室内种子检验员专业知识讲座（第八讲）

室内种子检验员

知识讲座

第八讲

品种真实性及品种纯度的室内测定1重要知识点品种真实性与品种纯度鉴定目的，真实性和纯度的含义，检测方法的适用范围及其评价，电泳检测技术，分子检测技术。2摘要一、概述重要性及现状品种纯度的含义及意义品种纯度检验的方法分类室内纯度测定的基本程序二、品种纯度的形态测定种子形态测定生长箱测定三、品种纯度的快速测定苯酚染色法愈伤木酚染色法荧光分析法四、品种纯度的电泳测定品种纯度电泳测定发展电泳法测定品种纯度的原理品种纯度电泳检测的一般过程五、品种纯度分子测定技术常用分子技术的原理及特点分子技术在品种纯度检测中的应用几种常用分子标记技术在品种纯度检测中应用的可行性分析3第一节概述一、重要性及现状种子真实性和品种纯度鉴定是目前影响我国种子质量最重要的一个因素：那么从种子质量判定上来讲，品种纯度质量是种子质量分级的唯一依据；从生产上讲，全国每年仍有不少假种和低纯度种子播种的案件发生，给农民和农业生产造成重大的损失。4我国目前种子纯度质量状况比较差、也比较乱，追根朔源，产生这一问题主要有两个方面原因：一是我国没有推行种子认证制度，从而难以保持品种真实性和保证品种纯度；二是品种真实性和品种纯度的鉴定技术存在着一定的技术问题。因此，讨论和发展品种真实性和纯度鉴定的实验室技术是普遍关注和迫切需要解决的问题。从标准的角度而言，GB/T3543.5—1995《农作物种子检验规程—真实性和品种纯度鉴定》列入的鉴定方法，是目前世界上较全面的方法，而且也完全与国际接轨，尽管这些方法仍不能解决所有问题。5二、品种纯度的含义（*）品种纯度检验应包括两方面内容，即品种真实性和品种纯度。品种真实性是指一批种子所属品种、种或属与文件描述（description）是否相符。如果品种真实性有问题，品种纯度检验就毫无意义了。品种纯度是指品种个体与个体之间在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数（或株、穗数）占供检验本作物样品数的百分率表示。6三、品种纯度检验的方法分类*品种纯度检验的方法很多，在实际应用中，理想的测定方法要达到4个要求：测定结果在不同实验室或同一实验室能重演；方法应简单易行；省时快速；成本低廉。71.第一大类形态鉴定又分为籽粒形态测定、种苗形态测定和植株形态测定。籽粒形态测定虽简单快速，对于形态性状丰富的，可以作为鉴定前的简单分类，便于其他方法的利用。种苗形态测定，适合于幼苗形态性状丰富的作物，如十字花科、豆科等双子叶植物，种苗测定需要的时间一般在7～30天，因苗期所依据的性状有限，所以测定结果不太准确。植株形态测定，依据的性状较多，测定结果较准确，如田间纯度检验和田间小区种植鉴定都属于植株形态测定，但植株形态测定需要时间较长，难以满足在调种过程中快速测定的需要。82.第二大类物理化学法鉴定，又分为物理的方法和化学方法。物理方法如荧光鉴定法（fluorescencetest）等，这些方法区别品种的种类较少，难以满足品种纯度准确测定的要求。化学方法（chemicalmethod）主要依据化学反应所产生的颜色的差异区分不同品种，如苯酚染色法（phenoltest）等。同物理法一样，化学方法区别品种的种类较少，也难以对品种纯度准确测定。但这类方法测定速度快，在实践中有一定的参考价值。93.第三大类方法生理生化方法，是利用生理生化反应和生理生化技术进行品种纯度测定。