蛋白质和蛋白质药物2讲课教案

蛋白质和蛋白质药物2一.蛋白质一级结构与功能的关系1.一级结构不同，生物学功能不同一级结构指氨基酸种类数量以及排列顺序，一级结构的差异可表现为生物学活性的不同，如p64，加压素与催产素。都是9个氨基酸，但只有3位和8位两个氨基酸不同：加压素：Cys-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly催产素：Cys-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly加压素能促进血管收缩，升高血压，促进肾小管对水的重吸收，表现为抗利尿的功能。催产素能刺激子宫平滑肌收缩，表现为催产的功能。2.一级结构中关键部分相同，其功能也相同如促肾上腺皮质激素（ACTH）是39肽激素，其1-24位氨基酸是活性所必须的关键部分，切去其后的25-39位氨基酸后的片断仍具有全部活性。不同动物来源的ACTH，表现出相同的生化功能，其氨基酸顺序差异主要在25-33位（种族差异）。31-AA33-AA 人 Ser Glu 猪 Leu Glu 牛 Ser Gln

启示：化学合成ACTH时，只需要合成其活性所必须的关键部位。3、一级结构关键部分的变化，其生物学活性也改变。实验表明，多肽链中重要的氨基酸变化，其生物学活性也发生改变。有些关键氨基酸变化可使活性增加，如脑啡肽；而有些关键氨基酸变化可使活性大大降低，如促黄体生成释放素。4、一级结构的变化与疾病的关系最常见，最经典的例子使1949年美国科学家L.Pauling提出的镰状细胞贫血症（sicklecellanemia），在美国黑人中流行的一种致命的血液疾病Hbs。Hb是由两种异型亚基α与β构成的四聚体（α2β2）正常人Hb为α2β2与辅基共同构成，红细胞（RBC）呈盘状。而Hbs仅仅是因为β链中6位的Glu突变为Val而导致RBC呈镰刀状，产生溶血性贫血症。镰刀状红细胞性贫血镰刀状红细胞性贫血:β亚基N端的第6号氨基酸残基发生了变异，Glu→Val,这种变异来源于基因上遗传信息的突变。正常DNA……TGTGGGCTTCTTTTT

mRNA……ACACCC

GAA

GAAAAAHbAN端苏脯谷谷赖异常DNA……TGTGGGCATCTTTTT

mRNA……ACACCC

GUA

GAAAAAHbs苏脯缬谷赖

分子病（Pauling）：蛋白质分子发生变异所导致的疾病镰刀型红细胞贫血二、蛋白质空间结构与功能的关系

肌红蛋白（myoglobin,Mb）血红蛋白（hemoglubin,Hb）蛋白质的空间结构与功能关系

蛋白质生物学活性（生物学功能）与其空间结构密切相关，空间结构的变化往往会影响其生物学功能，表现在两个方面：1）、蛋白质变性，生物学活性丧失（后边重点内容）。2）、蛋白质前体活化以及酶原的激活（酶的化学中讲述）。1、蛋白质前体的活化

许多蛋白质前体并无活性或活性很低。在一定条件下，才能转变为有特定构象的蛋白质而表现其活性。如胰岛素前体胰岛素原，经水解酶切，除去部分氨基酸（C肽，31个氨基酸）并在A链（21个氨基酸）和B链（30个氨基酸）两条肽链之间形成两对二硫键，在A肽链上形成另一对链内二硫键，使胰岛素分子具有特定的空间结构，从而表现其完整的生物活性。详见下页的两张图：2、蛋白质的变构现象

一些蛋白质由于受到某些因素的影响，其一级结构不变而空间构象发生一定的变化，导致其生物学功能的改变，称蛋白质的变构现象或别构现象（allostericeffect）。变构现象是蛋白质表现其生物学功能的一种普遍而又重要的现象，也是调节蛋白质生物学功能极有效的方法。举例如下：Hb通过其变构作用来达到其结合氧和释放氧的能力。血红蛋白的变构效应Hb的主要功能之一是体内氧的运输。它与氧气的结合的饱和度随着氧分压的升高而增加，但不是直线关系，而是呈S型曲线。意义：曲线上部比较平坦，pO2由100mmHg降至80mmHg时，pO2下降少，所以，当血液经pO2高的肺时，即使pO2有相当大改变，也不影响肺部Hb与氧气结合功能。但S型曲线中段坡度较大，意味着组织中pO2稍微有下降就可引起HbO2的解离明显增加，保证组织的氧供应。Hb的氧饱和曲线三．蛋白质结构与生物进化

从p62表3-8可见与人类亲缘关系越近，其氨基酸差异越小，如黑猩猩，与人类氨基酸的差异为零，而酵母则与人类氨基酸差异为44。这也从另一方面揭示，当一种药推向临床时，选用的临床前药理实验动物与人类亲缘性越近越好。

