羧甲基壳聚糖

羧甲基壳聚糖/纳米羟基磷灰石复

合支架材料的制备及生物安全性文章引自：复合材料学报2008年6月王海斌,赫淑倩,赵冬梅,孙康宁,刘爱红主讲人：张行摘要：

为了探讨羧甲基壳聚糖/纳米羟基磷灰石(CMCTS/n-HA)复合支架材料的制备及其生物安全性,采用化学沉淀法合成了纳米羟基磷灰石粉体(n-HA);以无水乙醇为沥滤剂,以16.7%(质量分数)的柠檬酸水溶液作粘接剂,通过粒子沥滤法制备CMCTS/n-HA多孔复合材料。对其孔隙率及抗压强度进行测试,并将其植入大白兔骨缺损处观察组织学变化并进行肝肾功能检测。CMCTS/n-HA复合多孔材料的孔隙率接近75%,孔隙尺寸分布约从几微米到600μm,并且孔隙之间相互贯通,其抗压强度可达21MPa以上,植入大白兔骨缺损处未见引起骨组织明显的炎症反应及骨坏死,肝肾功能检测未发现有肝肾毒性。CMCTS/n-HA可以满足骨组织工程支架的基本要求。引言

骨缺损是骨科临床常见的难症之一。组织工程化骨的应用为骨缺损的治疗带来良好的前景,目前多数学者认为组织工程化骨制备的重点是组织工程支架材料的研制构建。羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)是人体骨组织的主要成分,具有良好生物相容性、生物活性及骨传导性,已广泛用于修复各类骨缺损,但由于易发生脆性断裂、疲劳破坏及不可降解性,长期疗效不尽人意。虽然HA纳米化后生物力学及可降解性得到改善,但仍距骨组织工程支架材料的要求相差甚远,还存在一定不可克服的缺点。为了提高材料的力学性能及新骨的形成速度,采用不同性质的材料进行杂化以获得具有新性的杂化支架材料,成为当前生物材料研究的热点。壳聚糖(Chitosan,CS)能增加碳酸化羟基磷灰石骨水泥固化液的黏度系数[Takagi等用CS和磷酸钙制备了有良好赋形性质和生物亲和性的硬组织修复材料,具有与人体骨组织更为接近的理化性能。CS的主要成分是氨基葡聚糖,具有诱导刺激组织再生重建的活性,能够诱导骨与软骨细胞再生。1材料与方法

1.1材料

n-HA粉体由本实验室采用化学沉淀法制备(其微观形貌见图1);N,O-羧甲基壳聚糖,购自青岛海汇生物工程有限公司,羧甲基取代度为90.5%,脱乙酰度88.6%;对二氯苯,无水乙醇,柠檬酸,均为分析纯。1.2CMCTS/n-HA复合支架材料的制备

将n-HA与CMCTS分别按质量比为9：1、8：2、7：3、6：4和5：5配料,机械球磨使其充分混合,再按CMCTS/n-HA复合粉体与造孔剂对二氯苯1∶1的质量比例称料,充分研磨混合,然后超声振荡2h,使它们充分混匀。加入质量分数为16.7%柠檬酸溶液,调和均匀,放入柱状模具中,加压成型,保压60s,脱模,置于冷冻干燥机中冷冻干燥。1.3CMCTS/n-HA复合支架材料性能测试

采用扫描电子显微镜(SEM)对样品的组成、结晶强弱及形貌特征进行表征,并用新三思CMT700型万能材料试验机和排水法分别测定多孔材料的抗压强度和孔隙率。1.4CMCTS/n-HA生物安全性测试

清洁级雄性日本大耳白兔32只,体重2.4～2.8kg。随机抽取16只作为实验组,每只兔子采用氯胺酮0.5mg/kg及兽用速眠新Ⅱ注射液0.5mg/kg复合麻醉后,显露右侧股骨干中段,以3mm钻头钻孔,将直径3mm的圆柱状的CMCTS/n-HA植入其中后关闭伤口。其余16只大白兔作为对照组,仅单纯显露右侧股骨中段并钻孔后,不作任何处理,直接闭合刀口。于第3周实验组与对照组分别随机处死大白兔各8只,于第6周剩余实验组与对照组动物全部处死。实验动物空气栓塞法处死前,抽取静脉血3mL,检测血清谷丙转氨酶(Alaninetransaminase,ALT),谷草转氨酶(Aspartatetransaminase,AST)、肌酐(Creatinine,Cr)、尿素氮(Ureanitrogen,Urea)的水平。实验用动物处死后,实验组取移植CMCTS/n-HA复合材料周围骨组织标本,对照组取钻孔处骨组织标本,4%多聚甲醛固定,采用乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙,常规酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡后石蜡包埋,行6μm连续切片,做苏木素-伊红(HE)染色进行光学显微镜观察。1.5统计学研究

