17aFabricationprocessofacompositeofPLAGAandBG.Thecompositewaspreparedina3-D,porousscaffoldbymicrospheresintering.PVALUetal.JBiomedMaterRes64A:465–474,200318a

微球紧密堆积产生的孔隙成为支架的孔,孔尺寸范围为37－150μm,与微球尺寸成正比,孔隙率则随微球尺寸增大略有增加,为31－39%,孔相连性很好。该法优点在于孔相连性好,孔尺寸易调控,力学强度大,微球可包裹药物、生长因子，进行可控释放。缺点则在于孔尺寸偏小,孔隙率亦低。19a5、静电纺丝优点：操作简单，制品比表面积大缺点：耗时长、效率低、可控性差，纤维难以排布规则20a6.3D印刷浇铸聚合物粉基础（如：PLGA）按希望的分布点“印”微米体积的溶剂液滴（氯仿）当溶剂挥发时凝结的粉固化重复以上操作，建立3D结构摇出未凝结的粉精确性结构型微孔聚合物或陶瓷支架21a22aTypicalmorphologiesofporouspolymerfoamsproducedbysolidfreeformfabricationtechnique23a

快速成型法可一步形成支架的外形和相连的多孔结构,是一种一体化制备方法。优点:成型时间短,利于自动化大规模生产;可根据个体的不同,迅速制备出具有个体特征的三维多孔支架;可制备各个部位具有不同孔结构的支架以适应复合组织的不同要求。缺点：支架孔隙率偏低,通常小于80%.改进？？24a7.相连管状孔道支架将糖纤维等水溶性纤维材料预先构建成具有特定结构的三维“负”支架,“负”支架经水蒸汽处理后形成连结.将聚合物溶液滴在“负”支架上,冷冻使聚合物溶液凝胶化,用水浸出糖纤维冷冻干燥脱除溶剂,得到的多孔支架具有预先设计的相连管状孔道结构,孔隙率高达90%以上,并具有纳米纤维孔壁结构。25a“负”支架的构建既可手工完成,也可用快速成型技术来实现自动化。与通常的快速成型技术不同的是,首先形成的是最终的多孔支架的“负”复制品。该支架的相连管状孔道结构更有利于支架内的传质过程,其纳米纤维孔壁结构则更有利于细胞粘附。26a支架设计及制备技术制备技术加工材料要求孔径/m孔隙率/%结构溶剂流涎盐沥滤流涎溶解30~300~90球状孔径、盐粒会残留挤出沥滤模具热塑性50~500<80球状孔径、盐粒会残留纤维粘合编织织物20~100<85孔隙结构不规整乳液冷冻干燥流涎溶解20~200>90热诱导相分离流涎溶解<100<97孔隙高度贯穿，微孔结构超临界流体技术流涎非晶相<5010~30非贯穿孔，微孔结构三维打印固体自由成型溶解45~150<60100%贯穿孔（三角、五角、蜂窝状）表：三维支架制备技术27a（三）注射型组织再生支架（软支架）

可注射型支架是将一种具有流动性的生物相容性良好的材料与异体或自体细胞复合后注射到机体缺损部位,或直接注人体内,

材料到达缺损部位后能在原位形成具有一定机械强度、形状并且可与体液进行交换的支架。支架通过注射完成植入,故可降低手术难度,减少手术创伤,特别适用于微创伤的修复。高长有,马列.医用高分子材料.P229-234.洪奕等.注射型组织再生支架的研究进展.生物医学工程学杂志,2007;24(2):463-465.28a可注射型支架在组织工程中应用的示意图水凝胶具有在一定条件下可保持流动状态而在外部的物理或化学刺激下可形成一定形状和强度的体型材料的特性,因此成为可注射型支架的首选材料。29a水凝胶作为可注射型支架优点：具有良好生物相容性；水溶液环境有利于保护细胞以及营养物和分泌产物的运输；易用细胞粘附配体进行改性。水凝胶作为可注射型支架缺点：水凝胶的操作不易控制,机械强度较低，消毒困难。30a1.温敏型水凝胶类可注射支架:

温敏型水凝胶是指当一定浓度的溶液在温度升高或降低到一定值时可迅速形成凝胶,可分为升温型水凝胶和降温型水凝胶。由于温敏型水凝胶只需通过改变温度就可凝胶化,大大降低了外界物质对细胞的影响,因此用于可注射型支架具有一定的优越性。例如：降温型：琼脂；升温型：PEO、胶原、PNIPAm接枝明胶31a2.交联型水凝胶类可注射支架指在添加助剂或者引发剂后,分子链间发生交联形成水凝胶。交联方式有共价键交联,离子键交联等。交联也可通过光引发来进行。

如：聚反丁烯二酸丙二醇酯（PPF）通过主链上的双键和含双键的单体或低聚物进行交联原位形成凝胶。为减小温度、添加交联剂及引发剂,对细胞的活性的影响,可采取微囊化复合改进。如，Payne等将骨髓间质成骨干细胞微囊化后种植在水凝胶以保持细胞活性。32a3.复合水凝胶型可注射型支架以水凝胶为载体的可注射型支架主要用于骨修复,一般是采用微粒与水凝胶材料以适当比例共混,保持流动性,然后将混合物注射到缺损部位后凝胶化。目前报道最多的是以羟丙基甲基纤维素水凝胶与具生物活性的磷酸钙(BCP)复合以制备可注射型骨替代物一。纤维素类水凝胶是一类升温型水凝胶,可以通过纤维素浓度来控制凝胶化的温度范围。33a组织修复中的可注射型材料分类可注射型材料固化方式无机材料磷酸钙陶瓷固化天然高分子材料壳聚糖海藻酸钠胶原明胶琼脂透明质酸葡聚糖甲基纤维素类纤维蛋白温敏型，引发剂引发离子交联，光引发温敏型温敏型温敏型光引发光引发温敏型温敏型，酶交联合成高分子材料PEOPPFPNIPAM类PEG类PEO-PPO-PEOPLA-PEG-biotinPVA光引发光引发，引发剂引发温敏型温敏型，光引发，酶交联，M加成温敏型自组装光引发PPF：聚反丁烯二酸丙二醇酯34a可注射型支架研究中存在的问题:如何提高水凝胶的强度凝胶化的可控性对于预制备降温型、交联型等水凝胶时与细胞的复合问题等。35aMicrospheresBiodegradablePLGAmicrosphereshavebeenstudiedfordeliveryofchondrocytesforcartilageengineering.Non-porousPLGAmicrospherescouldbeusedas(i)amicrocarrierforcellexpansioninvitro[130],priortouseasan(ii)injectablecarrierforcartilageregenerationinvivo[131–133].Werecentlyreportedthathighlyporousmicrospheres(∼200μminoveralldiameterand∼30μminporediameter)couldbepreparedbyagasfoamingmethod[29].Theseporousscaffoldmicrospherescouldbeusedformicrocarriersuspensioncultureofcells,aswellasinjectionofthecell/microsphereconstructsintoatissuedefectsite(Fig.5).Theseinjectableandporousmicrosphereswouldprovideagreatadvantageforcelltherapyinmanyaspects.Priortoinjection,theporousstructure(∼30μm)wouldallowsufficientcellseedinginandoutofthematrix.Afterinjectioninvivo,theporousmatrixwouldpermitinfiltrationofcellsandin-growthoftissuefromthehost,facilitatingtheregenerationprocess.H.J.Chung,T.G.Park/AdvancedDrugDeliveryReviews59(2007)249–26236aFig.5.Useofinjectableporousscaffoldmicrospheresforcartilagetissueengineeringasanexample.Primarychondrocytesareseededwithinporousscaffoldmicrospheres,expandedinvitro,andtheninjectedoralternativelyimplantedasaculturedtissueintoacartilagedefectsite.软骨细胞37a（四）天然组织工程支架天然支架是利用天然材料本身存在的疏松或多孔状结构，通过一定的制备方法得到的多孔支架材料。例如，利用直接或完全替代的原理，用其它个体的骨组织的无机部分作为支架材料。异种骨异体骨（脱钙骨、冻干骨）海珊瑚38a五、组织工程支架的发展不同材料间的复合生长因子的引入物理结构上的仿生化（多层次）39a理想组织工程支架模式图纳米纤维状胶原基质孔洞微球内部开孔体系磷灰石40a生物材料表面改性方法等离子改性

