蛋白质的折叠Folding 生物物理学课件

第四章蛋白质的折叠(Folding)生物物理学课件蛋白质折叠问题为什么会称为

当今生物学领域中的研究热点之一？破译生命的另一半遗传密码，完善中心法则蛋白质分子设计及蛋白质工程的需要越来越多的基因工程产物需要复性复活，要求蛋白质折叠的理论及技术作为指导5

加德赛克在新几内亚岛发现了一种奇怪的疾病，当地的土著人称之为“kuru”。由于找不到病因，被当地人称为“终极巫术”。

Kuru在当地的含义是颤抖，因某种未知的寒冷或恐惧而颤抖。一旦Kuru的颤抖开始，就不可逆转，诅咒会越来越烈，直至死亡为止。Kuru的诅咒非常残酷：先是不可抑制的颤抖，然后丧失行走能力及无法言语，接着瘫痪。但中了巫术的人至死心智都很清醒，不会陷入昏睡状态，因此格外痛苦。研究背景6卡里顿·加德赛克

美国国立卫生研究院病毒和神经研究室主任，因发现神经性传染性疾病的新病因和传播新机制而获得1976年诺贝尔医学/生理学奖。7牛胰核糖核酸酶的一级结构二硫键8变性剂巯基乙醇复性牛胰核糖核酸酶的变性和复性9

蛋白质的变性作用(Denaturation)

蛋白质分子受到某些物理因素如热、紫外照射、高压和表面张力等或化学因素如有机溶剂、脲、盐酸胍、酸、碱等的影响，会发生一些性质上的变化，如生物活性的丧失，一些内埋的侧链基团的暴露，溶解度、粘度、扩散系数以及其他的一些物理化学性质的改变，分子结构松散，易于被蛋白酶水解，这一现象称为蛋白质的变性作用。

蛋白质的变性的概念是由我国科学家吴宪提出的。蛋白质变性的实质就是蛋白质分子的次级键被破坏，引起天然构象的解体。变性作用并不涉及共价健的破裂，一级结构保持完好。

10非天然态的蛋白质的重要作用蛋白质的折叠和稳定性

由于稳定性表示的是天然态和去折叠态之间自由能的差别，因此蛋白质的变性态和天然态在确定蛋白的稳定性方面具有同等重要的意义。在细胞和组织内，天然态与变性态蛋白之间存在着一个动态平衡，这一平衡对于维持细胞的正常生理功能具有重要意义。蛋白质的跨膜运输在翻译和折叠之后，要穿过磷脂双分子层，一些蛋白质分子必须先变成部分或完全去折叠的状态，这一过程或者是自发进行的，或者是在“去折叠酶”的帮助下进行的。蛋白质的水解和更新

大量的研究工作表明，无论是在生理条件下还是在应急状态(如热休克状态)下，去折更态的蛋白质是降解酶的主要靶蛋白。11蛋白质去折叠态的性质

在强变性剂存在下(如6mol／L胍或8mol／L脲)或在极端的pH环境中，许多去折叠的蛋白质会转变为无规卷曲的多肽链，它具有无规卷曲多肽链通常所具有流体动力学、物理学及热力学特性。

在一定的条件下，许多蛋白质处于既不是完全地折叠也不是完全地去折叠状态，它们的这种状态被称为熔球中间态（moltenglobulestate）。12熔球中间态Theimagestotheleftshowthestructureofthemoltenglobuleofcytochromeb562[A]andthestructureofthecytochrome’snativestate[B].(Albertsetal,1994)13（１）多肽链的尺寸比无规卷曲小得多，略大于完全折叠态；（２）由远紫外CD测得的二级结构的平均组成同折叠态相似；（３）由近紫外CD与NMR可测得其侧链处于均一的环境中，与之相反的是，完全折叠态内部各侧链处于不同的、非对称的环境中；熔球中间态的最普遍特征14熔球中间态的最普遍特征（４）许多酰胺基与溶剂交换氢原子的速度比折叠态要快，比去折叠态要慢；（５）熔球中间态的焓十分接近于完全去折叠状态，与折叠态差别较大；（６）熔球中间态同完全去折叠态之间的互变是迅速而非协同的，它同完全折叠态之间的互变是缓慢而协同的。15蛋白质折叠研究的概况20世纪60年代，安芬森（Anfinsen）基于还原变性的牛胰RNase的研究提出“自组装学说”Ellis于1987年提出了蛋白质折叠的“辅助性组装学说”。

