生物医学工程中金属纳米簇的运用,医学工程论文

生物医学工程中金属纳米簇的运用,医学工程论文摘要：金属纳米簇作为一种新型的荧光纳米材料,展现出良好的生物相容性和优良的物化性质,近年来遭到各个领域的关注,尤其在生物医学领域得到了广泛的应用。该文在介绍多种金属纳米簇的合成方式方法和光学性质的基础上,综述了金属纳米簇在生物传感、生物成像和肿瘤治疗等领域的应用研究进展,并对其面临的挑战和应用前景进行了瞻望。本文关键词语：金属纳米簇;生物医学应用;生物传感;生物成像;肿瘤治疗;Abstract：Fluorescentmetalnanoclusters(MNCs),asnovelfluorescentmaterials,exhibitgoodbiocompatibilityandexcellentphysicochemicalproperties,whichhaveattractedmoreandmoreattentioninvariousfields,especiallyinthebiomedicalfield.Inthisreview,thesynthesismethodsandopticalpropertiesofvariousmetalnanoclustersaredescribed.Then,theapplicationsofmetalnanoclustersinthebiomedicalfieldarereviewedfromthreeaspectsofbiosensing,bioimagingandcancertherapy.Finally,thefuturechallengesandapplicationprospectsoftheMNCsinbiomedicalapplicationarediscussed.Keyword：metalnanoclusters;biomedicalapplication;biosensing;bioimaging;cancertherapy;荧光金属纳米簇(Metalnanoclusters)是一类由几个至数百个金属原子堆积而成的纳米材料,处于单个金属原子和较大的金属纳米颗粒之间的过渡状态[1]。金属纳米簇的尺寸接近费米波长(2nm),与较大的纳米颗粒相比,具有更为独特的物理化学性质,因此表现出优异的光学特性,如荧光发射可调、斯托克斯位移大、荧光稳定性高、量子产率较高等[2,3]]。荧光金属纳米簇的合成一般采用模板法,以生物分子(蛋白质、DNA、氨基酸和多肽等)作为合成的配体,金属离子在复原剂的作用下被复原成原子团簇。与传统的荧光染料和量子点相比,荧光金属纳米簇的毒性大大降低,生物相容性显着提高。因而,它们作为一种新型的纳米荧光探针,在生化分析、环境检测、医学成像和肿瘤治疗等领域得到了广泛应用[4,5,6,7,8]]。当前,有关金属纳米簇的综述已有不少报道[9,10,11,12,13],但大多侧重于金属纳米簇的生化应用研究进展,或仅围绕一种金属纳米簇展开阐述。本文将对各种金属纳米簇的合成与性质进行概述,进而对其在生物医学领域包括生物传感、生物成像及肿瘤治疗中的应用进行阐述,并对金属纳米簇在生物医学领域面临的挑战和发展机遇进行了讨论。1、荧光金属纳米簇的合成荧光金属纳米簇的合成根据途径可分为自下而上和自上而下两种方式方法,如此图1所示[14]。前者使金属离子(Mn+)在复原剂存在下被复原为零价金属(M),零价金属再在配体分子上成核生长为纳米簇。当前常用的配体分子有脱氧核酸(DNA)、多肽、蛋白质、巯基小分子或聚合物等。自上而下法是通过配体对大尺寸纳米粒子的刻蚀作用进而获得小尺寸的纳米簇,按复原方式方法不同又可分为化学复原法、光复原法、超声复原法、微波复原法和电化学复原法等。为获得性质优良的金属纳米簇,上述方式方法通常需考虑下面因素:(1)配体与金属原子间较强的互相作用力;(2)适宜的复原条件;(3)足够的老化时间。下面针对不同金属纳米簇的特点,分别对其常用的合成方式方法进行了介绍。图1金属纳米簇的不同制备方式方法[14]Fig.1Variousroutesforthesynthesisofmetalnanoclusters[14]1.1、荧光金纳米簇的合成荧光金纳米簇(AuNCs)是金属纳米簇中稳定性最好的纳米材料之一,相关研究开展最早。通常利用HAuCl4作为金属前驱体,由于Au原子与S原子之间存在较强的共价结合力,因而一般选择含巯基的生物分子作为配体,在适当的复原条件下一步合成具有荧光发射的AuNCs[15,16,17]]。该方式方法一方面利于簇的构成,获得光学性质优良的AuNCs;另一方面可降低材料的毒性,使AuNCs具有良好的生物学应用价值。Negishi等[18]]利用谷胱甘肽(GSH)作为配体,在NaBH4复原下合成了含不同Au原子个数的AuNCs,结果表示清楚其光学性质普遍具有配体浓度和金核原子个数依靠性;Xie等[19]利用牛血清蛋白(BSA)为配体和复原剂发展了一种绿色方式方法制备了量子产率为6%的AuNCs,它在一定激发光照射下发出红色荧光(图2)。采用类似的化学复原方式方法,以胃蛋白酶[20]、乳铁蛋白[21]、胰蛋白酶[22]、溶菌酶[23]和木瓜蛋白酶[24]等蛋白质为配体的AuNCs也相继被合成。另外,还可通过自上而下法即利用含巯基的配体对尺寸较大的金纳米颗粒(AuNPs)进行刻蚀作用合成AuNCs。刻蚀途径分为配体诱导的刻蚀和对金属核的直接刻蚀两种途径。前者是利用过量的配体对AuNPs外表的Au原子进行剥离,构成配体-Au+复合物,复合物之间再通过亲金作用(Au+-Au+)互相结合构成AuNCs[25]5];后者是利用过量配体对AuNPs的金核直接进行刻蚀,使其粒径逐步减少,构成具有荧光发射的AuNCs[26]6]。