这类方法中包括的技术较多，以生理生化反应为基础的有愈伤木酚染色法，光周期反应鉴定法，除草剂敏感性鉴定法等。这些方法鉴别品种的能力较低，因此，测定结果不太准确。以生理生化技术为基础的方法有电泳法鉴定、色谱法鉴定、免疫技术鉴定等。色谱法技术含量较高，免疫技术需要大量技术开发研究，目前两者难以在生产实际广泛应用。电泳法相对技术较为简单，依据蛋白质或同工酶电泳，可以相对较准确地测定品种纯度，是目前品种纯度测定中较为快速准确的方法。104.第四大类细胞学方法鉴定。细胞学方法主要依据染色体数量和结构变异、染色体带型差异以及细胞形态的差异区分种及品种，在品种纯度测定中应用价值不大。5.第五大类分子生物学方法。分子生物学方法种类非常多，它是在DNA和RNA等分子水平上鉴别不同品种。目前在品种检测中最常用的分子技术主要有RAPD技术，SSR技术，AFLP技术以及RFLP技术。分子技术在品种纯度测定和品种DNA指纹的制作方面具有广泛的用途。11综上所述，品种真实性和品种纯度测定的方法非常多，但在生产实际中真正能广泛应用的方法较少。本章将主要以国家和国际标准为依据，介绍在品种纯度检验中有着广泛应用价值的方法。12室内纯度测定的基本程序：从送验样品中随机数取一定数量的样品（净种子），测定异品种种子或杂株数，再计算样品纯度。品种纯度测定的送验样品的最小重量应符合表16-1的规定。样品纯度按下列公式计算：四、室内纯度测定的基本程序13有时需要将测定结果与规定值比较。测定的结果（x）是否符合国家种子质量标准值或合同、标签值（a）要求可利用表16-2判别，如果︱a-x︱≥容许差距，则说明不符合国家种子质量标准值或合同、标签值要求。表中的容许差距，可以通过下列公式计算：

式中：T为容许差距；p为标准或合同或标签值；q为100－p；n为样品的粒数或株数。14表16-1品种纯度测定的送验样品重量15表16-2品种纯度的容许差距（5%显著水平的一尾测定）16第二节品种纯度的形态测定品种纯度的形态测定是纯度测定中最基本的方法，又可分为籽粒形态测定、种苗形态测定和植株形态测定。因其依据的形态性状的多少、差异大小和可靠性，而影响测定结果的可靠性。在形态测定时主要从被检品种的器官或部位的颜色、形状、多少、大小等进行区别。17一、种子形态测定籽粒形态测定特别适合于籽粒形态性状丰富、籽粒较大的作物。在测定时特别应注意因环境影响易引起变异的籽粒性状，同时该方法易受主观因素的影响。这一技术可以与计算机识别相结合对品种真实性和纯度进行快速测定，消除主观影响（Chuang等，1990）。18二、生长箱测定（一）生长箱测定的应用生长箱测定可用于幼苗和植株形态测定。该方法可保证全部幼苗和植株都生长在同样的条件下，其品种形态特征的差异是遗传基础的表达。生长箱测定，可采用两种方法：第一种方法，给予幼苗加速生长发育的条件，可以鉴定如田间植株一样的许多性状，而大大缩短测定时间。第二种方法，将种子或植株种植在特殊逆境条件下，可对品种进行逆境反应差异的鉴定。19当进行幼苗或植株的特别性状鉴定时，尽量按推荐的生长条件进行。如幼苗芽鞘、茎或下胚轴色素鉴定时，应将幼苗种植在石英砂或惰性砂砾中，并用特定营养液浇灌。含有磷的土壤营养将会影响幼苗花青素或紫色素的形成。强光照对花青素的发育是很重要的。当进行植株的抽穗、开花、颜色的形成鉴定时，将植株放在推荐的光周期下。为了促进花芽分化，有些品种的植株必须每天暴露在特别长的黑暗中。同时，开花或抽穗测定要求较长的测定时间，因此应供应适当的营养，确保鉴定植株的健康生长。