整套教学课件《仪器分析-色谱》

分离分析篇

SeparationAnalysis中山大学本科教学－仪器分析本章教学要求掌握学习要点

背公式？会计算？基本概念、理论！会活学活用！广泛阅读

知识面、深度、多学科融会贯通课堂、课外小作业每章小结自愿完成参考书目卢佩章等编《色谱理论基础》科学出版社（1997）色谱技术丛书：（13册）化学工业出版社汪尔康主编，21世纪的分析化学，科学出版社，1999PrinciplesandPracticeofChromatography，RaymondP.W.ScottPracticalHPLCMethodDevelopment，2nd,LloydR.Snyder,JosephL.Glajch,JosephJ.Kirkland,1997俞惟乐等编著《毛细管气相色谱和分离分析新技术》达世禄等编著《色谱学导论》第二版现代分离科学理论导引,高等教育出版社,耿信笃著

2001年8月生物大分子的液相色谱分离和制备,科学出版社,师治贤等编著国内外色谱主要期刊J.Chromatogr.AandJ.Chromatogr.B（荷兰）Chromatographia（德国）J.ChromatographicSci.（美国）J.Liq.Chrom.&Rel.Technol.J.HighResol.Chromatogr.J.MicrocolumnSep.LC-GCAnalyticalChemistryAnalystTrendinAnalyticalChemistryAnalyticalChemistryActaTalanta《色谱》《分析化学》《高等化学学报》CNKI知识网络服务平台——中国期刊全文数据库

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什么是分离？物质的分离是化学中最基本的研究手段，也是最重要的实验技术。

沉淀分离、萃取、柱层析等分离是利用物质的物理与化学性质的差异来实现的。分离非自发过程，在热力学上是受阻的，分离过程必须做功分离的定义化工词典：把混合物中某些组分或各组分彼此分开，或把混合物中各相间彼此分开的过程叫分离。Separationisanoperationinwhichamixtureisdividedatleasttwocomponentswithdifferentcompositionsortwomoleculeswiththesamecompositionbutdifferentstereochemicalstructure.分离科学在化学中的地位21世纪的化学可以定位为“创造和识别泛分子的科学”。

－引自徐光宪：从外行人的眼里远看“21世纪的分析化学”

CASRegNo

登录的分子数平均每天增加两万多个，其中识别和创造的分子数之比是2:1制备型分离/纯化分析型分离分离分析按分离目的分类要求高纯度、高回收率产物规模：实验室；生产/工程测定物质结构和性质的分离：高纯度；但不一定要求高收率要求“定量”概念，即考虑分离程度的完全性；定量分离的可能性；简单快速；分离结果具有良好的再现性一类仪器分析方法，其特征就是分离分析系统化，即分离过程与检测技术有机结合起来构成一种新型的分析技术分离与色谱

差异大，易分离：如特效化学反应，生物亲和力，用于二元分离差异小，难分离：高效/高性能分离技术，如色谱、电泳，用于多组分分离

色谱法是有符合统计规律数目的分子群在两相间连续多次分配，利用其分配系数的差异来达到分离的目的。主要内容一、色谱学导论二、气相色谱三、高效液相色谱四、毛细管电泳五、色谱分析中的样品前处理技术第一节色谱学导论1.1概述1.2概念和术语1.3基本理论1.4定性定量方法

前言色谱技术不管是在关乎国计民生的问题还是在基础科学研究中都发挥了重要的作用。食品安全问题！三聚氰胺色谱与日常生活

2005年3月29日，国家质检总局和国家标准委联合发布了有关苏丹红检测方法国家标准———《食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法》（GB/T19681-2005）。标准编号：GB/T5009.192-2003动物性食品中克伦特罗残留量的测定第一法气相色谱—质谱法为0.5μg/kg;第二法高效液相色谱法为0.5μg/kg；第三法酶联免疫法为0.5μg/kg。色谱与科学研究多维液相色谱与蛋白组学一个简单的实验Asimpleexperimentfromschool1.1

概述固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚

色带1903年由俄国植物学家Tsweet创立1.1.1

色谱法产生和发展Chromatography chroma

=

colour graphein=towrite20世纪40年代纸色谱20世纪50年代薄层色谱1952年James和Martin发明了气相色谱法(重要标志）1957年Golay开创了毛细管气相色谱法20世纪60年代末高效液相色谱20世纪80年代初Jorgenson发展的毛细管电泳20世纪90年代毛细管电色谱色谱的发展辛格(RichardSynge)马丁(ArcherMartin)英国生物化学家由于马丁与辛格合作研究发明了一种快速而又经济的分析技术，即分配色谱，使化学、医学和生物学研究得到广泛的进展。为此，马丁和辛格共同获得了1952年的诺贝尔化学奖，时年42岁和38岁。色谱与诺贝尔奖色谱分析在不同时期的作用30～40年代：为揭开生物世界的奥秘，为分离复杂的生物组成发挥了他独特的作用；60～70年代成为石油化工、化学工业等部门不可缺少的分析监测工具。目前色谱法是生命科学、材料科学、环境科学、医药科学、食品科学、法庭科学以及航天科学等研究领域的重要手段。各种色谱仪器已经成为各类研究室、实验室极为重要的仪器设备。1.1.2