mRNA的二级结构可能作为一种遗传密码从而影响蛋白质结构的假说那么，蛋白质的氨基酸序列究竟是如何确定其空间构象的呢？16Anfinsen'sdogma按照自组装学说,一级结构决定空间结构的密码叫作“第二遗传密码”。按照自组装学说,每个蛋白多肽翻译从基因序列开始生成线性的氨基酸链，这种多肽没有三维结构。然而链中氨基酸具有总的化学特征：疏水的，亲水性，或带电，可被认为蛋白质折叠机制按照自组装学说,每一步折叠都是正确的，充分的，必要的。实际上折叠过程是一个正确和错误途径相互竞争过程。边合成边折叠同时进行的协调的动态过程。17第二遗传密码的特点1、简并性在第一遗传密码中有所谓“简并性”，即同一AA可以由不同密码子所编码，如CGA和AGC

都编码为Arg，UCC和AGU都编码为Ser等。第二密码也同样有简并性。现在已经知道有很多氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的空间结构，这就是第二密码的简并性。18简并性的证据不同生物体中执行相同功能的蛋白质有AA序列上的差异,但却有相同的整体空间结构。例如：线粒体Cytc的AA序列已经测定，AA残基数均在104左右,但仅在21个位置上的AA在不同生物体的Cytc是完全相同的，但是所有Cytc的整体空间结构却是非常相似的。另外，两个在功能上完全无关的蛋白质，卵类黏蛋白的第三结构域和核糖体结构蛋白L7/L12的C-末端部分在AA序列上仅有3%相同,却具有几乎完全相同的空间结构。192、化学修饰改变侧链性质，包括大小、极性、电荷、氢键形成能力等的影响。晶体衍射结构分析的结果表明：在分子内部引入大小不同的疏水基团的结果，只不过是使某些侧链基团在位置上有所重排，但并不影响分子的总体结构。203、定点突变研究定点突变技术的建立为蛋白质结构功能关系研究提供了极大的方便。例如：金黄色葡萄球菌核酸酶是研究得最多的蛋白之一。结果表明：某些个别键的破坏并不能对结构起到决定性的作用，所以个别残基的单独替换不会对分子的总体构象产生明显的影响。甚至把整段序列用相同残基构成的序列所取代，生物活性都没有明显影响。214、多意性某些相同的氨基酸序列还可以在不同条件下决定不同的空间结构，这种情况可以称之为第二遗传密码的多意性。例如，Prusiner对天然型和感染型朊病毒(prion)的研究。天然型朊病毒(PrPc)在正常动物体内存在,不导致疾病,而感染型的朊病毒(PrPSC)则导致某些神经性疾病,并导致天然型朊病毒转变为感染型的朊病毒。初步研究表明天然型朊病毒主要为α-螺旋结构,而感染型的朊病毒却主要为β-折叠结构。225、全局性第二密码必须把蛋白分子作为一个全局来考虑，这就从根本上决定了第二密码的复杂性，它不可能像第一密码那样有简单的一对一的关系。某些蛋白C-末端少数氨基酸的去除,或侧链基团的翻译后修饰，有时都可以对整体构象和功能产生重大影响。23在新生肽链合成过程中，后形成的肽段可以影响已经形成的肽段的构象从而造成对分子整体的影响。以上这些情况可以称之为第二密码的全局性，全局性决定了第二密码的复杂性。第二密码的全局性还体现在环境对分子结构的影响上，水分子对于维系蛋白质一定的空间结构有重要作用。24蛋白质折叠的研究内容蛋白质折叠的研究，狭义的定义就是研究蛋白质特定三维空间结构形成的规律、稳定性及与其生物活性的关系。在概念上有热力学的问题和动力学的问题；蛋白质在体外折叠和在细胞内折叠的问题；有理论研究和实验研究的问题。25蛋白质折叠与生物信息流在生物体内，生物信息流动可分为两个部分：第一部分是存储于DNA序列中的遗传信息通过转录和翻译传入蛋白质的一级序列中，这是一维信息之间的传递，三联子密码介导了这一传递过程第二部分是肽链经过疏水塌缩、空间盘曲、侧链聚集等折叠过程形成蛋白质的天然构象，同时获得生物活性，从而将生命信息表达出来蛋白质折叠是一维信息向三维信息的转化过程26细胞内的蛋白质折叠

