O157检验方法的建立及实验室比对结果的报告

GB4789.36-2008

食品卫生微生物学检验

大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验廖兴广

liaoxg@

河南省疾病预防控制中心2009.3.14一、背景任务来源

2.项目负责与协作单位

本标准负责起草单位是中国疾病预防控制中心营养与食品安全所协作单位：河南CDC、浙江CDC、北京CDC、湖北CDC、吉林CDC、上海CIQ3.背景资料认识爆发与流行情况：国际、国内二、标准制订遵循的原则参照美国FDA、美国USDA、北欧食品分析委员会（NMKL）、AOAC的有关标准。结合标准的比对与验证试验结果，吸取快速检测方法，力求科学实用、准确可靠，易于掌握和推广使用。三、国际现状食品中O157:H7大肠杆菌检验的传统方法，FDA/BAM、USDA/BAM、NMKL、CCFRA、AOAC/BAM等均制定了相关及检测方法标准，FDA/BAM、AOAC/BAM、CCFRA方法中将免疫磁珠分离技术作为选用方法，USDA/BAM、NMKL将免疫磁珠分离技术作为指定方法。富集培养基：FDA/BAM使用EHECEnrichmentBroth(EEB)+CCV，USDA/BAM使用mEC+n，NMKL使用mTSB+Nov20mg/l，CCFRA使用BPW-VCC或mEC+n，AOAC/BAM使用mTSB+Nov。分离培养基：FDA/BAM为CT-SMAC、USDA/BAM为Rainbowagar、NMKL为CT-SMAC、CCFRA为SMAC和CT-SMAC、AOAC/BAM为Rainbowagar。分析样品量USDA/BAM为65g，其余为25g。培养温度：NMKL为41.5±0.5℃，USDA/BAM为35±2℃，其余为37℃。质量控制与安全性控制：USDA/BAM四、主要修订内容

本标准第一法修改采用美国FDABacteriologicalAnalyticalManualOnlineChapter4ASeptember2002。第二法修改采用欧洲NMKLNordicCommitteeOnFoodAnalysisNo1641999。第三法修改采用AOAC-RIPerformanceTestedMethodsVIDAS

E.ColiO157（ECO）Test，2005.18。第四法等同采用AOAC-RIPerformanceTestedMethodsBAX®E.ColiO157:H7,2004.3。本标准第一法与美国FDA/BM方法的主要差异如下：—文本的格式、文字描述。—增菌培养基以mEC+nov肉汤替代了EEB＋CCV肉汤。—增加了CHROMagarTMO157显色培养基。—增加了质量控制与生物安全方面的内容描述。本标准第二法与NMKLNordicCommitteeOnFoodAnalysisNo1641999的—文本的格式、文字描述。—增菌培养基以mEC+nov肉汤替代了mTSB肉汤。—修改增菌培养温度41.5℃±0.5℃为36℃±1℃。—增加了CHROMagarTMO157显色培养基。本标准第三法与AOAC-RIPerformanceTestedMethodVIDAS

E.ColiO157（ECO）Test的主要差异如下：—文本的格式、文字描述。—前增菌培养基以mEC+nov肉汤替代了mTSB肉汤。肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验

标准操作程序一、常规方法检样↓25g(mL)+改良EC肉汤(mEC+n）225ml

快速筛选阴性

36±1℃18～24h

阳性报告CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157显色琼脂平板

36±1℃↓18～24h挑取可疑菌落5～10个,氧化酶阴性,革兰氏阴性杆菌接种TSI↓MUG-LST36±1℃18～24h

阳性阴性↓↓非O157菌血清学试验↓生化试验

↓报告操作步骤1增菌以无菌操作取检样25g(mL)加入到含有225mLmEC+n肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1～2