色谱概念及分离原理

色谱法是一种用来分离分析多组分混合物质的方法。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。Chromatographyisessentiallyaphysicalmethodofseparationinwhichcomponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophase,oneofwhichdoesnotmove(appropriatelycalledthestationaryphase)andtheotherthatmovesthroughitinadefinitedirection(commonlydescribedasthemobilephase).慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液分离原理：基于各组分在两相之间平衡分配的差异。差异：包括吸附、分配、离子交换、亲和力及分子体积大小分配系数的微小差异→微小差异积累→较大差异→与固定相作用弱的组分先流出；作用强的组分后流出。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测色谱法的分离过程色谱分离过程是在色谱柱内完成的，以气相色谱为例：

当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;

随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;

挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;

随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。1.1.3色谱法分类(1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱(2)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。

离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。(3)其他色谱方法薄层色谱和纸色谱：比较简单的色谱方法超临界流体色谱:CO2流动相毛细管电泳:1990年代快速发展起来的、特别适合生物试样分析分离的高效分离分析技术。按固定相的固定方式分：平面色谱

纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱色谱

填充柱色谱整体柱色谱毛细管柱色谱

按分离机制分：

分配色谱：利用分配系数的不同

吸附色谱：利用物理吸附性能的差异

离子交换色谱：利用离子交换原理

空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同按色谱仪使用领域分类分析型色谱制备用色谱仪流程色谱1.1.4色谱法与其他分析方法比较的特点（1）分离效率高复杂混合物、手性异构体等（2）定性困难

光谱、质谱可提供物质的结构信息，色谱本质上不具备定性分析功能。（3）联用色谱与光谱、电化学分析、质谱联用是重要发展方向之一。1.2

色谱学基本概念和术语(1)色谱过程流动相、固定相、溶质样品在柱内运行两个特点：

1.混合物不同组分在柱内的差速迁移；

2.同种组分分子在迁移过程的分子分布离散。1.分配系数(partitionfactor)K

组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数，用K表示，即：分配系数是色谱分离的依据。1.2.1

基本概念2.分配比

(partitionradio)k分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：1、分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化；

2、分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长；

3、分配比可以由实验测得。分配比也称：容量因子(capacityfactor)或容量比容量因子与分配系数的关系

式中β为相比，VM为流动相体积，VS为固定相体积容量因子与保留时间的关系1.2.2色谱流出曲线和术语从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(ii)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析(iii)根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(v)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。

1、基线无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2、峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。3、峰面积色谱曲线与基线包围的面积信号进样空气峰色谱峰峰高h基线a4保留值

(1)

死时间t0

不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。

信号进样t0测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与t0的比值计算，

ū=L/t0(2)

保留时间tr

试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间。信号进样tr(3)

调整保留时间tr´

tr´=tr

t0

由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间。tr´

（4）用体积表示的保留值保留体积（VR）：

VR=tR×F0F0为柱出口处的载气流量死体积（Vo）：

V0=t0×F0调整保留体积(VR＇)：

V

R＇=VR

－VM

5、相对保留值α

组分2与组分1调整保留值之比：

α=t´R2

/t´R1=V´R2/V´R1

相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。6、区域宽度

用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354（3）峰底宽(Wb)：Wb=47、分离度定义：两倍峰顶距离除以两峰宽之和。

2（tR（2）-tR（1））

R=——————————W（1）+W（2）

N1/2

-1

kR=——（——）（——）

4

k-1最佳的分离度：流出峰相隔足够远——色谱热力学因素峰宽应尽可能窄——色谱动力学因素色谱分离中的四种情况如图所示①柱效较高，△K(分配系数)较大,完全分离；②△K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；③柱效较低，△K较大,但分离的不好；④△K小，柱效低，分离效果更差。R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。影响分离度的因素分离度与柱效的关系当物质对和固定相确定时：分离度与容量因子的关系分离度与选择因子的关系

α=1.0时，R=0

α的微小变化就能引起分离度的显著改变主要通过改变固定相和流动相实现色谱基本概念小结需掌握：1.什么是死时间？保留时间？调整保留时间？2.分配系数与容量因子的区别，分别受哪些因素影响？3.色谱分析根据什么定性、定量？4.相对保留值α和分离度R概念有何不同？它们分别受哪些因素影响？1.3、基本理论色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径柱效与分离度的评价指标及其关系组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；

(组分和固定相的结构和性质)

色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；

(两相中的运动阻力、扩散)两种色谱理论：塔板理论和速率理论；塔板理论的假设：在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到(2)将载气看作成脉动（间歇）过程(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略(4)每次分配的分配系数相同1.3.1、塔板理论

（1）塔板理论(platetheory)

一个半经验理论：将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复(类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程)；分离过程如下图所示色谱流出曲线的数学描述

色谱峰为正态分布时，色谱流出曲线上的浓度与时间的关系为：

当色谱峰为非正态分布时，可按正态分布函数加指数衰减函数构建关系式。HH/2WH/2开始tR（2）塔板数和塔板高度

单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高用不同物质计算可得到不同的理论塔板数组分在t0时间内不参与柱内分配，需引入有效塔板数和有效塔板高度：（3）塔板理论的特点和不足(1)对色谱流出曲线分布形状和谱带移动规律给于近似的解释(2)

提出了计算和评价柱效高低的参数。当色谱柱长度一定时，塔板数n

越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高。(3)

塔板理论没有将理论塔板高度与色谱参数定量联系起来。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同的实验结果。(4)塔板理论假设的错误假设中忽略了分子纵向扩散的作用是不合理的分配系数不随溶质的浓度的变化而变化的假设只能在一定的浓度范围内成立假设流动相的运动是跳跃式的，不连续的，这于实际色谱过程完全向背离1.3.2、速率理论（1）速率方程（也称范.弟姆特方程式）