体内折叠过程往往与翻译共启始，因此，N-末端蛋白开始折

叠，而C-末端部分仍在合成。

氨基酸序列与折叠密切相关。

化学修饰往往与肽链的折叠密切相关。

折叠是有序的、由疏水力推动的协同过程。

最近的理论提出了蛋白质折叠氢键的贡献。

伴侣分子在折叠中起着辅助性的作用。

折叠在越膜转运过程中：解开折叠后才能越膜。27蛋白质折叠的途径

独立折叠

热休克蛋白70辅助蛋白质折叠HSP70和伴侣协助配合下折叠28蛋白质折叠的理论模型框架模型（FrameworkModel）疏水塌缩模型（HydrophobicCollapseModel）扩散-碰撞-粘合机制（Diffusion-Collision-AdhesionModel）成核-凝聚-生长模型（Nuclear-Condensation-GrowthModel）拼版模型（Jig-SawPuzzleModel）29框架模型（FrameworkModel）

蛋白质局部构象依赖于局部的氨基酸序列

在多折叠的起始阶段,先迅速形成不稳定的二级结构单元，称为“flickeringcluster”。

随后二级结构靠近,形成稳定的二级结构框架最后二级结构框架相互拼接，渐紧缩，形成三级结构。

这个模型认为即使是一个小分子的蛋白也可以一部分一部分的进行折叠,其间形成的亚结构域是折叠中间体的重要结构。30疏水塌缩模型

（HydrophobicCollapseModel）

在疏水塌缩模型中，疏水作用力被认为是在蛋白质折叠过程中起决定性作用的力的因素。在形成任何二级结构和三级结构之前首先发生很快的非特异性的疏水塌缩。31扩散-碰撞-粘合机制

Diffusion-Collision-AdhesionModel）

蛋白质的折叠起始于伸展肽链上的几个位点，在这些位点上生成不稳定的二级结构单元或疏水簇，主要依靠局部序列（3-4个残基）相互作用来维系。疏水簇以非特异性布朗运动方式扩散、碰撞、相互黏附，导致大的结构生成并增加稳定性。进一步碰撞形成具有疏水核心和二级结构的类熔球态中间体。球形中间体调整为致密的、无活性的类似天然结构的高度有序熔球态结构。最后无活性高度有序熔球态转变为完整有活力的天然态。32成核-凝聚-生长模型

（Nuclear-Condensation-GrowthModel）肽链中的某一区域可以形成“折叠晶核”，以它们为核心，整个肽链继续折叠进而获得天然构象。所谓“晶核”实际上是由一些特殊的氨基酸残基形成的类似于天然态相互作用的网络结构，这些残基间不是以非特异的疏水作用维系的，而是由特异的相互作用使这些残基形成了紧密堆积。晶核的形成是折叠起始阶段限速步骤。33拼版模型

