第十四章 细胞分子生物学相关仪器

第十四章细胞分子生物学相关仪器永州职业技术学院杨晓斌2教学基本要求掌握流式细胞仪的工作原理、基本结构和检测信号掌握PCR基因扩增仪的工作原理和常用变温方式熟悉流式细胞仪的主要部件和性能指标熟悉PCR扩增仪的分类、温控方式和主要性能指标了解流式细胞术和PCR仪的特点、应用与常见故障第二节PCR基因扩增仪2第一节流式细胞仪31第一节流式细胞仪流式细胞仪的工作原理与结构流式细胞仪的常见故障与排除5流式细胞术和流式细胞仪概述31流式细胞仪的性能指标与技术要求34第一节流式细胞仪6流式细胞仪的临床应用31返回章目录信号检测与分析313331326流式细胞术（flowcytometry，FCM）:应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。FCM也叫荧光激活细胞分类术(fluorescenceactivatedcellsortingFACS)。

一、流式细胞术和流式细胞仪概述返回节目录7流式细胞仪（flowcytometer，FCM）:以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。

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分析对象：生物颗粒（细胞、免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、细胞器、细菌、病毒等）

应用范围：基础医学免疫学，细胞遗传学，分子生物学，药理学，病理学等；临床检验：血液学，肿瘤学

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1.1934年,moldvan提出细胞计数流式自动化设想

2.1949年,Wallacecoulter发明悬液计数粒子方法专利

3.20世纪70年代：制造出比较完善的商品化流式细胞仪,主要生产厂家是美国的Becton-Dickinson(BD)公司和Coulter公司

4.20世纪80年代以来：仪器性能向着多光束、多参数、多用途；仪器向着小型化、自动化和简单化发展。

发展简史10二、流式细胞仪的工作原理和基本结构生物颗粒分析原理细胞分选原理31323334流式细胞仪的分类流式细胞仪的基本结构返回节目录111.样品的进入流动室将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放人样品管。在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动。（一）生物颗粒分析原理122.鞘液的作用流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交，相交点称为测量区。

133.信号的产生与接收染色的细胞在测量区受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被光电倍增管和光电二极管接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得细胞的大小和核酸含量等指标。14FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(光电倍增管PMT3,PMT4etc.)15分选：当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内。（二）生物颗粒分选原理16流式细胞仪分选系统FACSVantage488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector17流式细胞仪根据功能不同可分为临床型和科研型。临床型只有分析功能，没有分选功能，操作简便，易学易掌握。科研型既有分析功能又有分选功能，可快速将所感兴趣的细胞分选出来。（三）流式细胞仪的分类18流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。前者的光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细胞内某种生物化学成分的参数。狭缝扫描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑直径，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核浆比例等一系列的形态学信息的定量资料。

19狭缝扫描流式细胞仪

被检细胞直径大于激光光斑直径，细胞通过光束时各部分被依次扫描。（四）流式细胞仪的基本结构201.流动室与液流驱动系统流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。

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由右图可知，空气泵产生压缩空气，通过鞘流压力调节器加在鞘液上一恒定的压力，这样鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。

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由于激光焦点处能量分布为正态分布（见图），中心处能量最高。因此，当样本速率选择高速时，处在样本流不同位置的细胞或颗粒，受激光照射的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同。

232.激光光源与光束成形系统激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，且细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。

243.光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成。滤光片主要分为：1.长通滤光片长通滤光片使特定波长以上的光通过。2.短通滤光片特定波长以下的光通过。3.带通滤光片带通滤光片允许一定波长范围内的光通过25●光路系统侧向角散射前向角散射不同荧光分析261．小水滴的形成压电晶体带动流动室振动，液流形成水滴。喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。当喷嘴直径为50μm时，信号频率为40kHz，则每秒钟产生4万个水滴。若每秒钟流出的细胞是1000个，则平均每40个水滴中只有一个水滴是有细胞的，其他皆为空白。