接枝改性

生物活性分子的固定

聚合物表面基团的改变

自组装单分子层层层自组装

41a生物大分子的表面固定化

将具有生物活性的大分子通过物理吸附、包埋或化学键合的方法固定在材料的表面生物活性大分子：ECM黏附蛋白（纤连蛋白、层连蛋白）ECM多糖及其类似物（透明质酸、壳聚糖）细胞黏附多肽（RGD）细胞活性因子42a注：RGD系含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的促进细胞粘附的寡肽

43a8.4组织工程中的微胶囊技术一、微胶囊概论

微胶囊是指以高分子膜为外壳、其中包有被保护或被密封的物质的微小包囊物。就像鱼肝油丸那样，外面是一个明胶胶囊,里面是液态的鱼肝油。经过这样处理，鱼肝油由液体变成了固体。微胶囊的颗粒直径要比传统的鱼肝油丸小得多，尺寸范围在零点几微米至几千微米之间，一般为5-200μm。44a单核多核多核，不规则外形双璧微胶囊簇含微胶囊之微胶囊

微胶囊内被包裹的物质通常称为芯（core）、核（nucleus）或填充物（fill）；外壁称为皮（skin）、壳（shell）或保护膜（protectivefilm）。微胶囊中所包裹的物质，可以是液体、固体粉末，也可是气体。由于应用目的和制造工艺不同，微胶囊的大小、形状可有很大变化，其包裹形式也有多种。常见的有:45a生物微胶囊的概念

将酶、蛋白质和激素等生物活性物质或微生物、动植物细胞包封在亲水性的选择性透过膜中,形成的球状微胶囊,称之为生物微胶囊。1957年，Chang首次报道生物活性物质的微囊化(ChangTMS.Hemoglobincorpuscles.ResearchReportforHonoursPhysiology.MedicalLibrary,McGillUniversity,1957)60年代中期,Chang又指出了生物微胶囊在临床及其他生物学应用上的可行性.(ChangTMS.Semipermeablemicrocapsules.Science,1964,146:524~525)46a

通过微胶囊膜的选择透过作用,使囊外大于某一分子量的物质不能扩散进入,而生物环境中的营养成分和囊内生物活性物质或细胞分泌的小分子产物可以自由出入微胶囊,从而达到免疫隔离目的生物微胶囊示意图方法：1．把需要的细胞密封在半透膜中2．植入密封装置或与体内连接3．细胞分泌物⇒治疗4．当治疗完成时装置取出或断开连接47a80年代初,人工胰腺：将微囊化技术与组织细胞移植相结合,制备了具有良好生物相容性的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊作为免疫隔离工具,包埋猪胰岛细胞形成人工细胞,并移植入糖尿病大鼠体内,结果表明该人工细胞成功地调节了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能.LimF,SunAM.Science,1980,210:908~90948a90年代以来,医学界开始尝试以微胶囊作为基因重组细胞的免疫隔离和运载工具，利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能,治疗相关疾病.

目前,微胶囊的应用研究还涉及药物控制释放、动植物细胞培养、细胞和酶的固定化、以及生化物质分离等领域。49a二、生物微胶囊的种类及其制备生物微胶囊在应用上必须满足如下条件：对生物物质没有毒害作用，生物相容性好（但不支持细胞粘附，也不刺激细胞过渡生长）；良好的传质性质（生物活性物质、信息物质、细胞产物）和截留隔离性质（抗体或免疫细胞）；理化性质稳定，并具有一定的机械强度。50a两个重要的物理量：微胶囊膜强度膜强度大小决定了微胶囊在生物环境停留期间能否保持基本完整,从而保证囊内细胞或物