H=A+B/u+Cu

H：理论塔板高度，

u：流动相的线速度(cm/s)

减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；

A、B、C三项各与哪些因素有关？A─涡流扩散项

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径

λ：固定相的填充不均匀因子

固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。B/u—分子扩散项

B=2νDν：弯曲因子，填充柱色谱，ν<1。

D：试样组分分子的扩散系数（cm2·s-1）

(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(3)与温度有关，温度↑，扩散↑(4)扩散系数：Dg

∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓

(5)对于液相色谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略

k为容量因子；dp为担体粒度；df为液膜厚度；Dg

、DL为扩散系数。

减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。Cu—传质阻力项

气液色谱：传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即：

C=（Cg+CL）液相色谱：传质阻力系数（C）包含流动相传质阻力系数（Cm）和固定相传质阻力系数（Cs），即

C=Cm+Cs

Cm=mdp2/Dm+smdp2/Dm与固定相粒度dp的平方成正比，与试样分子在流动相中的扩散系数Dm成反比，ωm是由柱和填充的性质决定的因子。

液相色谱速率方程

2Dmqk

df2f(k)dp2Cmsdp2H=2dp+

———

+(

————+——————+————)u(1+k

)2Ds

DmDm固定相的粒度愈小，微孔孔径愈大，填充越均匀，柱效就高。对高效液相色谱固定相的设计就是基于这一考虑。(2)GC和LC的H-u图（VanDeemter曲线）气相色谱载气流速与柱效——最佳流速载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速，柱效。H-u曲线与最佳流速：以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。(3)速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、流动相种类及流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约，如流动相流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。色谱基础理论小结塔板理论和速率理论各有何特点？根据速率理论方程，色谱填料粒径、填充均匀性、载气种类、流速、分离温度等条件是怎样影响柱效的？1.4

色谱分析方法建立1

选择合适的仪器

GCorHPLC检测器色谱柱2

对样品进行合适的前处理3

分离条件优化4

色谱定性、定量分析1.4.1色谱定性分析

（1）利用纯物质对照定性保留时间或保留距离定性。

适用于组分性质已有所了解，组成比较简单，有纯物质的未知物。（2）加入已知物增加峰高法（3）保留值经验规律定性法

碳数规律：

lgtR=A1+B1n（4）保留指数定性法

保留指数也是一种相对保留值，它是把正构烷烃中某两个组分的调整保留值的对数作为相对的尺度，并假定正构烷烃的保留指数为n100。被测物的保留指数值可用内插法计算。

(5)双柱、多柱定性

（6）与结构分析仪器联用定性红外光谱、质谱、核磁共振、元素分析

离线：

LC样品收集：挥发性溶剂，易去除的缓冲液。

GC样品收集：低温冷阱、低温吸附或溶剂溶解。

IR-KBr粉末吸收

在线：GC-MS;LC-MS.1.4.2

色谱定量分析（1）峰高、峰面积对称形峰面积的测量——

峰高乘以半峰宽法不对称形峰面积的测量——

峰高乘平均峰宽法。自动积分：基线较平，分离较好。手动积分：基线波动较大。绝对校正因子：

fi=mi/Ai相对校正因子：

fi=（mi/Ai）/（ms/As）=（mi/ms）（As/Ai

）（2）定量校正因子含量 100 100200面积 3000 2500 4000归一化法

所有出峰组分的含量之和按100%计的定量方法。

Pi%=(mi/m)100%=Aifi/(A1f1+A2f2++Anfn)100%

简单、准确，不必称样和定量进样，操作条件变化时对定量结果影响不大。但样品的所有组分必须全部出峰。此外，测量低含量尤其是微量杂质时，误差较大。（3）定量计算方法外标法

用被测化合物的纯品作为标准样品，配制成一系列的已知浓度的标样。

在一定范围内，标样的浓度与响应值之间存在较好的线性关系。

实验条件要求高，如检测器的灵敏度，流速、流动相组成的不能发生变化；每次进样体积要有好的重复性。

外标法的优点：操作、计算简单，是一种常用的定量方法。

无需各组分都被检出、洗脱。

需要标样。

标样及未知样品的测定条件要一致。

进样体积要准确。外标法缺点：内标法

将一定量的纯物质作为内标物加入到准确称量的试样中，根据试样和内标物的质量以及被测组分和内标物的峰面积可求出被测组分的含量。

Pi%=(mi/m)100%=msAifi/Asfsm100%对内标物要求：a．内标物须为原样品中不含组分b．内标物与待测物保留时间应接近且R>1.5c．内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质

内标法抵消了上样体积，乃至流动相、检测器的影响，因此比外标法精确。

内标法优点制样要求高；找合适内标物困难；已知校正因子。内标法缺点(4)分析方法的验证线性范围：精密度：不同浓度水准RSD。一般RSD≤1.5%,痕量分析可放宽到10%。检出限：以三倍的平均噪声S0计算方法D.L.=3S0/S(其中为S为灵敏度，即分析校准曲线的斜率)定量下限≥10S0/S回收率计算方法思考题色谱理论还存在哪些不足？有何新研究成果？国标中三聚氰胺的几种色谱分析方法各有何优缺点？色谱常用的定量校正方法有哪些？各有何特点？第二节气相色谱法