20应准备适当的对照样品，以便供检样品的性状或反应与对照样品进行比较。同其他方法一样，生长箱测定法也有其局限性。有些性状，如花的颜色、幼苗色素的差异是质量性状，既可用于真实性的鉴定，也可用于鉴定异型株；而株高、穗数等数量性状的测定只能用于真实性鉴定，不能用于鉴定异型株。21（二）生长箱测定的程序1.种植（1）培养基质（2）种植密度2.浇灌方法3.光照要求（1）光照强度（2）光周期4．温度控制5．幼苗和植株鉴定22表16-3生长箱测定的播种和幼苗管理注：1.每孔播种数粒种子，最后间苗留l株；2.HoaglandNo.1营养液；3.缺磷HoaglandNo.1培养液23关于幼苗和植株性状的鉴定方法列于表16-4。（1）玉米、高粱可在出苗后第14天进行高粱幼苗芽鞘和顶端颜色鉴定。芽鞘颜色可分为紫红色或绿色。顶端颜色可能有4种类型：深紫色(在茎和叶的近轴和远轴表面全深紫色)、中等紫色(紫包茎，近轴叶表面几乎深紫色，但远轴叶表面为黄棕色)、浅紫色(幼苗在茎和叶边缘有局部紫色，主要为绿色)和绿色(幼苗完全绿色)。如利用比建议较低的光照强度，也可能用于区分品种，以及鉴定异型株。24（2）大麦播种10天至2周可以坚定胚轴或叶鞘花青苷。播种3-4周可以鉴定品种间的胚轴长度和株高差异。播种4-6周，大麦品种可以记录抽穗（春大麦）或不抽穗（冬大麦）。春性品种还可以评定穗上的芒颜色（红或绿）和其它性状。这些观察可作为品种分类，也可作为鉴定异型株。（3）小麦小麦幼苗的芽鞘和茎色的鉴定，可在播后大约第7天进行。其颜色可分为紫色和绿色。抽穗情况的记载可在出苗后30天左右进行。抽穗情况可分为正在抽穗(春小麦)、未抽穗(冬小麦)。该法可用于区分品种，及检出异型株。25（4）十字花科在子叶期根据子叶大小、形状、颜色等性状鉴别。第一真叶期根据第一直叶形状、大小、颜色、茸毛多少、长短、叶脉宽窄及颜色、叶缘特性等鉴别。将种子播于砂盘内，粒距1cm，20～25℃培养。发芽7天后鉴定子叶性状，15～20天鉴定真叶性状。（5）莴苣可以根据幼苗的下胚轴颜色(粉红色或绿色)、第一叶叶色(红、粉红、浅绿或深绿)、叶缘(深裂、全缘或浅裂)、叶卷曲(似管形或展开)、子叶形状(宽或窄)等性状进行鉴定。鉴定时期为播种后三周或三至四叶期。该法可用于栽培品种分类和鉴定异型株。26（6）菜豆菜豆品种的植株可依据花色(紫色、白色花)和从播种至开花的天数进行鉴定。从播种至开花大约需4～6周鉴定。该法可用于区分栽培品种和检出异型株。（7）燕麦可在播后第10～14天对燕麦幼苗的芽鞘和叶鞘颜色(红色或绿色)和叶鞘茸毛进行鉴定。其幼苗可按茸毛有无，光滑或混合(有些幼苗光滑，而有些有茸毛)进行分类。该记载可在播后30天进行。燕麦植株也可进行抽穗(春燕麦品种)或不抽穗(冬燕麦品种)检查。该检查可用于区分栽培品种，并附带检出异型株。27（8）洋葱出苗后几天，在砂上长出的部分可评定为红叶或绿叶。播种后四周，检查是否形成球茎，记录从播种至球茎形成的时间。在球茎形成时记录株高和球茎(而葱不形成球茎)。播种后12周，在容器中生长的植株至少17cm，检查球茎的形状和颜色、叶姿和叶蜡。该法可用于栽培品种分类和鉴定异型株。28（9）大豆大豆幼苗花青素鉴定，可在播后第10～14天进行。如果幼苗是培育在原来说明的条件下，则可能观察到4种苗色：绿色(仅有绿色素)、赤褐色(下胚轴下部有赤褐色素)、淡紫色(下胚轴紫色，上胚轴绿色)和深紫色(上胚轴和下胚轴均为紫色)。