图2BSA-AuNCs的绿色合成方式方法[19]Fig.2GreensynthesisofBSA-AuNCs[19]除了上述以AuS的共价结合作用制备AuNCs外,树枝状的大分子内部空腔中丰富的外表官能团可以以络合Au3+构成复合物用于AuNCs的制备。利用聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)为配体,Bao等[27]]发展了两种制备AuNCs的方式方法:一种是在生理温度下缓慢合成具有绿色荧光发射的AuNCs;另一种是以抗坏血酸为复原剂,通过缓慢复原Au3+合成具有多种荧光发射的AuNCs。为缩短合成时间,Jao等[28]]发展了微波复原法用于PAMAM-AuNCs的快速合成,合成时间由4d缩短至0.5h;Liu等[29]]利用超声复原法制备了近红外发射的BSA-AuNCs;Zhang等[30]]利用光复原法制备了以巯基化的聚合物为配体的AuNCs。这3种物理复原方式方法均不需其他复原剂的介入,制备经过简易并提高了量子产率。研究表示清楚,Au还能与含氮碱基腺嘌呤和胞嘧啶互相作用而结合[31]],因而DNA也能作为配体合成AuNCs[32,33]]。1.2、荧光银纳米簇的合成与金纳米簇类似,Ag原子与S原子之间也存在较强的共价结合力。因而,含巯基的化合物亦可作为配体合成银纳米簇(AgNCs)。Adhikari等[34]以二氢硫辛酸(DPA)为配体,利用NaBH4复原Ag+,合成了具有近红外荧光发射的AgNCs,该AgNCs的斯托克斯位移大于200nm,具有应用于细胞成像的潜力。在这里基础上,Yuan等[35]]发展了以巯基化合物为配体的反向转移法,即在水相中经化学复原后,再将体系转移至乙醇中进行缓慢刻蚀,所合成的AgNCs具有更好的分散性,超高的稳定性和超小的尺寸。Zhu等[36]]用该方式方法合成了具有蓝色和红色双发射荧光的GSH-AgNCs,合成经过中GSH和Ag+的浓度比值发生改变,双发射峰的荧光强度也随之改变。PAMAM等聚合物由于带大量的官能团可以作为合成AgNCs的一类配体。Zheng等[37]在该方面做了创始性的研究,初次以羟基封端的PAMAM为配体合成了稳定的AgNCs。Yuan等[38]以超支化聚乙烯亚胺(hPEI)为配体,抗坏血酸为复原剂合成了蓝绿色荧光发射的hPEI-AgNCs,该纳米簇具有很好的pH值稳定性,可用于Cu2+的检测。2004年,Petty等[39]初次以单链DNA为模板,在NaBH4复原下合成了具有荧光性质的AgNCs,且证明了Ag+和胞嘧啶之间具有强烈结合力。此后,Ritchie等[40]]发现AgNCs的发射波长与DNA上Ag+的复原状态有关,完全复原与非完全复原的AgNCs表现出不同的发射波长,不同程度的非完全复原AgNCs的发射波长也不同。由于Ag+与4种碱基(A,T,C,G)的亲和力不同,可通过改变DNA的序列调节AgNCs的荧光性质。Richards等[41]]利用基因芯片技术优化出5条单链DNA序列,可用于合成不同荧光发射的AgNCs,其发射波长从可见区到近红外区。除此之外,双链DNA可以用于AgNCs的合成。Guo等[42]]发如今双链DNA上外加1个胞嘧啶小环,并以此为模板合成的AgNCs具有较强的模板依靠性。随后,Ma等[43]]发现双链DNA的错配碱基位点能够特异性生长银簇。Gwinn等[44]]发现AgNCs的光学性质还可通过DNA的二级构造调控,并初次以发卡DNA为模板,通过调节环部胞嘧啶的数目合成了4种AgNCs。1.3、荧光铜纳米簇的合成相比于贵金属纳米簇AuNCs与AgNCs,有关铜纳米簇(CuNCs)的报道相对较少,主要是由于CuNCs更易被氧化且制备经过中尺寸难以控制。硫醇类化合物中的巯基与Cu2+之间能构成CuS共价键,因而硫醇类化合物也能作为合成CuNCs的配体。Wei等[45]]利用2-巯基-5-丙烷基嘧啶为配体,在NaBH4复原下合成了具有双发射的CuNCs,在氧气的电复原反响中表现出很高的电催化活性。由于某些聚合物在水溶液中能与Cu2+螯合,Zhao等[46]6]以含有叔胺的羟基封端的PAMAM为配体,利用叔胺与Cu2+的络合作用,在NaBH4的复原下成功合成了CuNCs。多肽和蛋白质等生物大分子也能作为配体为Cu2+提供结合位点,Huang等[47]47]以多肽作为配体,在抗坏血酸的复原下制备了量子产率为7.3%的CuNCs,其荧光具有温度敏感性。Wang等[48]48]以BSA为配体,在水合肼的复原下制备了发射红色荧光的CuNCs,其荧光具有pH值响应性,可应用于细胞成像。DNA分子中富含各种官能基团,如杂环氮、氨基、磷酸基等,能与不同的金属离子结合,因此可用于各种金属纳米簇的合成。Rotaru等[49]初次以双链DNA为模板合成了具有荧光性质的CuNCs,发现通过控制双链DNA的长度能够调节CuNCs的尺寸和荧光(图3A)。随后,本课题组[50]系统地挑选了能够作为配体分子稳定合成CuNCs的单链DNA,研究结果表示清楚,在复原剂抗坏血酸钠的存在下,只要聚胸腺嘧啶寡核苷酸Poly(thymine)能够快速有效地稳定合成荧光CuNCs(图3B)。图3双链DNA(A)[49]和单链DNA(B)[50]介导合成荧光铜纳米簇(CuNCs)示意图Fig.3SchematicillustrationoffluorescentCuNCstemplatedbydouble-strandedDNA(A)[49]andsingle-strandedDNA(B)[50]1.4、其他金属纳米簇的合成除上述3种常见的金属纳米簇外,一些荧光金属纳米簇也被相继合成。例如,Kawasaki等[51]将H2PtCl6参加N,N-二甲酰胺(DMF)溶液中,在140℃下油浴8h,利用DMF的复原能力初次合成了铂纳米簇(PtNCs);Hyotanishi等[52]]以PdCl2为金属前驱体采用一样方式方法合成了钯纳米簇(PdNCs);Tanaka等[53]3]以巯基乙酸为配体合成了蓝光发射的Pt5NCs,其量子产率达18%;以树枝状大分子[54]54]、GSH[55]55]等为配体制备的PtNCs也相继被报道。