(gaschromatography,GC)2.1、气相色谱仪2.2、气相色谱固定相2.3、气相色谱检测器2.4、气相色谱方法开发2.5、气相色谱新技术前言气相色谱的出现实际上较液相色谱(1903Tswett)

晚50年。1952年英国人马丁和辛格发表第一篇GC论文。1955年推出第一台商品化仪器。1958年毛细管GC柱问世。1979年出现弹性石英毛细管气相色谱。气相色谱已经是一门成熟的分析化学分支。气相色谱发展过程气相色谱基本原理GC是以气体为流动相。GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。气相色谱分类按色谱柱分：填充柱、开管柱按固定相状态分：气固色谱、气液色谱按分离机理分：分配色谱、吸附色谱按进样方式分：常规色谱、顶空色谱、裂解色谱气相色谱法的特点分离效率高

对性质极为相似的同分异构体、同位素等有很强的分离能力，能分析沸点十分接近的复杂混合物。例如用毛细管柱可分析汽油中50~100多个组分。灵敏度高

使用高灵敏度检测器可检测出10-11~10-13g的痕量物质。分析速度快

一般完成一个样品的分析，仅需几分钟。样品用量很少

通常气体样品仅需要1mL，液体样品仅需1μL。气相色谱法的应用范围应用范围：沸点在450℃以下，能气化气相色谱法的不足之处色谱峰不能直接给出定性的结果分析无机物和高沸点有机物时比较困难1-载气钢瓶；2-减压阀；3-净化干燥管；4-针形阀；5-流量计；6-压力表；4-针形阀；5-流量计；6-压力表；9-热导检测器；10-放大器；11-温度控制器；12-记录仪；载气系统进样系统色谱柱检测系统温控系统2.1、气相色谱仪2.1.1、气相色谱结构流程2.2.2气路系统常用的气路连接图

主供气体氦气色谱仪脱氧管脱水管开关阀二级减压阀主供气开关阀要求：载气纯净(99.999%)、密闭性好、流速稳定及流速测量准确.

载气：是载送样品进行分离的惰性气体。常用的载气为氮气、氢气（在使用氢火焰离子化检测器时作燃气，在使用热导检测器时常作为载气）、氦气、氩气（由于价格高，应用较少）

气体钢瓶和减压阀：载气一般可由高压气体钢瓶或气体发生器来提供。由于气相色谱仪使用的各种气体压力为0.2~0.4Mpa，因此需要通过减压阀使钢瓶气源的输出压力下降。气体净化器

杂质：永久气体、低分子有机化合物、水蒸气分子筛：除有机杂质

活化：400-600℃,活化4-6h

硅胶：除水蒸气

活化：140℃,活化4-6h

氧气捕集器：ECD检测器和极性强的毛细管柱，容易因氧化而变坏载气流量的测定柱前：转子流量计柱后：皂膜流量计

流量稳定性直接影响分析重现性一般早期或国产仪器由开关阀、稳压阀、稳流阀、针阀、阻尼管控制EPC气路控制技术20世纪90年代初出现——HP公司采用电子压力传感器和电子流量控制器，通过计算机实现压力和流量的自动控制气路控制系统2.1.3、进样装置

进样装置：进样器+气化室；

液体进样器：

气体进样器（六通阀）：推拉式和旋转式两种。试样首先充满定量管，切入后，载气携带定量管中的试样气体进入分离柱；

气化室：将液体试样瞬间气化的装置。热容量要大，温度要足够高，气化室体积尽量小，无死角，以防止样品扩散，减小死体积，提高柱效。

无催化作用——石英玻璃衬管衬管填充柱进样口汽化室温度分布毛细管柱进样口（分流）不分流与分流进样色谱图比较气相色谱其他进样方式冷柱头进样程序升温汽化进样大体积进样阀进样顶空进样裂解进样2.1.3、色谱柱色谱柱是色谱系统的心脏！色谱柱类型填充柱柱管：玻璃管柱、不锈钢柱、聚四氟乙烯柱内径一般为2-4mm，长0.5-3m；形状为U形或螺旋形；柱填料：粒度为60-80或80-100目的色谱固定相。液-固色谱：固体吸附剂液-液色谱：担体+固定液

柱制备对柱效有较大影响，填料装填太紧，柱前压力大，流速慢或将柱堵死，反之空隙体积大，柱效低。有关固定相性质及其选择见下一节。1958年Golay提出,1979年弹性石英毛细管产生材料：弹性石英尺寸：内径0.1-0.8mm

长度一般在25～100m

毛细管柱（开管柱）开管柱特点渗透率高，柱阻抗小。适合于快速分析柱效高。A=0，且柱长为填充柱的10-100倍。柱容量小。开管柱固定液含量一般只有几十毫克，有效分离样品量小。类型：

(1)壁涂开管柱(WCOT)(2)多孔层开管柱(PLOT)内壁上有多孔层的空心柱

(3)载体涂层开管柱(SCOT)

用二氧化硅、氧化铝、分子筛、硅藻土等很细颗粒粘附在柱内壁，再涂固定液。毛细管气相色谱与填充柱气相色谱操作不同之处1进样量少，常分流进样进样小了没有代表性，进样大了色谱柱超载，影响分离效果。2安装尾吹装置加速柱末端载气的流速，减少由于死体积大造成的峰展宽2.1.4、温度控制系统气化室、分离室、检测器三部分在色谱仪操作时均需控制温度；