同时在播后第21天，待3片小叶完全展开时，可进行上面一片小叶背面茸毛角度的鉴定。小叶茸毛角度可分为直角、紧贴、中等；茸毛颜色可分为黄褐色、灰色；小叶形状可分为卵形(长／宽比少于1.6)、尖形(长／宽比大于2)。该法适用于区分品种和检出异型株。29在大豆幼苗赛克津敏感性测定时，应每天记载植株的伤害情况。其伤害症状有呈现出褐色斑点、干枯和叶片卷曲、叶片下垂和植株死亡情况。按伤害等级，可将品种分为最敏感(约9天后植株出现伤害症状，第17天后枯死)、中等敏感(第13天幼苗出现病症，第32天死亡)、不敏感(第20天幼苗出现症状，第38天后仍存活)。大豆光周期的测定，在不同光周期条件下，记载从播种至开花的天数。该法可将大豆栽培品种分为不同成熟期的类群。30表16-4种植在生长箱测定条件下幼苗和植株性状的鉴定方法注：1.用于区分栽培品种，以C表示；2.用于检出异型株，以OT表示；3.用于区分种(类)，以S表示；4.用于区分类型，以T表示。31第三节品种纯度的快速测定在品种纯度的测定中通常把物理法鉴定、化学法鉴定等在短时间内测定品种纯度的方法归为快速测定方法。本节将以国际标准和国家标准为依据介绍部分快速的品种纯度测定。32一、苯酚染色法（一）苯酸染色法的机理苯酶染色法已作为ISTA和我国国家标准。苯酚染色法的机理有两种观点，一种认为是酶促反应，另一种认为是化学反应。该反应受Fe++、Cu++等双价离子催化，可加速反应进行。Na+离子（NaOH、Na2CO3）等对该反应有抑制作用（Chandra，1977，Jaiswal和Agrawal等，1995）。其反应可用下式表示：OH[O]Cu++Fe++OO33（二）苯酚染色的方法主要适用于小麦、大麦、燕麦、水稻等作物。1．麦类（1）国际标准法数取净种子400粒，每重复100粒。按以下方法测定。将小麦、大麦、燕麦种子浸水18～24小时，用滤纸吸干表面水分，放入垫有1%苯酚溶液湿润滤纸的培培养皿内（腹沟朝下），室温下小麦保持4小时，燕麦2小时，大麦24小时后即可鉴定染色深浅。小麦观察颖果颜色，大麦、燕麦观察内外稃的颜色，一般染后的颜色可分为不染色、淡褐色、褐色、深褐色、黑色五种，将与基本颜色不同的种子取出作为异品种。34（2）快速法将小麦种子用1.0%的苯酚浸15分钟，取出放在铺有1%苯酚湿润过的滤纸的培养皿中（腹沟朝下），并盖上贴有同样滤纸的培养皿盖。置30～40℃温箱内，染色0.5～1小时，观察染色结果，区分本品种与异品种。352．水稻将种子浸水6小时，取出放入1%苯酚溶液中，室温下12小时，然后取出用清水洗涤，放在湿润的滤纸上24小时，观察谷粒或米粒染色程度。谷粒染色分为不染色、淡茶褐色、茶褐色、黑褐色和黑色五级，米粒染色分为不染色、淡茶褐色、褐色三级。36（一）愈伤木酚染色的原理愈伤木酚（C7H8O2）是专门用于大豆品种鉴别的方法。Buttery和Buzzell（1968）根据大豆种皮内过氯化物酶活性的高、低，把大豆品种分为两大类。其原理是：大豆种皮内的过氧化物酶，可催化过氧化氢分解产生游离氧基，游氧基可使无色的愈伤木酚氧化产生红褐色的邻甲氧基对苯醌，种皮内含有的过氧化物酶活性越高，单位时间内产生的红褐色的邻甲氧基对苯醌越多，溶液的颜色越深。反之，颜色越浅。不同品种由于遗传基础不同，过氧化物酶的活性不同，在一定条件下，溶液染色的深浅不同，依此区分不同品种。