min。于36±1℃培养18～24h。同时做阳性及阴性对照。

CCP:无菌操作，阴阳行对照避免交叉污染。2.分离取增菌后或筛选试验阳性的mEC+n肉汤，分别划线或适当稀释后取0.1mL涂布接种于CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157显色琼脂平板上，于36±1℃培养18～24h，观察菌落。必要时将混合菌落分纯。在CT-SMAC平板上，发酵山梨醇的菌落为红色；典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色，用接种针挑起时无拉丝现象。在改良CHROMagarO157显色琼脂平板上为圆形、较小的菌落，中心呈淡紫色-紫红色，边缘无色或浅灰色。CCP:增菌后的肉汤在取样前，应轻微摇晃混匀。划线时应多次往返，保证分离效果。涂布时应适当稀释。注意区分典型菌落，必要十分纯。大部分非O157E.coli发酵山梨醇，仍有6%不发酵山梨醇，它们与摩根氏菌和哈夫尼亚菌一样在TC-SMAC上表现为与O157相同的菌落特征。3.初步生化试验在CT-SMAC和改良CHROMagarO157显色琼脂平板上挑取5～10个典型或可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，于36±1℃培养18～24h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色，产气或不产气，不产生H2S。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察，阳性对照应无荧光产生，阴性对照应有荧光；对分解乳糖且无荧光的菌株，在营养琼脂平板上分纯，于36±1℃培养18～24h，并进行下列鉴定。CCP:菌落选择：挑取典型菌落，数量在5个以上，尽量多挑。注意混合菌落的识别，进行分纯后挑去。在观察MUG实验时，与阴性、阳性对照一起观察，应带上防紫外线的护目镜，注意紫外线对眼镜的伤害

。4.鉴定4.1血清学试验在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，用O157:H7标准血清或O157乳胶凝集试剂作玻片凝集试验。血清凝集试验应做生理盐水对照。对于H7因子血清不凝集者，应穿刺接种半固体琼脂管，检查动力，经连续传代3次，动力试验阴性，H7因子血清凝集阴性者，确定为无动力株。CCP:先做O157血清凝集，后做H7因子凝集，注意自凝菌，用生理盐水做对照。4.2生化试验用API20E或VITEK-GNI+或其它肠杆菌科生化鉴定试剂盒，按照生产商提供的使用说明进行。CCP:进行生化试验时应是用新鲜培养物（24h）。菌液的稀释应注意无菌操作，浊度应达到使用说明的要求。二、免疫磁珠捕获法检样↓25g(mL)+改良EC肉汤(mEC+n）225ml

快速筛选阴性

36±1℃18～24h

阳性报告免疫磁珠捕获CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157显色琼脂平板

36±1℃↓18～24h挑取可疑菌落5～10个,氧化酶阴性,革兰氏阴性杆菌接种TSI↓MUG-LST36±1℃18～24h

阳性阴性↓↓非O157菌血清学试验↓生化试验

↓报告操作步骤1.增菌：同常规法。2.磁珠分离：2.1将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1只Eppendorff管，然后插入到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每个Eppendorff管的盖子，每管加入20μL

E.coliO157免疫磁珠悬液。CCP：磁珠在加入前在混旋器上短暂混匀，不可剧烈震荡，避免产生泡沫。

2.2取mEC+n肉汤增菌培养物1mL，加入到Eppendorff管中，盖上盖子，然后轻微振荡10s。每个样品更换1只加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。

CCP:取样前混匀，避开脂肪层与杂质，必要时使用滤网。

加样后立即混匀。对照同时做。

2.3结合：在18～30℃环境中，将上述Eppendorff管连同磁板架放在适合的装置上转动或用手轻微转动10min，使E.coliO157与免疫磁珠充分接触。

CCP：注意室内温度，保证结合时间。结合时不要将磁铁插入到磁板架中。

用手转动时应轻轻颠倒Eppendorff管架，不可剧烈摇动。保证磁珠与O157的结合。2.4捕获：将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不断地倾斜磁板架，确保悬液中和盖子上的免疫磁珠全部被收集起来，此时，在Eppendorff管壁中间明显可见的圆形或椭圆形棕色聚物。2.5吸取上清液：取1支灭菌的加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深入液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠积聚物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到Eppendorff管中，并重复2.4步骤。每个样品换用1支加长吸管。免疫磁珠的滑落：某些样品特别是那些富含脂肪的样品，其磁珠积聚物易于滑落到管底。在吸取上清液时，很难做到不丢失磁珠，在这种情况下，可保留50～100μL上清液于Eppendorff管中。如果在后续的洗涤过程中也这样做的话，脂肪的影响将减小，也可达到充分捕获的目的。2.6洗涤：从磁板架上移走磁板，在每个Eppendorff中加入1mLPBS-Tween20洗液，转动磁板架3次以上，洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤2.4～2.6。2.7重复上述步骤2.4～2.5CCP:洗涤共3次，动作要轻柔。吸取上清液至磁珠聚集物处时，应放慢速度。上清液的吸取应尽量完全。使用多块磁珠分离装置时，磁铁与磁铁应远离放置。