气化室：保证液体试样瞬间气化；一般仪器的最高汽化温度为350～420℃

检测器：保证被分离后的组分通过时不在此冷凝；

分离室：对分离产生重大影响。

程序升温为什么要进行程序升温？通过程序升温，可以使沸点相差较大的混合物在适合的温度下获得好的分离度，并提高分析速度2.1.5、检测器

检测器是色谱仪的“眼睛”！检测器的作用是将经色谱柱分离后顺序流出的化学组分的信息转变为便于记录的电信号，然后对被分离物质的组成和含量进行鉴定和测量。通常由检测元件、放大器、显示记录三部分组成；2.2、气相色谱固定相2.2.1、气固色谱固定相1.种类

(1)活性炭

非极性，有较大的比表面积，吸附性较强。

(2)活性氧化铝

中等极性，适用于常温下O2、N2、CO、CH4、C2H6、C2H4等气体的相互分离。CO2能被活性氧化铝强烈吸附而不能用这种固定相进行分析。

(3)硅胶

强极性，与活性氧化铝大致相同的分离性能，除能分析上述物质外，还能分析CO2、N2O、NO、NO2等。

(4)分子筛碱及碱土金属的硅铝酸盐（沸石），多孔性。除了广泛用于H2、O2、N2、CH4、CO等的分离外，还能够测定He、Ne、Ar、NO、N2O等。

(5)高分子多孔微球

新型的有机合成固定相（苯乙烯与二乙烯苯共聚）。适用于水、气体及低级醇的分析。2、气固色谱固定相的特点（1）性能与制备和活化条件有很大关系；（2）同一种固定相，不同厂家或不同活化条件，分离效果差异较大；（3）种类有限，能分离的对象不多；（4）使用方便。2.2.2、气液色谱固定相

气液色谱固定相[填充柱：固定液+担体（载体）]：[开管柱：固定液直接涂在毛细管内壁]固定液特点：固定液在常温下不一定为液体，但在使用温度下一定呈液体状态。固定液的种类繁多，选择余地大，应用范围不断扩大。担体：化学惰性的多孔性固体颗粒，具有较大比表面积。（1）担体a.硅藻土红色担体：孔径较小，表孔密集，比表面积较大，机械强度好。适宜分离非极性或弱极性组分的试样。缺点是表面存有活性吸附中心点。白色担体：煅烧前原料中加入了少量助溶剂（碳酸钠）。颗粒疏松，孔径较大。比表面积较小，机械强度较差。但吸附性显著减小，适宜分离极性组分的试样。b.玻璃微球

具有很小的表面积，非孔性、表面惰性的载体。主要优点是能在较低的柱温下分析高沸点物质，使某些热稳定性差但选择性好的固定液获得应用。缺点是柱负荷量小，只能用于涂渍低配比固定液。c．氟载体

耐腐蚀性强，适合于强极性物质和腐蚀性气体的分析。缺点是表面积较小，机械强度低，对极性固定液的浸润性差。担体的预处理

酸洗法酸洗可除去担体表面的铁等金属氧化物杂质。酸洗后的载体可用于分析酸性物和酯类样品。

b．碱洗法碱洗可以除去载体表面的Al2O3

等酸性作用点。c．硅烷化处理硅烷化处理是指利用硅烷化试剂处理载体，使载体表面的硅醇和硅醚基团失去氢键力，消除了色谱峰拖尾现象。（2）固定液

高沸点难挥发的有机化合物，种类繁多。对固定液的要求应对被分离试样中的各组分具有不同的溶解能力，较好的热稳定性，并且不与被分离组分发生不可逆的化学反应，较低蒸气压，以免流失。载气是惰性的，主要作用是：组分和固定液的作用如何选择固定液？1．相似相溶原则

这一原则是人们研究物质溶解过程时总结出来的规律，即溶质和溶剂在极性、官能团和化学性质等相似时，可以相互溶解。气相色谱中，被分离物质和固定液的极性、结构、官能团相似时，二者的作用力强，保留时间就长。

“极性混合物用极性固定液进行分离(定向力），非极性混合物用非极性固定液进行分离(色散力）”

该原则不是在任何情况下都有效的。

例如分离苯和环己烷时使用非极性固定液反而不好，而使用极性固定液就可以把二者分开。

同系物或相同官能团的混合物组分在沸点上有差别时，使用相似相溶原则有效。2．固定液和被分离物分子间的特殊作用力

所谓特殊作用力是指除色散以外的几种作用力

（1）诱导力

强极性固定液可以使易极化的非极性化合物产生诱导力。

例：苯和环己烷在β，β-氧二丙腈上十分容易分离。思考：分子结构？（2）氢键力例如：二甲胺和三甲胺在甘油固定液上可得到很好的分离。

（3）利用形成超分子的固定液

超分子化学（supramolecularchemistry）的概念是：“超出单个分子的化学”，“按照需要形状设计出的分子进行分子间相互作用的化学”。

冠醚－－环糊精－－杯芳烃超分子化学对研究色谱的分离的机理以及设计特殊选择性分离介质具有重要的指导意义。

(4)混合固定相

对于复杂的难分离组分通常采用特殊固定液或将两种甚至两种以上配合使用；例如：用全戊基β-环糊精（ppβ-CD）与AgNO3（聚乙二醇400作溶剂）组成混合固定液，分离二甲苯异构体。沸点：o-144.4℃