（Jig-SawPuzzleModel）多肽链可以沿多条不同的途径进行折叠,在沿每条途径折叠的过程中都是天然结构越来越多,最终形成天然构象每条途径的折叠速度都较快,与单一途径折叠方式相比,多肽链速度较快,另一方面,外界生理生化环境的微小变化或突变等因素可能会给单一折叠途径造成较大的影响这些变化可能给某条折叠途径带来影响,但不影响另外的折叠途径,因而不会从总体上干扰多肽链的折叠34

分子伴侣（chaperon）概念：伴随蛋白质构象正确形成的一类蛋白质。类别：分子伴侣蛋白折叠酶DNA分子伴侣功能：①结合疏水基团②校正③指导二硫键正确配对等35分子伴侣提出1987，Lasky首先将细胞核内能与组蛋白结合并能介导核小体有序组装的核质素（nucleoplasmin）称为分子伴侣。1987

Ellis的定义，一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，在细胞内帮助其他多肽完成正确组装，而在组装完后与之分离1987年，Ikemura发现枯草杆菌素的折叠需要前肽（propeptide）的帮助。Shinde和Inouye将这类前肽称为分子内伴侣（intramolecularchaperones）。36分子伴侣的特征分子伴侣对靶蛋白没有高度专一性，同一分子伴侣可以促进多种氨基酸序列完全不同的多肽链折叠成为空间结构。蛋白质性质和功能都不相关。催化效率很低。需要水解ATP，构象改变，释放底物，进行再循环。它是阻止错误折叠多能性（胁迫保护，防止交联聚沉，转运，调节转录和复制，组装细胞骨架）进化保守性

37分子伴侣的作用机制分子伴侣的功能是识别新生肽段折叠过程中暂时暴露的错误结构并与之结合生成复和物，从而防止这些表面间过早的相互作用，阻止不正确的非功能折叠途径，抑制不可逆聚合物产生，促进折叠向正确方向进行。分子伴侣的作用机制实际上就是它如何与靶蛋白识别，结合，又解离的机制。38分子伴侣的作用过程分子伴侣作用的第一步是识别。一般的分子伴侣识别特异性不高，识别非天然构象，而不是天然的构象。有的分子伴侣-“私有分子伴侣”

具高度专一性。分子伴侣识别所谓熔球体结构（moltenglobule），熔球体可能是有疏水表面。分子伴侣作用的第二步是与靶蛋白形成复合物。分子伴侣常以多聚体形式形成中心空洞的结构，电子显微镜已观察到由二圈圆面包圈形组成的十四体groel分子和一个一层圆面包圈的七体groES分子作用形成中空的非对称笼状结构（cage

model），推测靶蛋白可以在与周围环境隔离的中间空腔内不受干扰的进一步折叠。39帮助蛋白质折叠的酶帮助蛋白质折叠的酶目前只有两个：蛋白质二硫键异构酶(protein

disulfide

isomerasePDI);

肽基脯氨酸顺反异构酶(peptidylprolylcis-transisomerase，PPI)。40热休克蛋白热休克蛋白HeatShockProteins(HSPs),是细胞在应激原特别是高温诱导下生成的一组蛋白质。广泛存在各生物中。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。按照蛋白的大小共分为五类，分别为HSP100，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子热休克蛋白。HSP分子量都在80～110kD、68～74kD和18～30kD之间。不同分子量的HSP在细胞内的分布也有所不同。HSP一个重要特点是进化的高度保守性。41热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用——结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠。形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。