（五）细胞分选器272．逻辑电路为了分选细胞，需要细胞在经过测量区时判断出哪个细胞满足了分选的条件，并产生一个逻辑信号，此信号驱动充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲。283．水滴的充电与偏转当水滴从流束上将要断开时给整个流束充电，则水滴从流束上断开后便带有同极性的多余表面电荷。下落的水滴通过一对平行板电极形成的静电场时，带正电荷的水滴向带负电的电极板偏转，这样就可用容器收集水滴。29分析流程30当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，细胞内不同物质产生不同波长的荧光信号。这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。三、信号检测与分析（一）检测的信号返回节目录311.散射光信号散射光分为前向角散射和侧向角散射，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，称为细胞的物理参数（或称固有参数）。（1）前向角散射前向角散射与被测细胞的大小有关（2）侧向角散射侧向散射光可提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。32散射光信号前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

入射激光的前向散射光信号 反映细胞相对大小及其表面积

侧向角散射（SSC,SideScatter） 入射激光90角的散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性33前向角散射光FSCFALSSensorLaser34侧向角散射光SSCFALSSensor90LSSensorLaser352.荧光信号当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的性质和数量。36FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(光电倍增管PMT3,PMT4etc.)荧光检测37（二）荧光信号的测量（1）荧光信号线性测量和对数测量线性放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大器。38荧光染色双色直接染色39（2）荧光信号的面积和宽度荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA倍体测量时采用面积，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量。荧光信号的宽度常用来区分双连体细胞。40EthidiumPEcis-ParinaricacidTexasRedPE-TRConj.PIFITC600nm300nm500nm700nm400nm457350514610632488不同荧光素和激发激光的波长41（3）光谱重叠的校正当细胞携带两种荧光受激光激发而发射两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测，但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠。42

从右图中可以看出，阴影为探测器检测光谱的范围，FITC探测器会探测到少量的PE光谱，而PE探测器则检测到较多的FITC光谱。

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图中点A通过透镜f成像在A’处，而点B通过透镜f成像在B’处。在光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其它杂散光信号，从而确保了A点光源进不了B’点处，B点光源也进不了A’点处。

44目前FCM数据的存贮的方式均采用列表排队(ListMode)方式。目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光标记物参数数量在逐渐增多。采用ListMode方式可大量节约内存和磁盘容量。（三）测量数据的存贮与显示45直方图分析46点图分析47等高图和密度图分析48四、流式细胞仪的性能指标和技术要求

荧光测量灵敏度；仪器的分辨率；前向角散射光检测灵敏度；FCM分析速度；FCM分选指标3132性能指标：技术要求：样品制备；荧光染料与荧光染色，质量控制等返回节目录49灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标。一般以能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示，现在的FCM均可达到检测小于100个荧光分子的指标。(一)性能指标1.荧光测量灵敏度50分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV(CoefficientofVariation)值表示：(δ是分布的标准误差，是分布的平均值)2.分辨率51前向角散射光检测灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的FCM可以测量到0.2μ～0.5μ左右。3.前向角散射光检测灵敏度52分析速度以每秒分析的细胞数来表示。当细胞流过光束的速度超过FCM仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会丢失，这段时间称为仪器的死时间。死时间越短，仪器处理数据越快，一般可达到3000～6000个/秒左右。大型机已达到每秒几万个细胞。4.FCM分析速度53分选指标主要包括分选速度、分选纯度和分选收获率。分选速度指每秒可提取所要细胞的个数。分选纯度指要分选的目的细胞占分选出细胞的百分比。分选收获率指被分出的细胞与原来溶液中该细胞的百分比。5.FCM分选指标54

1.检测样品制备的重要性因为流式细胞仪测量的是每个细胞所产生的散射光和荧光信号，如果两个或多个细胞间粘连重叠或细胞碎片过多，都会影响信号的收集及所收集信号的真实性，所以制备单细胞悬液是进行流式细胞仪分析最关键的第一步。（二）技术要求55

2.常用的荧光染料与标记染色散射光信号是激光照在细胞上所产生的前向光和侧向光信号。荧光信号来自于细胞的自发荧光或被分析细胞经特异性荧光标记染色后通过激光束激发后所产生的。因此，被分析细胞在制备成单细胞悬液后，经过与荧光染料染色后才能上机进行检测。56