;m-139℃;p-138.37

(1)固定液的相对极性规定：角鲨烷（异三十烷）的相对极性为零，β,β’-氧二丙睛的相对极性为100。固定液的特性固定液的相对极性：不同极性GC柱分离举例(2)固定液特征常数

罗氏常数和麦氏常数罗氏常数：ΔI=Ip(待测固定液）-Is（角鲨烷）表优选固定液麦氏常数：x’、y’、z’、u’、s’表示，分别代表了极性分子间存在着的静电力（偶极定向力）；极性与非极性分子间存在着的诱导力；非极性分子间的色散力；氢键等。也可以用五个数的总和来表示固定相的极性大小，如：β，β’—氧二丙睛五个常数的总和为4427，是强极性固定相。固定液的一般选择规律非极性组分——非极性固定液——沸点低的物质先流出；极性物质——极性固定液——极性小的物质先流出；各类极性混合物——极性固定液——极性小的物质先流出；氢键型物质——氢键型固定液——不易形成氢键的物质先流出；复杂混合物——两种或以上混合固定液毛细管柱商品化常用固定液毛细管色谱柱最常用的是聚硅氧烷和聚乙二醇

聚硅氧烷标准的聚硅氧烷是由许多单个的硅氧烷链接而成。每个硅原子与两个功能基团相连，最常见的功能基团为甲基和苯基，此外还有氰丙基和三氟丙基。

非极性：由100％甲基取代的，相应的柱子牌号有：HP-1、BP-1、DB-1、SE-30等。弱极性：例如：5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷表示其包含有5％的苯基基团和95％的甲基基团，相应的柱子牌号有：HP-5、BP-5、DB-5、SE-54等。中等极性：如50％苯基-甲基聚硅氧烷表示甲基的含量为50％)。相应的柱子牌号有：HP-50+、BPX-200、DB-17等。

2.聚乙二醇

聚乙二醇的稳定性、使用温度范围都比聚硅氧烷要差一些。但由于它的极性比较强，对极性物质有特殊的分离效能，所以仍是我们常用的固定相之一。2.3、气相色谱检测器理想的检测器：2.3.1、检测器性质、分类浓度型检测器：测量的是载气中通过检测器组分浓度瞬间的变化，检测信号值与组分的浓度成正比。热导检测器、电子捕获检测器；

质量型检测器：测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即检测信号值与单位时间内进入检测器组分的质量成正比。氢火焰离子化检测器和火焰光度检测器

广普型检测器：

对所有物质有响应，热导检测器；

专属型检测器：对特定物质有高灵敏响应，电子俘获检测器；2.3.2、检测器种类（1）热导检测器thermalconductivitydetector,TCDa.热导检测器的结构池体（一般用不锈钢制成）热敏元件：电阻率高、电阻温度系数大、且价廉易加工的钨丝制成。

参考臂：仅允许纯载气通过，通常连接在进样装置之前。

测量臂：需要携带被分离组分的载气流过，则连接在紧靠近分离柱出口处。b、检测原理

不同的气体有不同的热导系数。钨丝通电，加热与散热达到平衡后，两臂电阻值：

R参=R测

;R1=R2

则：R参·R2=R测·R1

无电压信号输出；进样后：测量臂和参考臂的电阻值不等，产生电阻差，R参≠R测

，则：

R参·R2≠R测·R1（2）氢火焰离子化检测器flameionizationdetector,FIDa、特点

(1)典型的质量型检测器;(2)对有机化合物具有很高的灵敏度;(3)无机气体、水、四氯化碳等含氢少或不含氢的物质灵敏度低或不响应;(4)氢焰检测器具有结构简单、稳定性好、灵敏度高、响应迅速等特点;(5)比热导检测器的灵敏度高出近3个数量级。b、氢焰检测器的结构

(1)在发射极和收集极之间加有一定的直流电压（100—300V）构成一个外加电场。(2)氢焰检测器需要用到三种气体：N2：载气携带试样组分；H2：为燃气；空气：助燃气。使用时需要调整三者的比例关系，检测器灵敏度达到最佳。c、氢焰检测器的原理

(1)当含有机物CnHm的载气由喷嘴喷出进入火焰时，在C层发生裂解反应产生自由基：CnHm──→·CH(2)产生的自由基在D层火焰中与外面扩散进来的激发态原子氧或分子氧发生如下反应：·CH+O──→CHO++e(3)生成的正离子CHO+与火焰中大量水分子碰撞而发生分子离子反应：CHO++H2O──→H3O++CO(4)化学电离产生的正离子和电子在外加恒定直流电场的作用下分别向两极定向运动而产生微电流（约10-6～10-14A）；(5)在一定范围内，微电流的大小与进入离子室的被测组分质量成正比，所以氢焰检测器是质量型检测器。(6)离子电流信号输出到记录仪，得到峰面积与组分质量成正比的色谱流出曲线（3）电子捕获检测器electroncapturedetector,ECD

高选择性检测器，仅对含有卤素、磷、硫、氧等元素的化合物有很高的灵敏度，检测下限10-14g/mL，对大多数烃类没有响应。

较多应用于农副产品、食品及环境中农药残留量的测定。（4）其他检测器火焰光度检测器(flamephotometricdetector,FPD)

化合物中硫、磷在富氢火焰中被还原，激发后，辐射出400、550nm左右的光谱，可被检测；该检测器是对含硫、磷化合物的高选择性检测器；热离子检测器(thermionicdetector,TID)