物种间越接近，一级结构越相似，空间结构和功能也相似。

蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，其理化性质一、蛋白质的理化性质第五节蛋白质的理化性质及其分离纯化一部分与氨基酸相似，如两性电离、等电点、呈色反应等。也有一部分又不同于氨基酸，如高分子量、胶体性质、变性等。蛋白质的两性电离及等电点蛋白质的等电点（pI）蛋白质的性质一、蛋白质的两性解离和等电点蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在电场中，如果蛋白质分子所带正电荷多于负电荷，净电荷为正，则向负电极移动，反之，净电荷为负，向正极移动，这种泳动现象称电泳。蛋白质在等电点PH条件下，不发生电泳现象，利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。二、蛋白质的胶体性质这是蛋白质特有的性质。由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去蛋白质的胶体性质

蛋白质分子量颇大，介于一万到百万之间，故其分子的大小已达到胶粒1～100nm范围之内。因此蛋白质溶液具有胶体溶液的性质。蛋白质溶液在一定条件下相当稳定，稳定该亲水胶体的因素是：水化膜、电荷。+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质三、蛋白质的沉淀作用蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。蛋白质的沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。(三)蛋白质的沉淀和变性1、蛋白质的沉淀水化膜沉淀蛋白质的方法(1)盐析:加入电解质，使蛋白质发生沉淀的现象.实质：破坏蛋白质分子的水化膜和中和其所带的电荷。盐析浓度:盐析时所需电解质的最小浓度.常用盐析电解质:

(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl分段盐析:利用不同蛋白质盐析浓度不同分分离蛋白质的方法特点：盐析法沉淀的蛋白质没有变性，去盐后活性恢复。沉淀蛋白质的方法(2)有机溶剂沉淀:加入极性有机溶剂，使蛋白质发生沉淀的现象.实质：破坏蛋白质水化膜。特点：低浓度、低温、短时间蛋白质不变质.(3)重金属盐沉淀:pH>pI时沉淀蛋白质的方法(4)生物碱试剂沉淀:

pH<pI时(5)蛋白质互相沉淀:抗体—抗原反应1、可逆沉淀在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。2、不可逆沉淀在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。四、蛋白质的变性天然蛋白质因受物理或化学因素的影响，分子构象发生变化，致使蛋白质的理化性质和生物学功能随之发生变化，但一级结构未遭破坏，这种现象称为变性作用。变性后的蛋白质称为变性蛋白。导致蛋白质变性的因素：热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。类型：不可逆变性、可逆变性（可复性）蛋白质的变性天然蛋白质在某些物理、化学因素的作用下，丧失其生物活性，改变其理化性质的现象。物理因素：加热、高压、搅拌、X-射线、紫外线、超声波化学因素：强酸、强碱、脲、重金属盐、有机溶剂、生物碱等实质：破坏副键，改变其构象

变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。表现：物理性质：旋光度改变、粘度和表面张力增大，溶解度降低，失去结晶性化学性质：易被水解，易发生化学反应。如天然乳球蛋白能与12个2,4-二硝基氟苯反应，变性后可以增至31个。生物活性：变性蛋白质可以部分或全部失去生物活性。蛋白质的变性作用变性条件：物理因素：干燥、加热、高压、振荡或搅拌、紫外线、X射线、超声等等。化学因素：强酸、强碱、尿素、重金属盐、生物碱试剂（三氯乙酸、乙醇等等）。变性后的特点：①丧失生物活性②溶解度降低③易被水解（对水解酶的抵抗力减弱）。变性作用的利用：①消毒、杀菌、点豆腐等；②排毒（重金属盐中毒的急救）；③肿瘤的治疗（放疗杀死癌细胞）；变性作用的防治：①种子的贮存；②人体衰老（缓慢变性）；③防止紫外光灼伤皮肤。4．蛋白质的颜色反应

（1）缩二脲反应蛋白质与新配置的碱性硫酸铜溶液反应，呈紫色，称为缩二脲反应。（2）蛋白黄反应蛋白质中含有苯环的氨基酸，遇浓硝酸发生硝化反应而生成黄色硝基化合物的反应称为蛋白黄反应。（3）米勒反应蛋白质中酪氨酸的酚基遇到硝酸汞的硝酸溶液。（4）茚三酮反应蛋白质与稀的茚三酮溶液共热，即呈现蓝色。六.蛋白质的紫外吸收大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。七.蛋白质的颜色反应1.双缩脲反应：

两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应肽键的反应，肽键越多颜色越深受蛋白质特异性影响小蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度

2.米伦氏反应酪氨酸的显色反应（酚羟基反应）米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色3.乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成色氨酸的反应（吲哚环的反应）鉴定蛋白质中是否含有色氨酸明胶中不含色氨酸4.坂口反应精氨酸的反应（胍基的反应）精氨酸与α-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物鉴定蛋白质中是否含有精氨酸定量测定精氨酸5.福林试剂反应酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）福林试剂：磷钼酸-磷钨酸与双缩脲法结合Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍6.茚三酮反应灵敏度差7.黄蛋白反应浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应生成黄色化合物指甲、皮肤、毛发8.考马斯亮蓝G-250本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高11000微克/毫升盐析（saltprecipitation）：中性盐（硫酸铵等），分段盐析有机试剂沉淀：乙醇、丙酮，低温免疫沉淀：抗原-抗体电泳（electrophoresis）：pI，分子量的大小