二、愈伤木酚染色法37（二）愈伤木酚染色的方法方法是将大豆种皮逐粒剥下，分别放入指形管内，然后注入1ml蒸馏水，在30℃下浸泡1小时，再在每支试管中加入10滴0.5%愈伤木酚溶液，10分钟后，每支试管加入1滴0.1%过氧化氢溶液，1分钟后根据溶液呈现颜色的差异区分本品种和异品种。使用该方法时应注意，剥种皮时的碎整程度要一致，否则影响染色的深浅，进而影响测定结果。最好使用小的打孔器，将种皮打下，这样克服了种皮大小及碎整程度的影响。38三、荧光分析法紫外光能量较高，当照射物体时，就会产生光激发现象，被激发的电子很不稳定，由高能态转变为低能态时，便会发现一种可见光——荧光。因作物和品种不同，其种皮结构和化学组成不同，在紫外光照射下发出荧光的波长不同，因而产生不同颜色。荧光分析可对种子或幼苗进行测定。39（一）种子鉴定取净种子400粒，分为4次重复，分别排在黑板上，放在波长为360nm的紫外分析灯下照射，试样距灯泡最好为10～15cm，照射数秒或数分钟后即可观察，根据发出的荧光鉴别品种或类型。如蔬菜豌豆发出淡蓝或粉红色荧光，谷实豌豆发褐色荧光；无根茎冰草发淡蓝色荧光，伏枝冰草发褐色荧光。十字花科不同种发出荧光不同：白菜为绿色，萝卜为浅蓝绿色，白芥为鲜红色，黑芥为深蓝色，田芥为浅蓝色。40（二）幼苗鉴定国际上主要用于黑麦草与多花黑麦草的鉴别。取试样二份，各100粒，置于无荧光的白色滤纸上发芽，粒与粒之间保持一定距离，于20℃恒温或20～30℃变温培养。黑暗或漫射光，发芽床保持湿润，经14天即可鉴定。将培养皿移至紫外灯下照射，黑麦草根际不发光，多花黑麦草根际发蓝色荧光。羊茅与紫羊茅也可用同样的方法进行鉴定，但幼苗鉴定前发芽床上先用稀氨液喷雾，然后置于紫外灯下照射，羊茅根发蓝绿色荧光，而紫羊茅则发黄绿色荧光。41除以上三种方法外，还有：利用碱液处理区分红白皮小麦，进行十字花科品种真实性鉴定；利用漂白水处理，区分单宁含量不同的高粱品种；利用I-KI溶液区分直支链淀粉含量不同的水稻品种；利用除草剂敏感性鉴定转除草剂基因大豆；利用抗生素基因，检测转基因作物等。这些方法仅仅依据个别性状或个别特性进行品种的检测，只能将品种区分成少数几类。42第四节

品种纯度的电泳测定(*)43一、品种纯度电泳测定的发展电泳是指溶液中的带电粒子在电场中移动的现象。这一现象在19世纪就已发现，并用于胶体化学的研究中。直到1937年Tiselius开发了蛋白质泳技术，并成功地用这种方法分离了血清蛋白之后，才使这一技术在生物研究中得到广泛地应用。电泳的种类繁多，有不用支持物电泳和用支持物的电泳两大类，在生物研究中，支持物电泳用的最多，特别是聚丙稀酰胺凝胶电泳（PAGE）因其凝胶透明度高、弹性好、无吸附性、浓度易控制，应用最为广泛。聚丙稀酰胺凝胶电泳又分为圆盘电泳和平板电泳两种，在品种纯度测定中主要应用平板电泳。44目前鉴定品种的常用电泳方法：（1）国际种子检验协会鉴定小麦和大麦品种醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳标准程序、鉴定豌豆属和黑麦草属的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准方法、超薄层等电聚焦电泳测定杂交玉米种子纯度的标准方法列入国际种子检验规程，在全世界推广应用。45（2）国际植物新品种保护联盟于1994年制订有关电泳技术标准将分析小麦高分子量麦谷蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析大麦醇溶蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析大麦醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析玉米同工酶的淀粉凝胶电泳方法列入DUS检测应用。