HSP40结合待折叠多肽片段HSP70-ATP复合物

HSP40-HSP70-ADP-多肽复合物

ATP水解GrpEATPADP复合物解离，释出多肽链片段进行正确折叠

42伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程

伴侣素的主要作用——为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。43蛋白质折叠研究技术研究表明：每种蛋白质都用自身偏好的方式进行折叠。某些蛋白质可在十亿分之几秒内折叠起来，某些则要耗费数毫秒才能卷缩成首选结构。由于蛋白质折叠如此之快，所以对其研究很困难。费城宾夕法尼亚大学FengGai研究组创造出极简单的蛋白质，可折叠成最普通的螺旋。对蛋白质上氨基酸用C13标记，将它们放入水浴并用激光照射整个系统。激光对蛋白质加热十亿分之三秒，使其打开折叠。然后在重新折叠时用红外光谱观察C13和其他原子间化学键的变化情况。记录一段“延长了的”信号，表明蛋白质以不同的速度不同的途径进行折叠。Weizmann研究小组将蛋白“诱骗”到由脂质构成的小泡中，小泡约100纳米宽，蛋白质在小泡中可自由移动，能够被聚焦的激光束完全照射到（激光束约为300纳米宽）。研究证明即使最终形状一样的蛋白质也通过不同路线折叠。44多种技术结合：光谱学，波谱学和x

射线分析。快速核磁共振技术已经能够在秒到皮秒的时间域上观察蛋白质结构的运动过程，其中包括主链和侧链的运动，以及在各种不同的温度和压力下蛋白质的折叠和去折叠过程。快速光谱技术（荧光，远紫外和近紫外圆二色蛋白质折叠研究技术45蛋白质折叠病

人们对由于基因突变造成蛋白质分子中仅仅一个氨基酸残基的变化就引起疾病的情况已有所了解，即所谓“分子病”，如地中海镰刀状红血球贫血症就是因为血红蛋白分子中第六位的谷氨酸突变成了颉氨酸。现在则发现蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，只是其结构或者说构象有所改变也能引起疾病，那就是所谓“构象病”，或称“折叠病”。

47蛋白质正确折叠，功能正常；蛋白质错误折叠，疾病产生。48有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病（Creutzfeldt-Jakobdisease,CJD）、老年痴呆症（Alzheimer‘s）、亨廷顿舞蹈病(Huntington’sdisease,HD)、疯牛病等等。49疯牛病牛海绵状脑病(bovinespongiformencephalopathy,BSE):

俗称疯牛病(madcowdisease):1986年首次在英国报道。该病潜伏期4～5年，发病初期表现为体质变差，体重减轻，产奶量下降等非特异性症状。随后神经系统症状逐步明显，出现小脑共济失调、震颤等，由于病牛常表现出感觉过敏、恐惧甚至狂乱，因此俗称“疯牛病”。50疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病51淀粉样蛋白病（AmyloidDiseases）

老年痴呆症（Alzheimer's

disease）

在患AD病人的脑中，塞满了由错误折叠蛋白质形成的杂乱的蛋白质簇。通常有两类蛋白质的沉积：含有淀粉样β蛋白（Aβ）的淀粉样斑，和由tau蛋白引起的神经细胞内自损伤。

Aβ和tau蛋白都是由在脑中正常产生的蛋白质转化而来的。

老年斑

神经原纤维缠结52瑞典的研究者们发现，锌离子，可能作为一种伴侣分子，能够有效降低β淀粉样蛋白的聚集。锌离子可以通过结合在β淀粉样蛋白纤维N端，形成短时性的稳定复合体，这种复合体可以明显有效阻碍这种蛋白的纤维化聚集。53

通过核磁共振弛豫分散方法和荧光动力学方法，他们发现锌离子可以短暂结合在纤维状的β淀粉样蛋白颗粒N端，导致了一种新的形态的Aβ淀粉样蛋白。

帕金森氏病（ParkinsonsDisease

）

研究表明ParkinsonsDisease病可能源于蛋白质的错误折叠。其原因和发生的途径尚不清楚。

在PD病人的脑中通常可以发现一些蛋白沉积物称为路易氏体（Lewybody）的包涵体，这些结构被认为是PD形成的病理学标志。

54肺气肿（emphysema）

常见的肺部疾病，部分病因是由于肝脏产生的α1-抗胰蛋白酶蛋白的突变。有缺陷的α1-抗胰蛋白酶以错误折叠的形式聚集在肝脏中，不能执行正常的保护肺脏的功能。蛋白质积聚在肝脏也引起肝脏的损伤。55研究蛋白质折叠的意义蛋白质折叠机制的阐明将揭示生命体内的第二套遗传密码，这是它的理论意义。蛋白质高级结构的预测56蛋白质折叠研究的潜在应用前景