透析（dialysis）：半透膜层析（chromatography）：离子交换层析、亲和层析、凝胶柱层析离心、超速离心（ultracentrifugation）：沉降系数S蛋白质的分离和纯化电泳（electrophoresis）双向凝胶电泳技术透析技术生命在于运动层析chromatography

凝胶柱层析

离子交换层析亲和层析超速离心掌握蛋白质的元素组成、基本组成单位，氨基酸成肽的连接方式；熟悉氨基酸的通式与结构特点；氨基酸三字母英文缩写。GSH由哪三个氨基酸残基组成？有何生理功能？蛋白质1~4级结构的定义及维系这些结构稳定的作用键？蛋白质二级结构的基本形式？并试述α-螺旋的结构特点。何谓蛋白质的变性？蛋白质变性后理化性质有何改变？蛋白质变性在医学上的应用。蛋白质在溶液中稳定的因素、盐析、等电点及定量方法举例说明蛋白质一级结构与功能的关系。蛋白质的呈色反应。复习要点异硫氰酸苯酯第六节蛋白质的分离

一．蛋白质的提取蛋白质提取的步骤：1）、材料选择2）、细胞粉碎3）、提取二．蛋白质的分离纯化（一）根据溶解度不同的分离纯化方法（二）根据分子大小不同的分离纯化方法（三）根据电离性质不同的分离纯化方法（四）根据配基特异性的分离纯化方法（一）根据溶解度不同的分离纯化方法1）、等电点沉淀法蛋白质在等电点时溶解度最小，容易发生沉淀，但沉淀不完全。在等电点处再加盐，沉淀完全。2）、盐析沉淀法中性盐对蛋白质胶体的稳定性有显著影响，且盐析沉淀的蛋白质一般保持天然构象而不变性制备具有生物学活性的蛋白质如酶，激素等。3）、低温有机溶剂沉淀法：有机溶剂破坏水化膜使蛋白质沉淀，如用冷乙醇从血清中分离制备人体蛋白和球蛋白。4）、温度对蛋白质溶解度的影响温度提高，虽然蛋白质溶解度增加但是容易变性所以低温操作。（二）根据分子大小不同的分离纯化方法1）、透析和超滤法：透析利用蛋白质大分子不可透过半透膜的性质（胶体性质）。常用于蛋白质脱盐，但是需要的时间长。超滤法（ultrafiltration）利用超滤膜在一定压力或离心力作用下，大分子物质被截留而小分子物质则被滤出。常用于蛋白质浓缩，脱盐。方便快速，大容量。2）、分子排阻层析：（molecular-exclusionchromatography）利用分子筛性质来分离蛋白质，常用的凝胶有a）葡聚糖凝胶；b）聚丙烯酰胺凝胶；c）琼脂糖凝胶。3）、密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）（三）根据电离性质不同的分离纯化方法1）、电泳法：带电荷的蛋白质分子在电泳场中根据其电荷量和形状不同而被分离分离的蛋白量少。（如PAGE电泳，上样量少）2）、离子交换层析：利用蛋白质的两性解离性质，使其结合在离子交换剂上，最后再将结合的目标蛋白洗脱下来，用于大量制备浓缩。但有的树脂较贵，如DEAE，100g/400-600元（四）根据配基特异性的分离纯化方法亲和层析（affinitychromatography）：又称选择层析，功能层析等。蛋白质与其相对应的化合物（称为配基）具有特异结合的能力，即亲和力。这种亲和力具有下列重要特性：a）、高度特异性；b）、可逆性三．蛋白质的纯度鉴定和含量测定（一）、蛋白质纯度的鉴定1）、层析法“层析纯”2）、电泳法“电泳纯”如SDS3）、免疫化学法“免疫纯”（二）、蛋白质的含量测定1）、凯氏定氮法（Kjedahl法）：测定基础是蛋白质含N量均大约为16%。蛋白质样品经浓硫酸消化，其中的氨转变为硫酸铵，经强碱碱化放出氨，通过水蒸汽蒸馏法蒸出并以硼酸液吸收。最后用标准硫酸溶液滴定，测出释放的氨含量，并计算样品中的氮素含量，再乘以6.25即为样品中蛋白质含量。凯氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法，也是药典规定的方法。2）、福林-酚试剂法（Lowry法）原理：蛋白质与福林-酚试剂呈色反应（实质上是蛋白质分子中含酚基的Tyr）与试剂的显色反应。应用最广泛，灵敏度在ng级。3）、双缩脲法：碱性环境下，铜离子与双缩脲的亚酰胺键反应生成紫红