除此之外,为得到性质更优良的金属纳米簇,通过掺杂或偶联的双金属或多金属纳米簇也被逐步发展。它们一般以单金属纳米簇的制备方式方法为基础,发展简单的一步法或二步法进行合成,如Su等[56]56]以DNA为配体,参加前驱体Cu(NO3)2和AgNO3,在NaBH4复原下一步合成了DNA-Cu/AgNCs,该纳米簇的量子产率高达47%;根据此方式方法随后又合成了DNA-Au/AgNCs[57]。以BSA-AuNCs的合成方式方法为基础,还合成了具有双发射的BSA-Ce/AuNCs[58]。Zhang等[59]利用微波复原法快速简便地制备了GSH-Au/AgNCs,其量子产率相对于GSH-AuNCs也明显提高。2、金属纳米簇的光学性质1961年,Kubo等[60]提出了着名的久保理论和纳米粒子所具有的独特的量子限域效应。进一步研究表示清楚,当金属粒子粒径不断减小时,能级间隔逐步增大,当减小至与电子的费米波长相当时,电子能级由连续能级分裂成分立能级(图4)[61]。因而,1~2nm的金属纳米簇并不具备外表等离子共振(SPR)吸收性质,但在一定波长的光作用下,金属纳米簇可实现能级之间的电子跃迁,进而表现出一定的光吸收和从可见到近红外光区域的荧光发射性质。金属纳米簇产生荧光的主要机理有两种:与固有的量子尺寸效应相关的金属内核;由金属核与外表配体间互相作用控制的纳米簇外表[62]。除此之外,构造、外表配体、氧化状态、温度、pH值、离子强度等因素也会影响金属纳米簇的光学性质,华而不实外表配体的给电子能力是决定金属纳米簇量子产率的重要因素,配体给电子的能力越强,金属纳米簇的荧光越强。所以通过增加配体的给电子能力、增加金属核所带正电荷和使用富含给电子的原子或基团的配体可在一定程度上提高金属纳米簇的量子产率。图4尺寸对金属材料的能级构造影响[61]Fig.4Effectofsizeonmetalmaterialsstructure[61]近年来,金属纳米簇的电化学发光(ECL)性质不断被开发和利用。金属纳米簇的ECL是电化学反响和化学反响的结合,通常具有荧光性质的金属纳米簇均有电化学发光特性,但两者发光的原理不同,电化学发光是自由基离子在外加电压的激发下产生于电极外表,继而构成激发态,当激发态向基态能级跃迁时伴随光子产生,因此在基于金属纳米簇的ECL体系中,往往表现出更强的信号。3、金属纳米簇在生物医学中的应用研究荧光金属纳米簇作为一种新型的荧光纳米材料,相较于传统的荧光染料和量子点,具有易制备、易修饰、尺寸超小、斯托克斯位移大、生物相容性良好,以及荧光光谱可调等优势,在生化分析、环境检测、医学成像和肿瘤治疗方面具有广泛的应用。3.1、金属纳米簇在生物传感中的应用金属离子广泛存在于生物体中,介入生物体内各种复杂的生化经过,以维持生命体系的一切正常活动,但很多金属离子(如Cu2+、Fe3+等)超过一定浓度时均具有毒性作用。基于金属纳米簇较高的物化活性,当前已构建了多种简便的传感平台用于金属离子的高灵敏检测[63,64]。华而不实Cu2+的检测大多是基于Cu2+对荧光猝灭的原理,如Yuan等[65]利用hPEI合成了高稳定的AgNCs,Cu2+通过结合hPEI的氨基构成铜氨络合物,与AgNCs发生能量转移导致荧光猝灭,将该材料包埋于水凝胶中,进而发展了一种Cu2+的可视化检测方式方法,检出限达10nmol/L。但荧光猝灭型传感器易受外界环境的干扰,产生假阳性信号,Lan等[66]针对这一缺陷发展了基于DNA-AgNCs的荧光加强型Cu2+传感器,Cu2+参加DNA-AgNCs后构成了构造严密、荧光更强的DNA-Cu/AgNCs,该方式方法具有很好的选择性,检出限为8nmol/L。为提高Cu2+检测的灵敏度,Yan等[67]合成了组氨酸(His)稳定的AuNCs,并初次利用其过氧化物酶活性实现了Cu2+的比色检测,His-AuNCs在H2O2的存在下可催化四甲基联苯胺(TMB)发生显色反响,Cu2+参加后与His的氨基、羧基及咪唑环结合会抑制该AuNCs的酶活性,该方式方法的线性范围为1~100nmol/L,检出限可达0.1nmol/L。近年来,利用金属纳米簇还实现了血清和活细胞中Fe3+的分析检测,Feng等[68]利用hPEI为配体合成了Fe3+响应的CuNCs,并实现了在血清等复杂样品中对Fe3+的灵敏检测;Huang等[69]发现以硫辛酸为配体合成的Au/AgNCs对Fe3+具有较好的响应,基于团圆导致荧光猝灭原理构建了Fe3+荧光传感方式方法并成功应用于活细胞成像。除此之外,金属纳米簇也被应用于其他离子如Ag+、As3+、Cd2+、Cr3+、Cr6+、Hg2+和Pb2+[3,11,70,71]等的检测。生物分子作为生物体特有的物质,其含量水平与生命活动息息相关。华而不实生物巯基分子(GSH)、半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)是很多多肽和蛋白质的重要组成部分,在细胞的氧化复原平衡、癌症的发生发展中发挥着重要作用,且三者之间严密联络。Huang等[72]构建了基于DNA-AgNCs的荧光加强型传感器用于生物巯基化合物的检测,由于DNA-AgNCs具有很强的DNA序列及DNA构造依靠性,通过优化合成AgNCs的DNA序列,得到了具有GSH、Cys和Hcy响应的荧光探针。Xu等[73]以巯基十一酸和甲硫氨酸为配体一步法合成了橘黄色发射的AuNCs,利用AuNCs和GSH竞争性结合Cu2+诱导荧光变化而实现了GSH的检测,检出限为9.7nmol/L,并成功应用于活细胞内GSH的监测。