折叠机制的阐明对包涵体的复性会有重要帮助。按照自己意愿设计我们需要的、具有特定功能的蛋白质。

57蛋白质折叠研究的潜在应用前景深入了解蛋白质折叠与错误折叠的关系对于某些疾病的致病机制的阐明以及治疗方法的寻找将大有帮助。基因组序列的发展使我们得到了大量的蛋白质序列，结构信息的获得对于揭示它们的生物学功能是十分重要的。

58质量控制系统-滞留

许多编码基因的细微突变如点突变或个别氨基酸的缺失，编码蛋白还具有绝大部分生物活性，只是出现蛋白产物极细微的折叠异常，却可导致疾病的发生。部分原因是“质控系统”在发挥作用：蛋白产物极细微的折叠异常，虽然对活性影响不大，却可以被分子伴侣等识别而滞留在内质网，不能实现正常的转位、转运或分泌，从而不能到达生理位置执行正常的功能，导致疾病发生。59蛋白质折叠的原理Ellis1987年提出了蛋白质“辅助性组装学说”。体内蛋白质折叠往往需要其他辅助因子参与，并伴有ATP的水解。因此，蛋白质折叠是一个热力学过程，也受动力学控制。有的学者基于有些相似氨基酸序列的蛋白质具有不同的折叠结构，而一些不同氨基酸序列的蛋白质在结构上却相似的现象，提出了mRNA二级结构可能作为一种遗传密码从而影响蛋白质结构的假说。目前为止，对蛋白质折叠机制的认识仍是不完整的，甚至有些方面还存在着错误的观点。60

大蛋白的折叠大蛋白分子是由多结构域、多亚基或二者联合组成。蛋白质水解可以切下每一个结构域，或通过蛋白质工程方法获得相应的片段。在许多情况下，分离的结构域和完整蛋白一样具有相同的稳定性，而且每个结构域在完整蛋白质上是独立的结构单位。独立的结构域象单结构域蛋白质一样去折叠和再折叠，在不同条件下，蛋白质折叠时会产生复杂的去折叠曲线。蛋白质结构域是同一个分子的组成部分时，结构域之间相互作用程度有所变化。如果这些相互作用彼此是促进稳定的，那么分离结构域相应的稳定性会差一些。当蛋白质的分离结构域独立稳定时，天然多结构域蛋白质的折叠顺序是单独的结构域自己先折叠，然后每个折叠后的结构域在相互结合产生完整的多结构域蛋白质。61蛋白质折叠的研究内容最根本的科学问题就是多肽链的一级结构到底如何决定它的空间结构？既然前者决定后者，一级结构和空间结构之间肯定存在某种确定的关系，这是否也像核苷酸通过“三联密码”决定氨基酸顺序那样有一套密码呢？后来，有人把这设想的一级结构决定空间结构的密码叫作“第二遗传密码”。62分子伴侣研究的应用分子伴侣的研究成果必然会大大加深我们对生命现象的认识。由于分子伴侣在生命活动的各个层次都具有重要作用，它的突变和损伤也必定会引起疾病，因此可以期望运用分子伴侣的知识来治疗所谓的”分子伴侣病”。利用对分子伴侣的研究成果从根本上提高基因工程和蛋白工程的成功率。63神经退性变疾病的致病机理神经退性变疾病的典型特点是选择性的神经元丢失、突触改变和神经元炎症，不同的疾病在脑内的受累区域不同，从而导致临床表现不相同。关于神经元丢失被认为是程序性细胞死亡所致，现有三种假说用以解释这一现象。一是被广泛接受的获得性毒性假说，认为蛋白质的错误折叠和聚集使其获得了神经毒性。二是炎症假