酶的活性调节

第十章酶的作用机制和酶的调节酶的活性中心一、酶的活性部位（activesite）一、酶的活性部位（activesite）（一）概念

●活性部位(activesite)或活性中心(activecenter)：酶是蛋白质，是大分子化合物，在这样一个大分子中只有一小部分是与底物结合，并与催化作用直接有关，即与酶活力直接相关的区域称为酶的活性部位。

酶的活性部位是酶分子进行催化反应的一个场所，是酶分子的一小部分区域，在这个区域上的少数几个特异的氨基酸参与结合底物催化底物，把酶分子上的这个区域称为酶的活性部位。结合部位负责酶与底物的结合,决定酶的专一性活性部位催化部位负责催化底物，决定酶的催化能力。对需要辅酶的酶来说，辅酶分子，或辅酶分子的上的一部分结构，也是酶活性部位的组成部分。1．结合部位Bindingsite酶分子中与底物结合的部位。决定酶的专一性.2．催化部位catalyticsite酶分子中促使底物发生化学变化的部位催化部位,决定酶所催化反应的性质。（二）E的活性中心特点1几个氨基酸残基，1％〜2％酶分子体积3842三维实体3表面或接近表面

裂缝(crevice)

疏水区域4柔性或可运动性

E诱导契合和S底物的形变

5ES是由次级键形成384(二)E的活性中心特点酶的活性中心示意图酶的结构

结合部位

活性中心

必需基团催化部位酶的结构活性中心以外的必需基团

其它部分

调控基团必需基团(essentialgroup)酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。1酶分子侧链基团的化学修饰法修饰剂（非特异性、特异性，如DFP、亲和标记试剂）

与酶共价结合使酶活性降低或丧失酶蛋白水解

分离含标记片段确定aa序列和被标记aa的位置2动力学参数测定法：测催化反应速度、Km、Vmax、Ki等3空间结构研究方法：

X-射线衍射、核磁共振、CD光谱4定点诱变(site-directedmutagenesis)法：

通过基因突变，了解酶蛋白的结构变化385(三)研究E活性中心方法二酶催化反应的独特性质

387

酶如何有如此很高的催化能力呢?酶降低了反应物分子活化时所需的能量中间络合物学说:首先酶(E)与底物（S）结合，生成不稳定的中间产物(ES)，然后中间产物再分解成产物（P），并释放出酶(E)

酶介入了反应过程。通过形成不稳定的过渡态中间复合物，使原本一步进行的反应分为两步进行，而两步反应都只需较少的能量活化。从而使整个反应的活化能降低。

酶为什么能降低反应的活化能呢?酶与底物结合成中间络合物，使分子间的反应转变为分子内反应。底物分子从稀溶液中密集到活性中心区，并使活性中心的催化基团与底物的反应基团之间正确定向排列所产生的效应。（一）、邻近效应、定向效应三影响酶催化效率的有关因素：388酶AB邻近效应：

ES中,底物的分子基团及酶的催化基团之间互相靠近。定向效应:

ES中,酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确定向。388酶与底物形成复合物之后,底物分子集中于酶的活性中心，大大提高这个区域底物的有效浓度，从而加速酶促反应速度。底物和酶的邻近效应曾测过某酶促反应中，溶液中的底物浓度为0.001mol/L,而在活性中心的底物浓度竟达到10mol/L，比溶液中高出一万倍！因此在酶活性中心区域的高底物浓度决定了高的反应速度在化学反应中，反应速度与反应物的浓度成正比，若在酶促反应系统中的催化场所—酶的活性中心，增加底物浓度，反应速度也会随之增加。388

仅仅是靠近还不够，还需要底物的反应基团之间、酶和底物的反应基团在反应中彼此相互严格地定向，只有既靠近又定向，底物分子才能迅速的形成过渡态，加速反应的进行。

靠近与定向A.酶的催化基团和底物的反应基团既不靠近，也不定向。B.两个基团靠近，但不定向，不利于反应进行。C.两个基团既靠近，又定向，有利于反应进行。389在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。酶底物同时形变产物三影响酶催化效率的有关因素（二）.底物的形变和诱导契合酶与底物结合后，酶分子中的某些基团或离子可以使底物敏感键中的某些基团的电子云密度增加或降低，从而产生电子张力，使敏感键的一端更加敏感，底物发生变形.底物比较接近它的过渡态，降低了活化能，使酶促反应加速。