Zhang等[74]利用聚胸腺嘧啶寡核苷酸(Poly(thymine))为模板合成的CuNCs构建了一种免标的纳米传感器,结合Thymine-Hg2+-Thymine的作用机制,实现了对GSH、Cys和Hcy的快速检测。三磷酸腺苷(ATP)作为生物体新陈代谢的能量物质,其能量和消耗速率与很多疾病的发生有关,Zhang等[75]]初次发现相邻的DNA-AgNCs与G四聚体/氯化血红素(Hemin)复合物之间存在的光致电子转移现象(PET)可用于ATP的特异性检测,设计了含ATP的核酸适配体(Aptamer)、富G序列及AgNCs模板序列的DNA序列。当ATP和Hemin存在时,Aptamer构象发生改变,G四聚体/Hemin随之构成,并与DNA-AgNCs产生PET效应导致荧光猝灭,ATP的检出限为8nmol/L。除了荧光猝灭型传感器,Xu等[76]]和Zhou等[77]]发展了基于DNA-AgNCs和DNA-CuNCs的荧光加强型探针用于ATP的检测。除此之外,荧光金属纳米簇还被广泛应用于生物大分子核酸和蛋白质的检测,核酸的定量检测有利于对生理状态进行实时监测,并对临床诊断起到很好的指导作用。Liu等[78]]构建了DNA-AgNCs/氧化石墨烯(GO)体系,利用GO能够吸附单链DNA并猝灭荧光的原理,通过设计DNA序列实现了多种目的物的检测,包括乙型病毒(HBV)等病原DNA以及ATP、凝血酶等生物分子。Miao等[79]]建立了一种基于DNA-AgNCs和金纳米颗粒荧光猝灭作用的miRNA检测方式方法,通过对DNA-AgNCs的DNA进行功能化,即设计华而不实一端用于合成AgNCs,另一端与miRNA互补用于捕获靶标和吸附带正电的AuNPs以猝灭AgNCs的荧光,在双联特异性核酸酶(DSN酶)的作用下,DNA/RNA杂交链中的DNA链被水解,AgNCs远离AuNPs外表,荧光得到恢复,该方式方法的miRNA检出限为33.4fmol/L。当前,以不同的金属纳米簇为敏感探针构建的化学传感平台也被应用于可卡因[80]]、H2O2[81]]、活性氧(ROS)[82]]等的检测。pH值和温度是生物体内最基本的生理参数,它们调控着大多数细胞内生物分子的活性,对于衡量生命活动正常与否至关重要,监测细胞内的pH值和温度对分析细胞行为和疾病诊断及治疗有重要意义[83,84]。Chen等[58]利用一步法合成的双发射BSA-Ce/AuNCs作为pH值敏感探针,构建了一种比率型pH传感器,在pH6.0~9.0范围内,该探针的荧光信号比率I410/I650与pH值存在良好的线性关系,且具有良好的稳定性和生物相容性,已成功应用于HeLa细胞内的pH值监测。近年来发现CuNCs可以作为pH值指示材料,Zhang等[85]]利用丝蛋白为配体合成了具有蓝光发射的CuNCs,在一定范围内,其荧光信号与pH值变化成正比。Wu等[86]]将pH值敏感的异硫氰酸荧光素(FITC)染料交联到BSA-AuNCs外表,发展了一种可用于pH值和温度传感的荧光探针,并实现了对活细胞内pH值和温度的监测。Zhou等[87]]报道了一种双荧光DNA-AgNCs探针用于温度传感,该探针由两条含AgNCs单链DNA通过碱基互补配对杂交组成,传感机制是基于温度的升高导致两条DNA逐步解链,进而使银簇对分开,荧光随之发生变化。除了利用金属纳米簇的荧光强度作为信号对温度进行传感外,Shang等[88]]还利用AuNCs的荧光寿命作为信号实现了活细胞内的温度传感。3.2、金属纳米簇在生物成像中的应用除了在生物传感中的应用,很多金属纳米簇也被应用于生物成像领域,尤其是以蛋白质、多肽等生物内源性分子为配体合成的金属纳米簇,它们往往具有生物相容性好、易功能化修饰的特点,在生物成像应用中表现出独特的优越性。Wang等[89]以GSH-AgNCs前体为配体,利用电化学复原法合成了具有红光发射的AuNCs,量子产率为10%,该AuNCs在癌细胞和正常细胞的成像中均表现出良好的稳定性和生物相容性。由于癌细胞中GSH的浓度远高于正常细胞的浓度[90],Chen等[91]将此特性应用于PtNCs在癌细胞内的原位合成并实现了细胞成像(图5A)。除此之外,金属纳米簇通过外表功能化后用于靶向肿瘤细胞的成像研究也相继报道,叶酸[92]、TAT肽段[93]、RGD肽段[94]、Aptamer[95]等生物分子的靶向功能化修饰在生物成像中发挥着越来越重要的作用。为避免细胞成像时的自发荧光和背景荧光的干扰,很多研究者基于材料的特性引入了双光子成像技术并得到了更深层次的细胞成像效果。Shang等[96]发展了新型的DPA-AuNCs,利用双光子成像技术实现了对HeLa细胞横截面的3D成像。随后,功能化的BSA-AuNCs[97,98]利用双光子成像技术在肿瘤细胞中也得到了应用。除此之外,荧光寿命成像技术也能弱化成像时生物组织自发荧光和背景荧光的缺点,Shang等[88]以硫辛酸-AuNCs作为荧光探针,利用其荧光寿命的温度敏感性,发展了一种活细胞中温度响应的荧光寿命成像方式方法(FLIM),在生理温度范围内,AuNCs的荧光寿命变化范围为970~670ns(图5B)。利用AgNCs对细胞进行荧光寿命成像的研究也早有报道[99]。除了上述利用金属纳米簇荧光性质进行单一形式的细胞成像,多形式的成像技术在细胞及活体层面也得到了发展和应用。Wang等[100]采用声波复原法合成了GSH-CuNCs,利用该CuNCs近红外荧光发射和顺磁性质的特性,将近红外荧光(NIRF)/核磁共振(MRI)双形式成像技术成功应用于HeLa细胞内。当前,基于镧系元素离子Gd3+的造影剂广泛应用于肿瘤的成像,Hou等[101]]发展了由Gd3+介导AuNCs自组装构成的纳米颗粒(GNCNs)用于癌症多形式成像的方式方法,Gd3+的参加使复合纳米颗粒的荧光大大加强,利用该材料实现了在A549细胞和活体内的NIRF/CT/MRI多形式成像。