3.流式细胞仪操作技术的质量控制在临床检测中，应对各个工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，以保证各项检测数据和指标的可靠性。57光路与流路校正主要目的在于确保激光光路与样品流处于正交状态，使仪器检测时的变异减少到最小，从而控制仪器的CV值。在流路校正物中，有标准大小的荧光微球，其物理性质、生物学特性和化学特性均经过标定。

58PMT校准流式细胞仪在使用过程中，光电倍增管随时间的增加，其放大功率会有所改变，对样品检测的灵敏度会产生影响。为保证样品检测时仪器处于最佳工作状态，采用质控品进行PMT校准，必要时进行电压补偿。59绝对计数的校准为保证仪器在计数时的准确性，仪器应采用绝对计数标准品建立绝对计数标准。该标准品是经标定的，如以计算1000个细胞为1ml，作为设定标准。在样本测定时，以此为标准进行绝对计数，从而获得绝对计数的标准值。60五、FCM的维护及常见故障的排除（一）仪器的维护1.激光电源的波动范围应小于±10%。2.冷却水须用过滤器，并保证压力和流量。3.室温在18℃～24℃，相对湿度小于85%。4.安装单独的可靠的地线。5.仪器操作必须有经过培训的人员操作。6.样品和鞘液管道每周应用漂白粉液清洗。返回节目录61故障信息引起故障的原因解决方法清洗液高度错误清洗液少了加清洗液清洗液高度警示清洗液传感器失灵与公司联系数据处理速率错误数据太大，难以处理稀释样品文件名错误输入的文件名与系统冲突输入另一个文件名（二）常见故障及排除62故障信息引起故障的原因解决方法存取数据时发生错误流式细胞仪不能存取数据关开计算机重试程序错误软件不能执行该程序选择主菜单上的重建项程序号太大程序号不能大于32取消一些程序，再输入相应号码没有激光束激光器关闭检查电源，开激光器63六、流式细胞仪的临床应用

FCM对自身免疫性疾病HLA抗原的分析流式细胞仪在血液学中的应用流式细胞仪在细胞生物学中的应用流式细胞仪在肿瘤学中的应用流式细胞仪在AIDS病检测中的分析流式细胞仪在药物学方面的应用流式细胞仪在免疫学中的应用返回节目录64流式细胞分析的基本步骤65流式细胞术广泛地应用于免疫理论研究及其临床实践，所以有人称之为现代免疫技术基石之一。尤其同单克隆抗体的结合应用，在淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞功能分析、免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫检测、研究细胞周期等方面都起着相当重要的作用。（一）流式细胞仪在免疫学中的应用66血液病多为肿瘤性、免疫性和遗传性疾病，恶性血液病约占其总数一半以上。FCM在血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等方面应用广泛。（二）流式细胞仪在血液学中的应用67细胞生物学研究中，应用最频繁也最普通的是细胞周期分析，研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系，包括细胞周期各时相的百分比和细胞周期动力学参数的测定等内容。对同一细胞的参数测定技术则导致了对细胞周期的一些新发现，典型的方法是吖啶橙双染色技术。

（三）流式细胞仪在细胞生物学中的应用68近年来荧光细胞化学技术的发展，以及荧光探针标记的单克隆抗体，为流式细胞技术研究各种肿瘤抗原、肿瘤蛋白、致癌基因开辟了新途径，极大地提高了肿瘤学的研究水平，并为流式细胞技术在肿瘤学的研究中开辟了更广阔的应用前景。（四）流式细胞仪在肿瘤学中的应用69流式细胞术用于AIDS免疫功能的检测是最重要的检测手段，采用三参数荧光标记计数可对T淋巴细胞及亚群进行分析，并通过动态监测T细胞亚群可以对HIV感染者或AIDS发病者进行区别。