（3）我国GB/T3543农作物种子检验规程已将ISTA规程的鉴定小麦和大麦品种的聚丙烯酰胺凝胶电泳标准参照方法列入应用。2001年农业部颁布了“玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法”（NY/T449－2001）。46二、电泳法测定品种纯度的原理（一）电泳法测定品种纯度的遗传基础电泳法测定品种纯度主要利用电泳技术对品种的同工酶及蛋白质的组分进行分析，找出品种间差异的生化和分子指标，以此区分不同品种。目前品种鉴定主要以同工酶和蛋白质为电泳对象。同工酶是指同一生物体或同一组织中催化相同化学反应，结构不同的一类酶。从遗传法则（DNA→RNA→蛋白质（或酶）→性状）知道，蛋白质或酶组分的差异最终是由于品种遗传基础的差异造成的，因此分析酶及蛋白质的差异从本质上说是分析遗传的差异，即品种差异，利用先进的电泳技术可非常准确地分析种子蛋白质或同工酶的差异，进而区分不同品种，测定品种纯度。47种子内的蛋白质或同工酶是在种子发育过程中形成的，它只反映了种子形成过程中的遗传差异。因此，有些作物种子中的贮藏蛋白或同工酶有时品种之间没有差异，这就需要研究哪一类蛋白质（或同工酶）在品种之间存在差异，以此作为该作物纯度电泳的对象——生化指标。48应该指出的是同工酶往往具有组织或器官特异性，即同一时期不同器官内同工酶的数目不同。如过氧化物酶同工酶在玉米幼苗中有5种，叶片中有5至6种，干种子内有2种。此外同工酶在不同发育时期，数目也不同。Scandalios（1974）曾列出过46种同工酶系统，它们的酶谱皆随发育阶段或营养状况而改变。由于某些同工酶在种子贮藏和萌发过程中，种类数目易随生活力和发育进程的变化而变化，加之种子萌发速度不一致，所以对品种纯度鉴定不利。此外，酶的提取和电泳条件较蛋白质要求严格，需在低温下进行。因此，在纯度鉴定的研究中，应以蛋白质为主。49（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理聚丙烯酰胺通过交联剂（甲叉双丙烯酰胺，Bis）在催化剂的作用下聚合而成的高分子胶状聚合物。其凝胶透明，有弹性，机械强度高，可操作性强；化学稳定性好，对pH、温度变化稳定；该凝胶属非离子型，没有吸附和电渗现象；并通过改变丙烯酰胺和交联剂的浓度可有效控制凝胶孔径的大小。因此，在品种纯度电泳分析中广泛应用。50蛋白质（或酶）为两性电解质，在不同pH条件下所带电荷多少不同。不同的蛋白质（或酶）由于氨基酸的组成不同，其等电点pI也不同，在同一pH条件下所带电荷也就不同。因此在电场中受到的作用力大小也就有差异。聚丙稀酰胺凝胶电泳主要依据分子筛效应和电荷效应对蛋白质（酶）进行分离。51分子筛效应是指由于蛋白质分子的大小、形状不同在电场作用下通过一定孔径的凝胶时，受到的阻力大小不同，小分子较易通过，大分子较难通。随丙稀酰胺和交联剂浓度的增加，凝胶孔径变小，反之孔径变大。小孔径凝胶适于小分子蛋白质（或酶）的分离，大孔径凝胶适于大分子量蛋白质（或酶）的分离。一般分子量1～10万的蛋白质可用15～20%的凝胶；10～100万的蛋白质用10%左右的凝胶；大于100万的可用小于5%的凝胶。