3.3、金属纳米簇在肿瘤治疗中的应用基因治疗在肿瘤治疗中表现出良好的应用前景,其面临的挑战之一是需引入安全、靶向、高效的载体系统。金属纳米簇作为一种新型的荧光纳米材料,具有生物相容性好、稳定性高、易于合成与修饰等(基因治疗载体系统所必需的)众多优点,可在一定程度上提高该治疗形式的应用价值。Tao等[102]合成了聚乙烯亚胺(PEI)-AuNCs,利用PEI的质子海绵效应,将PEI-AuNCs作为一种安全有效的基因载体实现了HepG2中pDNA的高效转运与转染。高分子量的PEI具有高效的转染效率,而AuNCs在很大程度上降低了高分子量PEI的毒性,因而PEI-AuNCs在基因治疗中表现出很好的应用前景。基于类似原理,Wang等[103]]发现PEI-CuNCs可以作为载体且表现出基因转运的潜力。Vankayala等[104]]利用细胞核定位肽(TAT)对AuNCs进行靶向功能化,AuNCs的荧光和核染料在细胞中实现了共定位,结果表示清楚TAT-AuNCs在HeLa细胞和斑马鱼中的转染效率达81%,是常用脂质体载体的3.2倍。Dutta等[105]]将自杀基因整合到pDNA内,然后通过静电作用吸附到BSA-AuAgNCs上,根据AuAgNCs的荧光信号可对基因转运进行成像,Caspase3活性检测表示清楚该基因治疗体系对肿瘤细胞起到了较好的凋亡作用。Lei等[106]]发现GSH-AuNCs结合神经生长因子NGF的siRNA(GNC-siRNA)可使NGF基因沉默并提高胰腺癌治疗效率,GNC-siRNA复合物增加了siRNA在血清中的稳定性,延长了siRNA在血液中的循环寿命,加强了siRNA的细胞摄取和肿瘤积累。另外,将功能化的AgNCs作为载体转运siRNA也有报道[107]7]。随着生物纳米材料的发展及其向医学领域的不断浸透,荧光纳米材料和肿瘤化学治疗相结合逐步成为当下攻克肿瘤研究的重要手段,华而不实金属纳米簇所具有的光学性质和生物相容性使其在该领域中表现出良好的应用前景。Khandelia等[98]构建了一种装载AuNCs和阿霉素(Dox)的纳米诊疗复合粒子,该复合粒子既可对癌细胞进行双光子成像,又可对癌细胞到达化学治疗的作用。Chen等[108]对Au进行癌细胞内外的双靶向修饰和药物交联,发展了基于AuNCs-Dox-cRGD-Aptamer的诊疗一体化纳米平台,提高了药物对肿瘤组织的亲和力与浸透率,实现了肿瘤部位的成像及药物的靶向递送。Zhou等[109]制备了BSA-AuNCs连接顺铂和叶酸的纳米药物复合物,结果表示清楚基于AuNCs的纳米平台在肿瘤的成像和治疗方面具备良好的发展前景。另外,CuNCs也具有此方面的潜力,如此图6所示,Goswami等[110]直接以具有癌细胞靶向性的转铁蛋白(Tf)作为配体合成了Tf-CuNCs,并利用静电互相作用力装载Dox制备了Tf-CuNCs-DoxNPs,Dox与CuNCs之间存在荧光共振能力转移(FRET)效应,当该靶向型纳米颗粒进入癌细胞后,CuNCs的荧光随着Dox的释放而恢复,利用FRET策略对肿瘤组织到达了诊疗一体化的目的。肿瘤的物理治疗主要是利用光对癌变组织进行放疗及光动力学治疗。首先,X射线能够离子化DNA分子,或与H2O作用生成活性氧物质,华而不实OH可诱导细胞DNA发生损伤到达治疗肿瘤的目的[111];另一方面,高原子序数的金属元素在X射线诱导下发生生化反响,反响产物与癌细胞内水分子反响生成自由基,可使DNA发生电子转移而被氧化,因而某些金属纳米簇有放疗增敏的作用[112]。Zhang等[113]在利用AuNCs作为放疗增敏剂提高肿瘤放疗效果的研究中做了先导性的工作,研究结果表示清楚超小尺寸的AuNCs能够避免网状内皮系统的吞噬,有效提高肿瘤的放疗疗效。基于此,Liang等[114]采用c(RGDyC)肽为配体,结合其癌细胞靶向功能制备了具有肿瘤靶向及放疗增敏作用的AuNCs。基于金属纳米簇外表官能团与光敏剂交联可应用于肿瘤的光动力学治疗(PDT),Nair等[115]将原卟啉(PPIX)与叶酸修饰的硫辛酸-AuNCs共价交联,利用该材料实现了活体中肿瘤部位的光动力学治疗的实时成像。PPIX还可与近红外发射的Aptamer(AS1411)-AgNCs通过G四聚体相连,基于此方式方法,Ai等[116]]构建了基于DNA-AgNCs的诊疗一体化平台。研究表示清楚,在肿瘤细胞内会产生抗氧化防御机制以应对持久的PDT治疗,例如过度表示出硫环蛋白复原酶(TrxR)能够抵抗细胞内增加的ROS水平[117]],Gao等[118]]发现AuNCs能有效抑制肿瘤细胞内TrxR,将AuNCs和光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)同时负载到pH敏感性脂质体中,在细胞内溶酶体酸性环境下,AuNCs和Ce6被快速释放到胞浆,金簇有效抑制了胞浆内的TrxR,使得细胞内产生的ROS不能被及时去除,提高了Ce6介导的光动力学诱发的细胞内ROS水平,改善了PDT的治疗效应。而且,某些金属纳米簇可直接作为光敏剂用于光动力学治疗。Kawasaki等[119]]研究发现以苯乙硫醇或卡托普利为配体合成的AuNCs具有光敏剂特性,在可见/近红外光激发下能够有效地产生单线态氧,并基于以上独特的性质,使用卡托普利-AuNCs作为生物相容性光敏剂实现了对癌细胞的光动力学治疗。Vankayala等[104]]利用TAT肽段对AuNCs进行靶向功能化,以TAT-AuNCs作光敏剂实现了HeLa细胞的光动力学治疗。