缺血性中风病差异蛋白质组学研究

缺血性中风病差异蛋白质组学研究

答辩人：刘飞导师：张文生副教授1/13/2023研究背景研究目的研究内容研究价值研究意义主要内容1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究研究背景——中风病概况患者数目庞大死亡人数最多后遗症人口老龄化中风病机理研究治疗预防的前提中风病分为出血性中风病和缺血性中风病两大类，以后者最为常见，约占中风病总数的80％1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究研究背景——缺血性中风病病理缺血损伤早期机理研究是认识缺血性中风病机理，以及开展治疗缺血性中风病药物研究的前提

1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究研究背景——缺血性中风病分子机理蛋白质是缺血性中风病分子机理研究的核心领域。1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究研究背景——技术背景避免了对现有研究成果和研究思路的过分依赖，直接为疾病分子机理研究提供新的研究线索，尤其对于机制比较复杂的疾病，差异蛋白质组学技术“突破性”强的优势表现明显。1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究研究目的缺血后蛋白质表达规律研究还有待于深入研究以大鼠缺血模型为研究对象，通过蛋白质组学技术分析缺血后脑组织蛋白质表达变化，寻找缺血诱导表达变化的蛋白质，以期为缺血性中风病分子机理研究和分子靶标寻找提供线索。

1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究研究内容MCAO模型的建立与评价缺血后脑组织蛋白质的表达研究第一部分第二部分1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究第一部分实验——MCAO模型的建立和评价实验目的：观察MCAO模型的成功率和稳定性成功率稳定性麻醉死亡率缺血死亡率蛛网膜下腔出血发生率神经功能评分脑梗死体积1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究第一部分实验——MCAO模型的建立和评价实验分组：缺血2h、6h、24h和72h四组实验环境：三级动物房关键控制因素：插线的线头直径在0.36-0.38mm之间实验流程SD大鼠行脑缺血手术，术后6h神经功能评分；各个实验组按相应的缺血时间点进行取材和TTC染色实验实验结果统计上述五项指标，以评价模型成功率和稳定性1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究MCAO模型的成功率groupDaDiDhRatioofsuccess2h(N=15)000-6h(N=15)13.3%0066.7%24h(N=15)13.3%20%6.7%46.6%72h(N=18)022.2%038.9%Da：麻醉死亡率；Di：缺血死亡率；Dh：蛛网膜下腔出血发生率.

1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究MCAO模型的稳定性

Fig1-1infarctsize(wholebrain)groupNd2h(N=15)－6h(N=15)1.5424h(N=15)1.6972h(N=18)1.6Nd：神经功能缺损分值1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究小结线头直径在0.36-0.38mm之间，实验结果稳定。水合氯醛麻醉的低线性量和术后24h内缺血死亡是影响成功率主要因素。此外，由于老鼠个体差异，手术本身有一定的失败率。蛛网膜下腔出血和鱼线硬度、线头的光滑以及手感有密切关系，选择合适的鱼线以及熟练手术操作可以有效避免蛛网膜下腔出血。神经功能评分不能完全反映脑梗死状况，间或有神经功能缺损的大鼠，没有梗死出现，所以TTC染色是手术成功与否最可信的指标。1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究图片2h6h24h72h1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究软件分析质谱双向电泳TTC线栓法动物实验生化实验结果分析评分脑组织实验流程第二部分实验——缺血后脑组织蛋白质的表达研究1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究第二部分实验——缺血后脑组织蛋白质的表达研究实验内容：研究缺血6h和24h脑组织蛋白质表达的变化实验分组：每个缺血时间点，13只大鼠随机分为缺血对照组和缺血模型组，缺血对照组4只，缺血模型组9只实验环境：三级动物房筛选模型成功大鼠：神经功能评分和TTC染色研究对象的选取：随机从4只缺血对照组中选取3只大鼠组成缺血对照组，随机从手术成功的缺血模型大鼠中抽取3只大鼠作为缺血模型组。1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究第二部分实验——缺血后脑组织蛋白质的表达研究取材部位：视交叉后3mm-6mm皮层（缺血侧）脑组织处理：大脑分离之后，用10mMTris-HCl冲洗；切离目的脑组织，迅速投入到液氮，后转移到-80℃冰箱；剩余脑组织切为5片，行TTC染色。表达差异蛋白质点筛查原则：缺血对照组和缺血模型组之间稳定的差异表达蛋白质双向电泳图谱分析：专业软件PDQuest7.1.1分析缺血对照组和模型组之间蛋白质表达差异1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究缺血6h双向电泳图谱1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究缺血24h双向电泳图谱1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究脑缺血6h蛋白质差异表达分析结果5个上调蛋白26个下调蛋白Table2-3Partialresults,statisticalanalysisofthedifferentialspotsSpots#(6h)ControlModelModel/Control342775.733±18.897351.366±36.4404.6451151321.833±209.9804729.133±1336.3013.5786205197.4±32.042647.6±144.4003.2816429103.733±15.519382.166±248.0343.6846519216.966±52.580861.766±539.0843.9722462813.3±431.164130.766±84.1520.16134502067.333±1108.87342.4±67.9010.0213457819.466±456.1722.5±1.4520.0033719252.733±118.5592.5±1.4520.014329164.2±53.07645.466±28.1390.27744193251.1±4457.4702.5±1.4520.0014709139.666±86.4442.5±1.4520.018532040.233±45.3762.5±1.4520.0625331194.166±84.51624.366±10.5540.12597211344.5±915.3112.5±1.4520.0021/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究缺血6h差异点分析图示1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究脑缺血24h蛋白质差异表达分析结果5个上调蛋白和13个下调蛋白Tab2-4Partialresults,statisticalanalysisofthedifferentialspotsSpots#(24h)ControlModelModel/Control3124338.6±46.4041521.733±263.5184.4945208228.066±142.7481154.266±374.0935.0616602558.866±255.4514021.866±1063.3817.1967313614.566±249.341140.8±90.2784.36476243334.833±634.9757134.566±1132.8352.1390617871.933±489.95766.333±110.8250.0331412504.9±305.0561.966±1.0780.0033303162.933±83.9011.966±1.0780.0043418623.366±546.3131.966±1.0780.00336291303.333±818.27942.833±70.3860.07642011736±810.262385.266±163.7190.22145221507.333±859.1091.966±1.0780.0015344451.733±58.9951.966±1.0780.004540221901.1±1249.49110900.766±1188.5520.4976438206.933±167.1121.966±1.0780.0091/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究缺血24h差异点分析图示1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究二级质谱鉴定差异表达蛋白质