52电荷效应是指由于蛋白质带的电荷多少不同，受电场的作用力不同，电荷多受到的作用力大移动较快，反之，较慢。溶液的pH值与蛋白质的pI相差越大，蛋白质带电荷越多。蛋白质在凝胶中的运动速度与荷质比有着密切关系。经过一定时间的电泳，性质相同的蛋白质就运动在一起，性质不同的蛋白质就得到了分离。53描述蛋白质泳动速度一般用迁移率m或相对迁移率Rf值表示：m=dl/vt，m为迁移率（cm2/伏特、秒）；d为蛋白质谱带移动的距（cm）；l凝胶的有效长度（cm）；v电压（伏）；t电泳时间（秒）。54三、品种纯度电泳检测的一般过程（*）电泳的方法很多，不同方法其具体操作过程也有差异，具体参见相应的标准和方法。在品种纯度电泳测定时一般包括：样品的提取、凝胶的制备、上样电泳、染色、谱带分析等步骤。55玉米种子纯度盐溶蛋

白电泳鉴定方法1.仪器设备电泳仪、电泳槽、单籽粒粉碎器、天平、酸度计、磁力搅拌器、高速离心机、电冰箱、电炉、离心管（1.5ml）、移液管、微量进样器、恒温箱、观片灯等562.试剂丙烯酰胺、双丙烯酰胺、乳酸、甘氨酸、抗坏血酸、硫酸亚铁、氯化钠、蔗糖、甲基氯、三氯乙酸、过氧化氢、靠马斯亮蓝、无水乙醇、正丁醇（所用试剂均为分析纯，所用水为去离子水）573.溶液配制电极缓冲液：甘氨酸，乳酸PH3.3样品提取液：氯化钠、蔗糖、甲基氯分离胶缓冲液：乳酸钠、乳酸PH3.0分离胶溶液：丙烯酰胺、双丙烯酰胺浓缩胶缓冲液：乳酸钠、乳酸PH5.2浓缩胶溶液：丙烯酰胺、双丙烯酰胺3%过氧化氢溶液染色液：考马斯亮蓝溶液、10%三氯乙酸溶液584.电泳操作样品制备:粉碎样品→加入样品提取液；凝胶制备:安装玻璃板→封底缝→灌分离胶→灌浓缩胶→插入样品梳；点样电泳卸板染色：30℃2～4小时595.结果计算电泳测定值计算样品纯度值计算

Y=52.9+0.461XX（%）=

供检样品粒数-非本品种粒数×100

供检样品粒数606.图谱分析1）玉米蛋白质凝胶电泳谱带区域的划分：玉米蛋白质凝胶电泳谱带可根据分子量大小划分为三个区域：α区、β区、γ区。①α区为小分子量蛋白质所组成，在该区域中蛋白质谱带数量少，谱带扩散，染色浅，品种间有差异，但不显著，应作为鉴定的次谱带区。在纯度鉴定中当β区差异不明显时，可根据该区域的谱带差异进行鉴定。61②β区为中分子量蛋白质所组成，在该区域中蛋白质谱带数量多，染色深，品种间差异大，为纯度鉴定主要应用区。③γ区为高分子量蛋白质所组成。该区域蛋白质谱带数量多，染色谱带细，易受电泳条件的影响，对于虫蛀、发霉、生病的籽粒，该区域谱带会部分或全部消失，在该区域品种间差异小，不太容易观察，最好不作为纯度鉴定用。622）玉米蛋白质电泳谱带的特异性不同的玉米品种具有不同的蛋白质组成，所以表现在电泳谱带上就有不同的谱带类型，主要是谱带数目、位置、相对强弱的差异。玉米蛋白质电泳就是利用这些差异来鉴定品种的，也就是说，不同的玉米品种其蛋白质凝胶电泳谱带有其特异性。电泳谱带能准确地表现出这些品种间的差异。633）玉米杂交种和亲本自交系的蛋白质电泳谱带类型①互补型谱带：在杂交种中出现两条谱带，其一条谱带和父本自交系的一致，另一条和母本自交系的一致，则两条谱带称作互补带，这表明杂交种的两条谱带分别来自于父母本自交系。②偏母或偏父型谱带：这种类型的谱带是杂交种继承了母本或父本自交系的谱带，这种情况有时是继承两条，有时只继承一条。互补型谱带中任意一条也可看作是偏父或偏母的谱带。