图5PtNCs在癌细胞内的原位生物合成及荧光成像(A)[91],以及硫辛酸-AuNCs作为荧光探针在不同温度下对HeLa细胞进行荧光寿命成像(B)[88]Fig.5InsitubiosynthesisofPtNCsandcellimaging(A)[91],andFLIMimagesofHeLacellswithinternalizedAuNCsatdifferenttemperatures(B)[88]图6与Tf-CuNCs-DoxNPs孵育不同时间后HeLa细胞的荧光共焦显微镜图像(A),及Tf-CuNCs-DoxNPs对小鼠的肿瘤抑制能力监测(B)[110]Fig.6FluorescenceconfocalmicroscopyimagesofHeLacellsatdifferenttimeoftreatment(A),andexperimentalschemerepresentingtheeffectofTf-CuNCs-DoxNPsintumorbearingSwissalbinomicemonitoredfor50days(B)[110]4、结论与瞻望本文系统地介绍了不同金属纳米簇的合成方式方法和荧光性质,并从生物传感、生物成像和肿瘤治疗三方面总结了近年来它们在生物医学领域的研究进展。荧光金属纳米簇作为一种新型的荧光纳米材料,不仅拥有良好的荧光性质,还有更好的生物相容性。除此之外,配体合成的荧光金属纳米簇通常还有易于修饰的特点,进而可对其荧光性质、靶向辨别等进行调整和优化。这些优良特性,使金属纳米簇在生物医学领域展现出更多的应用潜能。尽管金属纳米簇在生物医学领域已获得一定成果,但进一步的发展还面临着严峻的挑战。首要解决的问题是怎样制备纯度和量子产率更高层次的金属纳米簇。与量子点和有机染料相比,当前所合成的金属纳米簇量子产率偏低,实现金属纳米簇中金属核组分与尺寸可控合成、增加外表配体的给电子能力等是解决该问题的突破口。其次,由于金属纳米簇本身具有较高的物化活性,而在生物成像或治疗应用时往往需要更为准确且稳定的荧光信号,因而怎样在细胞或活体等复杂生物环境中提升该荧光材料的抗干扰能力是非常重要的。最后,金属纳米簇的外表功能化对于其在生物医学领域的应用研究特别关键,一方面,金属纳米簇作为传感器、荧光染料、基因载体或药物载体等角色,高效率的外表功能化修饰有利于其更好的发挥作用;另一方面,功能化修饰会使金属纳米簇外表的化学基团发生变化,进而导致材料本身的荧光性质发生变化。很多研究表示清楚,以荧光金属纳米簇为基础构建的生物标记、生物传感、生物成像以及靶向的肿瘤治疗平台具有特别广阔的前景,但将其应用于临床实践尚需结合其他功能性材料进行更多深切进入、系统的研究。通过将金属纳米簇的优良性质与其他造影剂或治疗药物相结合,有望实现多功能金属纳米复合材料的合成及多模态成像与治疗的应用,为临床实践提供坚实的理论基础和技术支持。总之,随着理论基础、合成技术以及各方面技术的综合发展,荧光金属纳米簇将为生物医学领域的研究提供新的契机,为细胞内传感、成像以及治疗开拓新的途径。以下为参考文献：[1]JinR.Nanoscale,2018,2(3):343-362.[2]LiJJ,ZhuJJ,XuK.Trend.Anal.Chem.,2020,58:90-98.[3]ZhangLB,WangEK.NanoToday,2020,9(1):132-157.[4]CuiML,ZhaoY,SongQJ.Trend.Anal.Chem.,2020,57:73-82.[5]LiuJW.Trend.Anal.Chem.,2020,58:99-111.[6]GuoYM,CaoFP,LeiXL,MangLH,ChengSJ,SongJT.Nanoscale,2021,8(9):4852-4863.[7]GeJ,DongZZ,BaiDM,ZhangL,HuYL,JiDY,LiZH.NewJ.Chem.,2021,41(18):9718-9723.[8]CaiQ,GeJ,XuHH,ZhangL,HuYL,HuangZM,LiZH.Anal.Methods,2021,9(18):2710-2714.[9]ShangL,DongS,NienhausGU.NanoToday,2018,6(4):401-418.[10]HuX,LiuTT,ZhuangYX,WangW,LiYY,FanWH,HuangYM.Trend.Anal.Chem.,2021,77:66-75.[11]GuoYM,CaoFP,LeiXL,MangLH,ChengSJ,SongJT.Nanoscale,2021,8(9):4852-4863.[12]ZhengYK,LaiLM,LiuWW,JiangH,WangXM.Adv.ColloidInterface,2021,242:1-16.[13]XuJ,ShangL.Chin.Chem.Lett.,2021./10.1016/j.cclet.2021.12.020[14]MathewA,PradeepT.Part.Part.Syst.Charact.,2020,31(10):1017-1053.[15]MuXY,QiL,DongP,QiaoJ,HouJ,NieZX,MaHM.Biosens.Bioelectron.,2020,49:249-255.[16]SunJ,ZhangJ,JinYD.J.Mater.Chem.C,2020,1(1):138-143.[17]MuXY,QiL,QiaoJ,MaHM.Anal.Methods,2020,6(16):6445-6451.[18]NegishiY,NobusadaK,TsukudaT.J.Am.Chem.Soc.,2005,127(14):5261-5270.[19]XieJP,ZhengYG,YingJY.J.Am.Chem.Soc.,2018,131(3):888-889.[20]KawasakiH,HamaguchiK,OsakaI,ArakawaR.Adv.Funct.Mater.,2018,21(18):3508-3515.[21]ChaudhariK,XavierPL,PradeepT.ACSNano,2018,5(11):8816-8827.