（二）.底物的形变和诱导契合389酶与底物的结合，不仅酶分子发生构象变化，同样底物分子也会发生扭曲形变，从而形成一个互相契合的ES复合物，进一步转换成过渡态。大大增加了反应速度三影响酶催化效率的有关因素390（三）、酸碱催化三影响酶催化效率的有关因素

酶活性中心的一些基团作为质子的供体或质子的受体对底物进行广义的酸碱催化。广义酸基团广义碱基团（质子供体）（质子受体）

酶分子中可以作为广义酸、碱的基团390His是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。组氨酸的咪唑基是酶的酸碱催化作用最有效、最活泼的催化功能基团。咪唑基的pk=6.0,在生理pH条件下，有一半以酸性形式存在，另一半以碱性形式存在，因此既可以作质子的供体又可以作质子的受体，在酶促反应中发挥作用。390

共价催化的一般形式是酶活性中心上的亲核基团对底物的亲电子基团进行攻击，二者形成共价键，这个共价中间物很容易变成过渡态，反应的活化能大大降低，反应速度加快。（四）、共价催化

三影响酶催化效率的有关因素392酶分子上的亲核基团有Ser-OH、Cys-SH、His-咪唑基等，这些富含电子的基团(有孤对电子)，攻击底物分子中电子云密度较小的亲电子基团，并供出电子，二者形成共价键，酶和底物形成一个不稳定的中间物，进而转变为产物。蛋白质中三种主要的亲核基团共价催化也可以是酶的亲电基团对底物的亲核基团进行攻击，酶分子上带正电的基团有H+、Mg2+、Fe3+—NH3+等，它们攻击底物分子上带负电的亲核基团，与底物形成共价键,进行催化。392５、金属离子催化金属酶；金属激活酶。通过结合底物为反应定向；调节氧化还原反应；电荷屏蔽。６、多元催化协同作用７、微环境的影响酶的活性中心是低介电区域,这一疏水的微环境大大有利于底物与酶反应。3937.微环境效应

酶的活性中心周围的环境是一个非极性环境，即低介电环境，在低的介电环境中排斥水分子，酶的催化基团和底物分子的敏感键之间有很大的反应力，有助于加速酶促反应。

如果酶的活性中心周围是一个高介电环境中，活性中心就会有水分子存在，水分子对带电离子有屏蔽作用，削弱带电离子之间的静电作用，不利于酶促反应的进行。例如：

酶活性中心的羧基与水形成氢键，导致酶活性中心羧基表面有一层水化层，水分子的屏蔽作用，大大削弱了酶分子与底物离子间的静电相互引力，不利于酶促反应。酶催化作用机理：综上所述：

酶与底物结合时，由于酶的变形（诱导契合）或底物变形使二者相互适合，并依靠离子键、氢键、范德华力的作用和水的影响，结合成中间产物，在酶分子的非极性区域内，由于酶与底物的邻近、定向，使二者可以通过亲核\亲电催化、一般酸\碱催化或金属离子催化方式进行多元催化，从而大大降低反应所需的活化能，使酶促反应迅速进行。(一).溶菌酶（lysozyme)

溶菌酶存在于鸡蛋清和动物的眼泪中，其生物学功能是催化某些细菌细胞壁的多糖水解，从而溶解细菌的细胞壁。溶菌酶是第一个用X-射线法阐明其全部结构和功能的酶。是1922年伦敦细菌学家弗莱明(Fleming)首次发现的。四酶催化反应的实例3951.底物、溶菌酶及酶和底物复合物的结构溶菌酶的底物溶菌酶通过水解某些细菌细胞壁的多糖组份来溶解细胞壁，细胞壁的多糖由两种糖组成:

N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(NAM)396溶菌酶的最适小分子底物

NAG和NAM交替排列形成多聚物，它们之间通过β-1,4糖苷键相连。溶菌酶的最适小分子底物为NAG-NAM交替形成的六糖。6个糖环分别用A、B、C、D、E、F表示。溶菌酶水解D糖环和E糖环之间的糖苷键。396溶菌酶的结构

溶菌酶由129个氨基酸残基构成，是一个单链蛋白，分子内含有四对二硫键。活性中心的氨基酸残基是Glu35和Asp52。

393溶菌酶和底物结合的空间构象

从表面构象看，酶的结构不很紧密，大多数极性氨基酸残基分布在分子的表面，非极性氨基酸残基分布在分子的内部。整个酶分子中有一狭长的凹穴。最适底物正好与酶分子的凹穴相结合，凹穴中的Glu35和Asp52是活性中心的氨基酸残基。2.催化作用机理

