质粒DNA提取鉴定

质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子（补充：部分质粒为RNA）。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。

质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可在宿主细胞中自主复制，并在细胞分裂时传给子代。质粒感染细菌后，会赋予宿主细胞一些遗传性状（如对青霉素或重金属的抗性)可作为筛选转化子细菌的根据。

质粒分类：严紧型（每个细胞1－5个质粒），当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次；松弛型（每个细胞10－200个质粒）。如果用一定的药物处理还会使质粒拷贝数增至几千份。

一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

pBR322质粒(4363bp):主要包括：①限制性内切酶位点（插入外源基因）；②含有terr、ampr抗药基因，可作为筛选标志。③含有复制起始点ori（赋予其复制特性）。四环素抗性基因（Tetr）失活(插入失活法)抗药性标记选择M13噬菌体：

M13mp系列pUC系列

pUC质粒:含E.coli的LacZ的N端146个AA残基的编码基因，编码产物为β半乳糖苷酶的α片段。

Lac－E.coli（突变型宿主细胞）：可表达该酶的ω片段.单独存在的α或ω片段均无活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段，宿主细胞才有β半乳糖苷酶活性，使特异底物产生蓝色化合物（α-互补)。α互补的检测α片段ω片段α片段ω片段本实验：大肠杆菌＋pEC-ct质粒，pEC-ct质粒：8.0kb(6.8kb)

有HindⅢ,BamHⅠ酶切点，可切出CD基因（1.2kb）本实验包括：1.细菌培养和质粒扩增2.菌体收集3.菌体裂解、质粒DNA提取、纯化4.鉴定2人一组[操作]细菌的培养

接种：从-20℃取出菌种，斜面划线接种，37℃培养24h单克隆培养：挑单个菌落，接种于LB培养液中（含Amp50μg/ml)4-6h。菌液0.2ml＋10mlLB培养基（含Amp50μg/ml)37℃培养过夜。周四A.M.10：00每小组来一个代表，在林春兰老师指导下完成。4.扩大培养：培养液3ml,接种于60mL的LB培养液（含Amp50μg/ml),振摇200rpm，37℃(4-6h),使A580＝0.4-0.6。5.加氯霉素：加氯霉素，终浓度40μg/ml，继续培养15-17h.周五P.M.由林春兰老师完成。周五A.M.10:00每小组来一个代表，在林春兰老师指导下完成。周六8:00.去医学院7楼，2人/份1.取6个1.5mlEppendorf管，分别加细菌培养液1.4ml↓9000rpm2-3min

↓↘弃上清2.600μlSTE液依次溶解各管沉淀，合并一管再用200μlSTE液清洗各管，清洗液合并上管（收集菌体）↓

9000rpm2-3min,弃上清（保留菌体）收集菌体3。沉淀悬于200ul溶液I，混匀

↓放置5min

4。加入400ul溶液II，颠倒混匀数十次（20～30次）0.2NNaOH-1%SDS↓放置5min5。加入300ul溶液III，充分混匀（温和操作）↓

10min

沉淀DNAKAc-HAc裂解碱裂解法提取质粒DNARNase12000rpm3min

↓↘弃沉淀

6。将上清转移至另一Eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇(540ul

)，倒转混匀↓室温5min离心12000rpm10min↓↘弃上清沉淀干燥，室温5min↓7。加TE500ul溶解沉淀同时倒胶1%,330ml/小班沉淀质粒去除基因组DNA和蛋白8。加入等体积饱和酚，振摇1min，充分混匀↓12000rpm5min9。将上层水相转移至另一Eppendorf管中，用等体积氯仿-异戊醇抽提，振摇1min，充分混匀↓12000rpm5min10。将上层水相转移至另一Eppendorf管中，加入预冷的2.5倍体积无水乙醇↓-20℃30minLunchtime纯化质粒易错离心12000rpm10min↓↘弃上清沉淀干燥↓11。加入TE30-50-100ul,溶解沉淀（反复吹打至完全溶解）

EP管上做记号质粒的分离、纯化半定量检测浓度酶切电泳鉴定鉴定质粒线性化质粒，电泳后与marker比较，估计质粒大小。线性化：用HindⅢ将质粒酶切、电泳，估计其分子大小。双酶切：用HindⅢ和BamHⅠ将质粒pEC-CT所含的CD基因1.2kb片段切出。鉴定

(质粒分子量、纯度及是否含有所需要DNA段)(一)酶解双酶切体系：单酶切体系：sample5ulsample5ulBamHⅠ1ulHindⅢ1ulHindⅢ1ul10×buffer2.5ul10×buffer2.5ulddH2O15.5ulddH2O16.5ul混匀，离心(瞬时)，37℃1ｈ13。DNA浓度测定

溴乙锭荧光法(半定量法，一大组/板)（1）制备1%琼脂糖凝胶板（塑料平皿中）凝固后待用。（2）点样：

标准ＤＮＡ溶液（Marker：老师加）1.00.50.250.10.050.0250.01ug/ul分别吸取1ul点于制好的琼脂糖平板上样品吸取1ul，滴加于琼脂板上。(3)浓度测定：避光，１小时后，在紫外灯下观察各点荧光强弱，从而估计样品DNA浓度。14。电泳

1.

制胶2.

点样（1）质粒提取液5ul+TE15ul（2）单酶切液25ul（3）双酶切液25ul各加上样液溴酚兰5ul

（4）Marker老师加4小组×3道＝12道Marker1道画示意图3.

电泳

电压：120V2min100V0.5-1.0h待溴酚蓝走至6-7cm左右，终止电泳。观察结果：紫外灯下，照相。markerDL15000:15000,10000,7500,5000,2500,1000,250bp上样液：50％甘油、0.25MEDTA,