[22]LiuJM,ChenJT,YanXP.Anal.Chem.,2020,85(6):3238-3245.[23]LuD,LiuL,LiF,ShuangS,LiY,ChoiMM,DongC.Spectrochim.ActaA,2020,121:77-80.[24]WangLC,ChenGQ,ZengGM,LiangJ,DongHR,YanM,LiZW,GuoZ,TaoW,PengL.NewJ.Chem.,2021,39(12):9306-9312.[25]GuoWW,YuanJP,WangEK.Chem.Commun.,2020,48(25):3076-3078.[26]ChenY,LiWY,WangY,YangXD,ChenJ,JiangYN,YuC,LinQ.J.Mater.Chem.C,2020,2(20):4080-4085.[27]BaoYP,ZhongC,VuDM,TemirovJP,DyerBD,MartinezJS.J.Phys.Chem.C,2007,111(33):12194-12198.[28]JaoYC,ChenMK,LinSY.Chem.Commun.,2018,46(15):2626-2628.[29]LiuHY,ZhangX,WuXW,JiangLP,BurdaC,ZhuJJ.Chem.Commun.,2018,47(14):4237-4239.[30]ZhangH,HuangX,LiL,ZhangGW,HussainI,LiZ,TanB.Chem.Commun.,2018,48(4):567-569.[31]OnoA,TorigoeH,TanakaY,OkamotoI.Chem.Soc.Rev.,2018,40(12):5855-5866.[32]LiuGY,ShaoY,MaK,CuiQH,WuF,XuSJ.GoldBulletin,2020,45(2):69-74.[33]QingTP,HeXX,HeDG,QingZH,WangKM,LeiYL,LiuT,TangP,LiY.Talanta,2021,161:170-176.[34]AdhikariB,BanerjeeA.Chem.Mater.,2018,22(15):4364-4371.[35]YuanX,LuoZT,ZhangQD,ZhangXH,ZhengYG,LeeYJ,XieJP.ACSNano,2018,5(11):8800-8808.[36]ZhuJJ,SongXC,GaoL,LiZM,LiuZ,DingS,ZouSB,HeY.Biosens.Bioelectron.,2020,53(53C):71-75.[37]ZhengJ,DicksonRM.J.Am.Chem.Soc.,2002,124(47):13982-13983.[38]YuanZQ,CaiN,DuY,HeY,YeungES.Anal.Chem.,2020,86(1):419-426.[39]PettyJT,ZhengJ,HudNV,DicksonRM.J.Am.Chem.Soc.,2004,126(16):5207-5212.[40]RitchieCM,JohnsenKR,KiserJR,AntokuY,DicksonRM,PettyJT.J.Phys.Chem.C,2007,111(1):175-181.[41]RichardsCI,ChoiS,HisangJC,AntokoY,VoschT,BongiornoA,TzengYL,DicksonRM.J.Am.Chem.Soc.,2008,130(15):5038-5039.[42]GuoWW,YuanJP,DongQZ,WangEK.J.Am.Chem.Soc.,2018,132(3):932-934.[43]MaK,CuiQH,LiuGY,WuF,XuSJ,ShaoY.Nanotechnology,2018,22(30):305502.[44]GwinnEG,ONeillP,GuerreroAJ,BouwmneesterD,FygensonDK.Adv.Mater.,2008,20(2):279-283.[45]WeiWT,LuYZ,ChenW,ChenS.J.Am.Chem.Soc.,2018,133(7):2060-2063.[46]ZhaoMQ,SunL,CrooksRM.J.Am.Chem.Soc.,2021,120(19):4877-4878.[47]HuangH,LiH,WangAJ,ZhongSX,FangKM,FengJJ.Analyst,2020,139(24):6536-6541.[48]WangC,WangC,XuL,ChengH,LinQ,ZhangC.Nanoscale,2020,6(3):1775-1781.[49]RotaruA,DuttaS,JentzschE,GothelfK,MokhirA.Angew.Chem.Int.Ed.,2018,49(33):5065-5067.[50]QingZH,HeXX,HeDG,WangKM,XuFZ,QingTP,YangX.Angew.Chem.Int.Ed.,2020,52(37):9719-9722.[51]KawasakiH,YamamotoH,FujimoriH,ArakawaR,InadaM,IwasakiY.Chem.Commun.,2018,46(21):3759-3761.[52]HyotanishiM,IsomuraY,YamamotoH,KawasakiH,OboraY.Chem.Commun.,2018,42(38):5750-5752.[53]TanakaSI,MiyazakiJ,TiwariDK,JinT,InouyeY.Angew.Chem.Int.Ed.,2018,50(2):431-435.