溶菌酶底物与酶活性中心的关系

溶菌酶活性中心上的Asp52氧原子距离底物敏感键(C-O键)中碳原子只有0.3nm，活性中心上另一个氨基酸Glu35的羧基距离底物敏感键(C-O键)中氧原子也只有0.3nm，溶菌酶的活性中心的氨基酸残基与底物敏感键既靠近又定向。底物D糖环构象发生变化

溶菌酶底物D糖环变形模型图酶与底物结合后，D糖环构象发生变形，从正常的能量较低的椅式构象变为能量较高的半椅式构象。酸碱催化

酶活性中心的Glu35处于非极性区，其羧基呈不解离状态，而Asp52处于极性区，羧基呈解离状态。

Glu35的羧基起广义酸碱催化，向底物D糖环和E糖环之间的糖苷键上的氧原子提供一个质子，氧原子与D糖环C1的糖苷键断开，D糖环的C1

带上正电荷成为正碳离子。Asp52上的-COO-起着协调糖苷键断裂和稳定正碳离子的作用。最后，来自环境中的水分子上的H+与Glu35的-COO-结合，水分子上的HO-与正碳离子结合，至此，一次反应完成，细胞壁打开一个缺口。经多次重复作用，细菌的细胞壁溶解。398DE溶菌酶催化反应机理3.溶菌酶催化特点小结

靠近与定向底物形变酸碱催化2.胰核糖核酸酶A化学修饰法：（1）碘乙酸修饰咪唑基；（2）FDNB修饰氨基；活性中心：His119；His12；Lys41。124AA；4对二硫键；单体酶。RNase活性中心的酸硷催化机理核糖核酸链受Rnase水解的位点Py为嘧啶，B为嘌呤

RNase-底物复合物3、羧肽酶A（carboxypeptidaseA，CpA）

307AA；单体酶,结合有Zn2+。

生物功能是催化肽链C末端肽键的水解。Zn2+

羧肽酶活性中心Zn2+的作用羧肽酶ZnZn羧肽酶结合底物前后构象变化酶单独存在时:酶底物复合物:羧肽酶活性中心的共价催化机理

145(四)丝氨酸蛋白酶（serineproteases）

丝氨酸蛋白酶是一类最有特色的酶家族，它包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶等。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶为消化酶，在胰腺中合成，以非活性的酶原形式分泌到消化道，在消化道中转化成有活性的酶。这三种酶在一级结构上有40%的氨基酸顺序是相同的，三维结构也很相似，都有Ser195、His57、Asp102三个氨基酸残基构成的催化三联体，它们的催化作用机理也相似，但它们的专一性是完全不同的。这三种酶的活性部位位于分子表面的凹陷区域，这个凹陷结构区域称为口袋。由于三种蛋白酶的口袋的差异造成它们的专一性不同。小的中性氨基酸残基408（二）胰凝乳蛋白酶

（chymotrypsin)胰凝乳蛋白酶是由241个氨基酸组成，分子量为25000，分子呈椭圆状，含α-螺旋较少。活性部位由Ser195、His57、Asp102三个氨基酸残基构成，这三个氨基酸残基形成催化三联体。催化三联体：Asp102His57Ser195催化机理：

酶活性中心的三个氨基酸底物当底物靠近酶的活性中心时，Asp通过一个氢键定位并固定His

His57作为质子的受体从Ser195吸取一个质子，形成共价键，使Ser195-O-成为很强的亲核试剂，攻击底物羰基碳原子，二者形成共价键。电子云向底物羰基氧原子转移第一步第二步底物-NH上的电子云向酶分子的His57-N+H转移，His57作为酸向底物提供质子。底物的C-N键断裂第三步底物C-N键氮端产物释放第四步第五步水分子的-OH亲核攻击底物羰基碳原子,形成共价键。His57作为质子的受体从水分子上接受质子。第六步底物C-O-的电子云向His57-N+H转移,Ser195的氧与底物的碳之间的共价键断开。第七步Ser195作为质子的受体从His57接受质子第八步底物C-N键碳端产物释放、酶恢复原状。407胰凝乳蛋白酶催化机制的特点定向效应广义的酸碱催化共价催化：