氮、磷检测器；对氮、磷有高灵敏度；在FID检测器的喷嘴与收集极之间加一个含硅酸铷的玻璃球，含氮、磷化合物在受热分解时，受硅酸铷作用产生大量电子，信号强；

气相色谱与定性仪器联用如：气相色谱-质谱联用仪总离子流图TIC(Scan)

模式m/zRetentiontimeTIC:Scan7254152MS质谱图2.4、气相色谱分离分析条件选择原则：

(1)柱长L

由分离度R的定义可得(R1/R2)2=n1/n2=L1/L2

即柱越长，理论塔坂数越多，分离越好。

但柱过长，分析时间增加且峰宽也会增加，导致总分离效能下降，因此柱长L要根据R的要求(R=1.5)，选择刚好使各组分得到有效分离为宜。(2)载气及流速u当u较小时，B/u占主要，此时选择分子量大的载气，使组分的扩散系数小；当u较小时，B/u占主要，此时选择分子量大的载气，使组分的扩散系数小；柱温降低升高传质快、纵向扩散强过高造成固定液流失分析时间长恒温程序升温(宽沸程混合物)实验确定(3)柱温(4)进样方式及进样量要以“塞子”的方式进样，以防峰形扩张；进样量，也要以峰形不拖尾为宜。例1：血液中酒精含量测定

自动顶空-气相色谱-质谱法测定血液中乙醇含量例2:蔬菜中有机氯类农药残留气相色谱分析2.5气相色谱新技术快速气相色谱便携式气相色谱仪全二维气相色谱;高温气相色谱极快速气相色谱全二维气相色谱农药分析便携式气相色谱仪思考题1、气相色谱的检测器有哪些？各适用于哪些物质的检测？2、毛细管气相色谱为什么要分流进样和用尾吹装置？3、气相色谱中主要调节什么参数改善分离？为什么要程序升温？第三节高效液相色谱法High-performanceliquidchromatography3.1、高效液相色谱仪3.2、固定相与流动相3.3、分离类型与原理3.4、日常操作和维护168经典LC与HPLC的比较经典LCHPLC柱内径1~5cm~0.46cm柱长50~100cm15~25cm粒径150~200µm~5µm柱压1~10atm50~200atm分离时间0.5h~天10~60min169

HPLC与GC的比较分析对象及范围：GC占有机物总数20%；HPLC可分析高沸点、高分子量的化合物，占有机物总数80%。流动相的选择：GC为有限几种“惰性”气体，只起运载作用；HPLC为混合液体，选择机会多。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。检测器：GC灵敏度普遍高。柱效：毛细管GC可通过增加柱长提高总塔板数。分析成本：HPLC高柱外效应：HPLC突出170高效液相色谱法的特点高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。1713.1、液相色谱仪及主要部件1、流程1722、主要部件(1)高压输液泵

压力：150～350×105Pa。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性173输液泵种类：恒压型和恒流型

恒压泵可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动。

恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵，脉动小。174马达往复式拉动密封溶剂球阀脉动阻尼器到色谱柱机械往复柱塞泵示意图单向阀175高压梯度及低压梯度(2)梯度淋洗装置176(3)进样装置六通阀177178(4)色谱柱

柱体为直型不锈钢管，常轨内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。复杂样品分析常使用预柱。179色谱柱装填常采用四氯化碳作悬浮液，同时加入二氧六环作分散剂，有助于粒子分散.

180(5)液相色谱检测器

a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。

特点：灵敏度高；线性范围宽；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

181182b.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。183184光电二极管阵列检测器185c.示差折光检测器

可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；

通用型检测器（每种物质具有不同折光指数）

灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱偏转式、反射式和干涉型三种186d.荧光检测器

高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；187

电导检测器主要用于离子色谱的检测。其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。e.电导检测器188f质谱检测器与气相色谱-质谱联用相比，液相色谱与质谱联用要求更高189液相色谱固定相基本要求要耐高压3.2、固定相与流动相3.2.1、液相色谱固定相按基质不同可分为无机基质和有机基质两大类。无机基质主要包括：二氧化硅、氧化铝、氧化锆、分子筛、羟基磷灰石等。

机械强度高、溶胀性小、耐高压、柱效高。应用相对更为广泛。

有机基质：各类有机聚合物，目前主要用于离子交换和体积排阻色谱

化学稳定性好、表面性质均匀，但机械强度不高，易于溶胀，传质阻力大，柱效低。190（2）全多孔型早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（1）表面多孔型

（薄壳型微珠担体）30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量低。

硅胶基质类型191192（3）化学键合固定相

化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N193表面修饰功能团类型：反相：C18、C8、苯基；正相：氰基、二醇基或氨基；离子交换：磺酸基、季胺；亲和：蛋白质手性：纤维素、环糊精194填料的端基封口封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1%-1%）使用三甲基氯硅烷（TMCS）或六甲基二硅烷（HMDS）等小分子的硅烷进行处理195液相色谱流动相需满足的基本条件:（1）尽量使用高纯度试剂作流动相。（2）化学稳定性好避免流动相与样品发生作用。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。3.2.2、液相色谱流动相(5)低黏度196溶剂的强度和极性混合溶剂极性：P=ψ1P1+ψ2P2197溶剂选择性1983.3