（五）流式细胞仪在AIDS病检测中的分析70利用FCM可以进行HLA-B27／HLA-B7双标记抗体检测HLA-B27阳性细胞，同时又可排出交叉反应。通常58％～97％的强直性脊柱炎患者可检出这种抗原，而正常人仅2％～7％可检出这种抗原。FCM检测HLA-B27快速、特异、敏感，为强制性脊柱炎的临床诊断提供了有力的帮助。（六）FCM对自身免疫性疾病HLA抗原的分析71HLA-B27HLA-B27阴性样本HLA-B27阳性样本72流式细胞仪在检测药物在细胞中的分布，研究药物的作用机制方面应用广泛。亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤细胞的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等进行观察。（七）流式细胞仪在药物学方面的应用第二节PCR基因扩增仪74PCR基因扩增仪的工作原理243133第二节PCR基因扩增仪5PCR基因扩增仪的临床应用31PCR基因扩增仪的分类与结构PCR基因扩增仪的性能指标PCR基因扩增仪的操作规程与常见故障返回章目录75一、PCR基因扩增仪的工作原理

（一）PCR技术的发展及原理1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述了PCR方法。1985年，美国PE-Cetus公司的KaryMullis等人发明PCR技术。返回节目录76PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复“变性→退火→引物延伸”过程至25～40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。77PCR的基本原理

78PCR仪温度控制水浴锅控温压缩机控温

半导体控温

离心式空气加热控温

（二）PCR基因扩增仪的工作原理79二、PCR扩增仪的分类与结构PCR扩增仪的种类

普通PCR扩增仪

实时荧光定量PCR扩增仪

梯度PCR仪

原位PCR仪

返回节目录80荧光实时定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。81实时荧光定量PCR仪

金属板式实时定量PCR仪

离心式实时定量PCR仪

各孔独立控温的定量PCR仪82金属板式实时定量PCR仪可作为普通PCR仪使用可带梯度功能可容纳的样本量大，无需特殊耗材温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致

83ABI7500荧光定量PCR仪

MJ公司Chromo4荧光定量PCR仪

Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪84离心式实时定量PCR仪温度均一性较好使用的是同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能

85Rotor-Gene3000荧光定量PCR仪

LightCycleTM荧光定量PCR仪

86LightCycleTM荧光定量PCR仪结构示意图

87各孔独立控温的定量PCR仪不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，适合多指标快速检测。SmartCyclerⅡ的软件允许一台仪器同时操作六个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯度反应。SmartCyclerⅡ上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。88SmartCyclerⅡ荧光定量PCR仪89三、PCR扩增仪的性能指标（一）温度控制

温度的准确性

温度的均一性

升降温的速度不同模式下的相同温度特性

返回节目录90（二）荧光检测系统

激发光源

检测器

发光二极管

卤钨灯光源

超低温CCD

光电倍增管

91（三）软件简便的人性化设计最能满足其需求。新型的PCR仪很注重程序编写的简易性，易学易用，还具有实时信息显示、记忆存储多个程序、自动倒记时、自动断电保护等功能，很多还可以免费升级。92（四）其他多样化样品基座设计、热盖等都使PCR仪越来越人性化。93四、PCR扩增仪的操作规程与常见故障

（一）PCR扩增仪的操作规程普通PCR扩增仪的操作非常简便，接通电源，仪器自检，设置温度程序或调出储存的程序运行即可。定量PCR扩增仪的操作和普通PCR仪基本相同。

返回节目录94①荧光染料污染样品孔；②PCR管融化，原因可能是温度传感器出问题或是热盖出问题；③个别孔扩增效率差异很大，可能的原因是半导体模块出现坏点；④荧光强度减弱或不稳定，产生的原因有滤光片发霉或有水汽，或光源损耗（以卤钨灯为光源的），需更换光源；或需调节检测元件灵敏度；⑤仪器工作时出现噪音。以上故障部分可自行检查，部分需工程师检修。

（二）PCR扩增仪的常见故障及排除95五、PCR扩增仪的应用

（一）感染性疾病的分子诊断和研究（二）遗传性疾病的分子诊断和研究（三）恶性肿瘤的分子诊断和研究（四）PCR扩增仪在移植配型上的应用（五)PCR扩增仪在法医学上的应用

(六)PCR扩增仪在分子生物学领域的应用

返回节目录96思考题

1．简述流式细胞仪生物学颗粒分析原理。2.流式细胞仪的基本结构由哪几部分组成？

3.PCR基因扩增仪的工作关键是什么？按照变温方式的不同可分哪几类？返回节目录97以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均一性好，无边缘效应。体积大