五酶活性的调节控制（一）别构调控(allostericregulation)，酶的别构调节:酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后导致酶分子发生构象改变，进而改变酶的活性状态，称为酶的别构调节别构酶:具有别构调节作用的酶。效应物:凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物，通常为小分子代谢物或辅因子。如因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物或别构激活剂，反之称负效应物或别构抑制剂。1.概念：413同促效应（同种协同效应）：它的调节物分子就是底物分子，这种酶分子上有两个以上的底物结合中心，其调节作用取决于酶是有多少个底物结合中心被占据。异促效应：这种别构酶除了与底物分子作用外，还可与其他的调节物分子结合，它的调节物分子不是底物分子。多数别构酶兼有同促效应和异促效应。酶的别构（变构）效应示意图效应剂别构中心活性中心别构酶的调控机理2.别构酶的基本特点：（1）由多个亚基组成的寡聚酶（2）具有四级结构（3）除了有可以结合底物的酶的活性中心外，还有可以结合调节物的别构中心（有时也称调节中心）。这两个中心可能位于同一亚基上，也可能分别位于不同亚基上。（4）每个别构酶分子可以有一个以上的活性部位和调节部位，因此可以结合一个以上的底物分子和调节物分子。

别构酶的活性中心负责酶对底物的结合与催化，别构中心则负责调节酶反应速度。4183别构酶的动力学及别构酶对酶反应速度的调节（1）.大多数别构酶具有正协同效应

正协同效应：酶分子结合一分子底物或效应物后，酶的构象发生变化，这种新的构象有利于后续分子与酶的结合其初速度与底物浓度的关系呈S形的v-[S]曲线。在正协同效应中使得酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感。别构酶就极大地控制着反应速度。419（2）.另一类别构酶具有负协同效应，其动力学曲线在表现上与双曲线相似，但意义不同具有负协同效应的酶在底物浓度较低的范围内酶活力上升快，但再继续下去，底物浓度虽有较大的提高，但反应速度升高却较小。使得酶反应速度对底物浓度的变化不敏感负正[s]419n:代表协同系数（希尔系数）典型米氏类型的酶：Rs=81或n=1正协同效应Rs<81(越小效应越显著）或n>1负协同效应Rs>81(越大效应越显著）或n<1

4、别构酶模型（1）对称或协同模型（symmetryorconcertedmodel,也称齐变模型、MWC模型）1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。（2）序变模型（sequentialmodel，也称KNF模型）1966年由Koshland、Nemethy和Filmer提出。（二）、酶原的激活1概念：酶原——体内许多酶在细胞内合成及初分泌时并无催化活性，这种无活性状态的酶的前身称为酶原。酶原的激活——经过蛋白水解酶专一作用后，构象发生变化，形成活性中心，变成有活性的酶。这一过程称为酶原激活。2激活的本质或实质

酶的活性中心形成或暴露的过程 意义：避免自身受损伤实例：消化系统蛋白酶原的激活

胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶活性中心胰蛋白酶原的激活示意图胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用

胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶（三）、酶的共价修饰某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。这类酶称为共价修饰酶。目前发现有数百种酶被翻译后都要进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流量起调节作用的关键酶或限速酶。424糖原磷酸化酶b(无活性)H2OPiOHATPADP糖原磷酸化酶a(有活性)P蛋白激酶蛋白磷酸酶糖原磷酸化酶

:受磷酸化或去磷酸化的共价修饰的调节糖原磷酸化酶可催化糖原分解产生葡萄糖-1-磷酸。这个酶有两种形式：高活性的磷酸化酶a和无活性的磷酸化酶b。前者是四个亚基的寡聚酶，每个亚基含有一个磷酸化的丝氨酸残基。这些磷酸基是活性必需的，在磷酸酶的作用下可水解除去，变成无活性的半分子：磷酸化酶b。磷酸化酶b在激酶的催化下又可以接受ATP的磷酸基变成磷酸化酶a。级联系统调控糖原分解示意图意义：由于酶的共价修饰反应是酶促反应，只要有少量信号分子（如激素）存在，即可通过加速这种酶促反应，而使大量的另一种酶发生化学修饰，从而获得放大效应。这种调节方式快速、效率极高。肾上腺素或胰高血糖素1、腺苷酸环化酶（无活性）腺苷酸环化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶（无活性）蛋白激酶（活性