HPLC分离模式液固吸附色谱液液分配色谱离子交换色谱离子对色谱体积排阻色谱亲和色谱不同的分离模式是不同的机理199色谱分离法的分类（原理）吸附色谱排阻色谱分配色谱离子交换色谱吸附能力的差异分子尺寸的大小不同两相中分配系数的不同亲和力的差异AdsorptionchromatographyExclusionchromatographyGel-permeationchromatographyPartitionchromatographyIon-exchangechromatography亲和色谱特异反应，亲和力的差异Affinitychromatography200固定相——极性（亲水性）流动相——非极性（疏水性）正相色谱反相色谱固定相——非极性（疏水性）流动相——极性（亲水性）201正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：A>B>C正、反相色谱中极性和保留时间的关系2023.3.1、液-固吸附色谱

固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；

流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。

一般是正己烷、环己烷为基础溶剂，加入二氯甲烷、短链醇、THF调节洗脱强度，构成正相色谱体系203液固吸附色谱的分离机理基于溶质和溶剂分子对吸附剂表面吸附活性点的竞争。204分离极性化合物含有不同官能团的化合物或族分离

思考：出峰顺序？分离异构体化合物（分离选择性远远高于其它色谱法）（例：VE异构体）对同系物分离选择性差，只能快速分离低级同系物，不能分离高级同系物。液固吸附色谱适用对象205样品分子结构的影响Figure3-2HPLCchromatogramofbenzeneandsubstitutedbenzeneseparatedonceria-zirconiacolumn.Conditions:column:150×4.6mmi.d.;mobilephase:ethanol/cyclohexane(1/99,v/v);flow-rate1.0ml.min-1;detectionatUV254nm.Peaks:1.Benzene;2.benzonitrile;3.m-dinitrobenzene;4.3-phenylpropanol.206HPLC方法

色谱柱:Eurospher100-5Si,150x4mmID

流动相:Hexan/2-丁醇(1000:4v/v)

1.α-维生素E

2.β-维生素E

3.γ-维生素E

4.δ-维生素E

5.维生素D2

6.顺式-维生素A

结构非常相似的维生素异构体分离207液固吸附色谱存在的问题严格控制固定相和流动相含水量流动相的杂质要非常小（尤其是极性杂质)非线形等温吸附常引起峰的拖尾——进样量的控制2083.3.2、液-液分配色谱

固定相与流动相均为液体（互不相溶）；

基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；

固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；

化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。

209通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。化学键合固定相210化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；（3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（4）有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：

(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；211以C18键合相的反相高效液相色谱最常用的一种色谱分离模式(85%)212反相键合相色谱分离非极性化合物色谱柱:UltraSepESPAH,250x2mmID

检测器:荧光检测器

1.萘9.草屈

2.苊10.苯(b)荧蒽

3.芴11.苯(k)荧蒽

4.菲12.苯(a)芘

5.蒽13.二苯(a,h)蒽

6.荧蒽14.苯(g,h,i)二萘嵌苯

7.芘15.茚酚(1,2,3-cd)芘

8.苯(a)蒽

213反相键合相色谱分离极性化合物214时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。反相色谱出峰顺序215反相色谱流动相反相色谱用极性溶剂及其混合物作流动相。溶剂极性越低，洗脱能力越强；极性越高，洗脱能力越弱，水是反相色谱最弱的溶剂。反相色谱溶剂强度近似地与Snyder在氧化铝上按溶剂极性系列建立的强度顺序相反。216溶剂的极性217溶剂选择性甲醇和水性质相似（质子给予-接受体）将甲醇加入水中，只改变溶质的k´值，而洗脱顺序不变。乙腈、THF加入水中不仅改变k´值，溶质洗脱顺序也将发生变化，显著改变色谱分离选择性。218反相色谱的方法开发流动相比例流动相组成柱温的影响流动相pH值梯度淋洗219流动相比例：改变容量因子

K'样品：①对羟基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②对羟基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③对羟基苯甲酸丁酯(ButylParaben)220流动相组成：改变选择性∶a通过改变流动相改变选择性同样强度的不同溶剂221梯度洗脱9个烷基苯酮化合物的分离222温度的影响223用反相柱分离离子型化合物分离有机弱酸、弱碱溶质色谱峰拖尾。为什么？怎么办？离子抑制色谱法通过改变流动相的pH值，使样品成中性离子对色谱法加入“对离子”，使样品呈中性224离子抑制色谱（控制pH值的反相色谱）适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的pH值，使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内225常用缓冲液及其pH值226应用实例在乙腈/水及pH=7时，

多数保留时间很短，无

法完全分离。2271958年氨基酸分析仪（离子交换色谱的主要应用）1975年，离子色谱产生（解决检测上的问题）

3.3.3、离子交换色谱离子交换色谱此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。228无机离子分离229生物离子性化合物分离230原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应：离子交换色谱分离原理231对阳离子，滞留顺序为：

Fe3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Cu2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+

对阴离子，滞留顺序为：柠檬酸根,SO42-,C2O42-,I-,HSO4-,NO3-,CrO42-,Br-,SCN-,Cl-,HCOO-,CH3COO-,OH-,F-

232离子交换色谱固定相阴、阳离子交换剂，在有机高聚物或硅胶上接枝有机季胺或磺酸基团。Styrene-divinylbenzeneresinAnion

exchangerCation

exchanger233按离子交换剂类型分四种234离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定pH和离子强度)

。pH值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。离子强度I：对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。离子交换色谱流动相2353.3.4、离子色谱法(IonChromatography,简称IC)离子色谱(IC)是70年代发展的新方法。以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象,其分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。为解决此问题，1975年Small提出，在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。236抑制柱该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：

R+—OH+HCl(流动相)——R+—Cl-