采用SPSS11.0统计软件,肝肾功能分析数据以x±s表示,采用单因素方差分析,检验水平:P<0.05。2

结果与讨论

2.1CMCTS/n-HA复合支架材料表征及性能

本实验采用粒子沥滤法将n-HA与CMCTS结合杂化制备了高孔隙率CMCTS/n-HA多孔复合材料。复合材料的成分没有发生变化,仍然为羟基磷灰石与羧甲基壳聚糖,并且羧甲基以及胺基分别与羟基磷灰石的羟基或Ca2+发生了不同程度反应,形成了较为牢固的界面结合。理想的细胞支架首先应该具有互相连通的三维多孔结构和足够的比表面积,以提高细胞接种的密度,此外,支架还应具有一定的力学强度,能承受生理压力,为新生组织提供支撑。由于支架材料孔隙率的升高会导致力学强度的迅速降低,目前研究的多孔人工骨孔隙率大多在30%～50%之间,距骨组织工程支架材料的要求尚有一定差距。研究表明,15～50μm的孔可以诱导纤维管组织的长入,50～150μm的孔则可刺激骨样组织的生成,而150～500μm的孔却可以直接诱发矿化骨的生成。对不同CMCTS添加量CMCTS/HA多孔复合材料进行了抗压强度和孔隙率进行了检测。图2是复合粉体与造孔剂质量比为1：1而羧甲基壳聚糖含量不同时多孔复合材料的断口扫描电镜照片。所有样品中均含有大量的孔隙,孔形不一,以圆形为主,其尺寸分布大约从几微米到600μm,并且孔隙之间相互贯通,非常有利于组织在其中的长入与扩展随着羧甲基壳聚糖含量的增加,孔的形状没有发生明显的变化,但孔的尺寸有减小的趋势,这可能导致总体孔隙率的降低和相应力学性能的不规律变化。从表1可以看出,当复合粉体与造孔剂的比例固定为1∶1时,随着羧甲基壳聚糖含量的增加,复合材料的孔隙率逐渐降低,其最低孔隙率接近75%,最高达87%,表明所制得的多孔复合材料具有足够高的孔隙率。2.2组织学及肝肾功能检测

为使CMCTS/n-HA多孔复合材料能安全有效地用于临床,首先要确定其生物安全性。实验组3周(图3(a))可以见到急慢性炎细胞浸润,无异物巨细胞反应,未见骨坏死;对照组3周(图3(b))以炎性充血为主,并可见慢性炎症细胞浸润;实验组6周(图3(c))可见轻微炎症反应,骨组织未见坏死、基本正常;对照组6周(图3(d))可见少量炎细胞,骨组织基本正常,未发现引起骨组织明显的异物巨细胞反应及骨坏死,提示CMCTS/HA具有良好的组织相容性。虽然通常组织相容性高的材料,其安全性也高,但是在材料合成过程中,由于采用不同的加工工艺及加工环境的影响,往往会使材料具有潜在的毒性。因此本实验对CMCTS/n-HA进行了实验动物的肝肾毒性检测,各组动物血清ALT、AST、Cr和Urea的均值见表2。因此本实验对CMCTS/n-HA进行了实验动物的肝肾毒性检测,各组动物血清ALT、AST、Cr和Urea的均值见表2。经单因素方差分析,对4组动物血清中的ALT(F=1.387,P=0.267)、AST(F=0.846,P=0.480)、Cr(F=0.804,P=0.502)和Urea的水平(F=1.254,P=0.309)进行各组内组间比较及各组内组间两两比较均没有统计学意义,提示CMCTS/n-HA复合材料。本实验只是检测了CMCTS/HA对兔血清肝肾功能的部分指标的影响,对CMCTS/n-HA安全性研究还有待进一步的完善。3结论(1)采用粒子沥滤法,复合材料中CMCTS含量为40wt%,复合材料与造孔剂的质量比为1∶1时为制备CMCTS/n-HA的最佳成