2.8免疫磁珠悬浮：移走磁板，将免疫磁珠重新悬浮在100μLPBS-Tween20洗液中。

2.9涂布平板用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157显色琼脂平板一侧，然后用涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于36±1℃培养18～24h。注意，若CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157显色琼脂平板表面水分过多时，应在37℃下干燥10～20min，涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。2.10菌落识别、初步生化试验、鉴定同常规法。五、第一法与美国FDA方法比较实验设计

－样品的选择：生猪肉馅、生菜。

－样品的染菌：将样品充分混匀，称取25g样品，加入O157:H7标准菌株（ATCC43888）生理盐水悬液，染菌样品的各种浓度见表1。

－实验操作：大肠埃希氏菌O157:H7检验SOP。

－结果判断：大肠埃希氏菌O157:H7常规检验方法与美国FDA方法、免疫磁珠捕获方法与NMKL方法进行两两配对检验，经统计学的方法Chi-squareTest（X2检验）进行分析。结果表1常规法与美国FDA方法检出率的比较表产品类别方

法0.5cfu/g1cfu/g5cfu/g合

计样品数检出率(％)P值样品数检出率(％)P值样品数检出率(％)P值样品数检出率(％)P值肉类常规法6561.50.8566587.70.7956595.40.69819581.50.897美国FDA法6563.16586.26593.819581.0蔬菜类常规法6558.50.8596586.20.6276592.30.73019579.00.805美国FDA法6557.96582.96593.819577.9总计常规法13060.01.00013086.90.59413093.81.00039080.30.789美国FDA法13060.013084.613093.839079.0

结论常规法与美国FDA法比较，分生肉类和蔬菜类两类样品进行检验，染菌量在0.5cfu/g、1cfu/g、5cfu/g时，检出率比较P值范围在0.594～1.000，均大于0.05，无显著性差异。六、免疫磁珠捕获方法与NMKL方法的比较

产品类别方

法0.1cfu/g0.5cfu/g1cfu/g合

计样品数检出率(％)P值样品数检出率(％)P值样品数检出率(％)P值样品数检出率(％)P值肉类磁珠法6572.30.6906590.80.2866592.30.46519585.11.000NMKL法6575.46584.66595.419585.1蔬菜类磁珠法6572.30.8466587.70.5716590.81.00019583.60.891NMKL法6570.86590.86590.819584.1总计磁珠法13041.50.87913089.20.69813091.50.64239084.40.921NMKL法13042.313087.713093.139084.6表2磁珠法与NMKL方法的比较表结论磁珠法与NMKL法比较，分生肉类和蔬菜类两类样品进行检验，染菌量在0.1cfu/g、0.5cfu/g、1cfu/g时，检出率比较：P值范围在0.286～1.000，均大于0.05，无显著性差异。七、增菌培养温度对结果的影响选择36和42℃进行比较（常规法）样品种类样品份数加入菌量

cfu/25g36℃42℃阳性数阳性率％阳性数阳性率％生猪肉51.25120120512.5360360香菜51.25360240512.551005100八、不同培养基分离效果CT-SMAC：菌落较大，存在较多的山梨醇发酵阴性的细菌菌落生长，干扰O157的检出。CHROMagarO157：较多的非O157菌落生长，菌落较大，影响O157菌的检出改良CHROMagarO157：非O157细菌生长较少且菌落相对局限，O157菌落特征性明显。九、O157检验方法的条件优化1.增菌培养基：国际上采用的为mEC+n、mTSB+n、EHECEnrichmentBroth(EEB＝TSB)+CCV、BPW-VCC。通过比较，mEC与mTSB差异不大，且为我国“污染物监测网”和“全国肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻”检测中普遍使用。2.增菌培养温度：国际方法中有3个培养温度：NMKL为41.5±0.5℃、USDA/BAM为35±2℃，其余为37℃。实验结果表明，在41.5±0.5℃时，温度作为一个选择性因子，能够抑制杂菌丛的生长，但