1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究缺血6h脑组织蛋白质差异点的鉴别

No.AccessEntryMW(Da)Cov.IdentityMS/MS2462Q99NA5IDH3A_RAT4007017％Isocitratedehydrogenasesubunitalpha608.82692.393450P68373TBA6_MOUSE4990920%alphatubulin851.4878.94419XP_147357－3312034%alphatubulin573.65851.465320P07335KCRB_RAT4271233%CreatinekinaseB-type801.92840.035331P62716PP2AB_RAT3614621％Serine/threonine-proteinphosphatase2Acatalyticsubunitbetaisoform828.45896.466205P28073PSB6_RAT2529016%Proteasomesubunitbetatype6542.27586.32555.839721P631021433Z_RAT2777120%14-3-3proteinisoformzeta711.331/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究缺血24h脑组织蛋白质的差异点鉴别No.AccessEntryMW(Da)Cov.IdentityMS/MS0617P631021433Z_RAT2777120%14-3-3proteinisoformzeta-rat711.334201Q9DAK9PHP14_MOUSE1416823%Phosphohistidinephosphatase1679.624522P10719ATPB_RAT5635419%ATPsynthasebetachain544.83605.97756.045323P04764ENOA_RAT4733918%Alpha-enolase980.965402Gi135424TBA6_RAT5059434%alphatubulin573.65851.466438P07335KCRB_RAT4271233%CreatinekinaseB-type801.92840.031/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究总结——缺血后脑组织蛋白质的表达研究脑缺血损伤细胞能量代谢某些细胞生理过程细胞骨架影响1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究总结1：缺血影响细胞能量代谢关键酶的表达

异柠檬酸脱氢酶、烯醇化酶、ATP合成酶和肌酸激酶表达下调异柠檬酸脱氢酶和烯醇化酶是能量代谢主要途径——三羧酸循环的关键酶ATP合成酶是ATP生成主要酶肌酸激酶催化合成磷酸肌酸，产物磷酸肌酸是脑组织能量存储唯一物质脑缺血造成脑组织能量代谢关键酶表达降低，影响脑组织能量正常代谢1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究总结2：缺血影响某些细胞生理关键蛋白表达

丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶2A（PP2A）、磷酸组氨酸蛋白磷酸酯酶1和14-3-3蛋白表达量下降，而蛋白酶体β亚基表达量上升。PP2A、磷酸组氨酸蛋白磷酸酯酶1与蛋白质磷酸化有关14-3-3功能具有广谱性，类似于分子伴侣蛋白酶体在脑缺血损伤中扮演着双重角色缺血造成多种关键蛋白质的表达变化，将导致一些细胞生理过程异常1/13/2023缺血性中风病差异蛋白质组学研究总结3：缺血造成细胞骨架蛋白表达下降

α微管蛋白表达降低

微管在细胞中起着重要的基础作用，维持细胞形态和细胞内运输等。Kumar研究沙土鼠脑缺血再灌注微管蛋白mRNA的表达，发现脑缺血早期6-24h，在海马CA1区α微管蛋白和β微管蛋白的mRNA表达均降低。他认为微管蛋白表达过程和神经细胞死亡过程相一致。