64③新谱带型：这种类型的谱带是指杂交种中出现的一条或多条谱带是父母本双亲自交系均不具备的谱带，既不象父本也不象母本的谱带，新谱带型并不是左右杂交种均会发生。杂交种和亲本自交系谱带关系一般有以上几种类型，作为杂交种纯度鉴定最常用的是互补型谱带，这也是杂交种中常出现的一种谱带类型，其次为偏亲型和新增型谱带。653.玉米杂交种纯度鉴定中应注意的问题同一品种的玉米杂交种的蛋白质电泳谱带应该是很一致的，这在大多数杂交种的谱带中能得到证实，但在大量分析杂交种纯度时，我们发现有些籽粒谱带会出现一些异常情况：1.新谱带型偶然出现：这种情况很可能是由于制种时某些籽粒发生突变或自交系中有突变体造成的，该种情况应将其当作杂交种计算纯度。662.丢失某些谱带现象：在杂交种中有多条互补型谱带时，其中某粒可能有一条谱带不出现互补而呈现偏亲型谱带出现，其它互补带仍然出现，这说明该籽粒也为杂交种，只是杂交不完全或发生突变。这种情况应将其记入杂交种计算纯度。3.越代种的谱带型式：当有F2代玉米掺入杂交种或用越代种冒充杂交种时，同一批种子的不同籽粒的蛋白质电泳谱带表现很大差异，采用玉米蛋白质电泳法就能很容易的鉴定出来。674.正反交制种的杂交种谱带型式：经实验表明，尽管正反交得到的杂交种一代在籽粒形态上有很大差异，但由于正反交种子具有相同的遗传背景，其电泳谱带上的结果完全一致。684.谱带分析鉴定的原则1）与标准谱带完全相同的籽粒记为杂交种；2）在主谱带区（β区）与标准谱带完全相同，而在次谱带区（α区）和辅助区（γ区）有新谱带或丢失谱带的籽粒记为杂交种；3）有两对以上互补谱带的品种，若一对互补谱带未出现，而其它互补谱带均出现，这种籽粒仍记为杂交种；4）未出现杂交种标志谱带的籽粒记为异品种籽粒；5）只表达出父本或母本标志谱带的籽粒分别记为父本或母本自交粒。6970第五节*

品种纯度的分子测定技术71一、常用分子技术的原理及特点20世纪90年代分子技术发展迅速，到目前为止，依据所采用的分子生物学技术的原理不同，常用的DNA

分子标记大致可分为三类：第一类以分子杂交技术为核心，可分为RFLP标记(限制性片断长度多态性)，VNTR标记(VariableNumberofTandemRepeats，重复数可变的串连重复单位)以及原位杂交（insituhybridization）。72第二类以PCR技术为核心，可分为RAPD标记(随机扩增多态性DNA)，SSLP标记（SimpleSequenceLengthPolymorphism，简单序列长度多态性），SCAR标记(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion，特征序列的扩增区域)，STS(SequenceTaggedSite，序列标记位点)，SNP标记(SingleNucleotidePolymorphism，单核苷酸多态性)和AFLP标记(AmplyfiedFragmentLengthPolymorphism，扩增片断长度多态性)等。第三类是以重复序列为基础的分子标记，可分为小卫星标记（MicrosatelliteDNA）、微卫星标记（MinisatelliteDNA）、SSR标记(SimpleSequenceRepeats简单重复序列)和ISSR标记(Inter-SimpleSequenceRepeats简单序列重复区间)。73二、分子技术在品种纯度检测中的应用（一）RAPD技术在品种纯度检测中的应用目前，RAPD技术已被广泛用于进行种子纯度检验的研究。国际上，Tinker（1993