[54]TanakaSI,AokiK,MuratsuguA,IshitobiH,JinT,InouyeY.Opt.Mater.Express,2020,3(2):157-165.[55]ChenDH,GaoSP,GeW,LiQW,JiangH,WangXM.RscAdv.,2020,4(76):40141-40145.[56]SuYT,LanGY,ChenWY,ChangHT.Anal.Chem.,2018,82(20):8566-8572.[57]ChenWY,LanGY,ChangHT.Anal.Chem.,2018,83(24):9450-9455.[58]ChenYN,ChenPC,WangCW,LinYS,OuCM,HoLC,ChangHT.Chem.Commun.,2020,50(62):8571-8574.[59]ZhangJ,YuanY,WangY,SunFF,LiangGL,JiangZ,YuSH.NanoRes.,2021,8(7):2329-2339.[60]NishidaI,KimotoK.ThinSolidFilms,1974,23(2):179-189.[61]DezI,RasRHA.Nanoscale,2018,3(5):1963-1970.[62]YauSH,VarnavskiO,GilbertsonJD,ChandlerB,RamakrishnaG,GoodsonIIIT.J.Phys.Chem.C,2018,114(38):15979-15985.[63]HalawaMI,WuFX,NsabimanaA,LouB,XuGB.Sens.ActuatorsB,2021,257:980-987.[64]BoonmeeC,PromarakV,TuntulaniT,NgeontaeW.Talanta,2021,178:796-804.[65]YuanZQ,CaiN,DuY,HeY,YeungES.Anal.Chem.,2020,86(1):419-426.[66]LanGY,HuangCC,ChangHT.Chem.Commun.,2018,46(8):1257-1259.[67]YanL,DingD,ZhenYL,GuoR.Biosens.Bioelectron.,2021,92:140-146.[68]FengJ,JuYY,LiuJJ,ZhangHG,ChenZG.Anal.Chim.Acta,2021,854:153-160.[69]HuangH,LiH,FengJJ,WangAJ.Sens.ActuatorsB,2021,223:550-556.[70]YueY,LiuTY,LiHW,LiuZ,WuY.Nanoscale,2020,4(7):2251-2254.[71]ZhangYY,HuiJ,WangXM.Anal.Chim.Acta,2021,870:1-7.[72]HuangZZ,PuF,LinYH,RenJS,QuXG.Chem.Commun.,2018,47(12):3487-3489.[73]XuSH,GaoT,FengXY,MaoYN,LiuPP,YuXJ,LuoXL.J.Mate.Chem.B,2021,4(7):1270-1275.[74]ZhangL,CaiQY,LiJ,GeJ,WangJY,DongZZ,LiZH.Biosens.Bioelectron.,2021,69:77-82.[75]ZhangLB,ZhuJB,GuoSJ,LiT,LiJ,WangEK.J.Am.Chem.Soc.,2020,135(7):2403-2406.[76]XuJN,WeiCY.Biosens.Bioelectron.,2021,87:422-427.[77]ZhouSS,ZhangL,CaiQY,DongZZ,GengX,GeJ,LiZH.Anal.Bioanal.Chem.,2021,408(24):6711-6717.[78]LiuXQ,WangFA,AizenR,YehezkeliO,WillnerI.J.Am.Chem.Soc.,2020,135(32):11832-11839.[79]MiaoXM,ChengZY,MaHY,LiZB,XueN,WangP.Anal.Chem.,2021,90(2):1098-1103.[80]ZhangK,WangK,ZhuX,ZhangJ,LanX,HuangB,XieMH.Chem.Commun.,2020,50(2):180-182.[81]JiaXF,YangX,LiJ,LiDY,WangEK.Chem.Commun.,2020,50(2):237-239.[82]XieYZY,XianyuYL,WangNX,YanZY,LiuY,ZhuK,HatzakisNS,JiangXY.Adv.Funct.Mater.,2021,28(14):1702026.[83]LowellBB,SpiegelmanBM.Nature,2000,404(6778):652-660.[84]DuJZ,DuXJ,MaoCQ,WangJ.J.Am.Chem.Soc.,2018,133(44):17560-17563.[85]ZhangGM,XuT,DuH,DuHZ,QiaoYY,GuoXH,ShiLH,ZhangY,ShuangSM,DongaC,MaHM.J.Mate.Chem.C,2021,4(16):3540-3545.[86]WuYT,ShanmugamC,TsengWB,HisehMM,TsengWL.Nanoscale,2021,8(21):11210-11216.[87]ZhouWJ,ZhuJB,TengY,DuBJ,HanX,DongSJ.NanoRes.,2021,11(4):2020-2023.[88]ShangL,StockmarF,AzadfarN,NienhausGU.Angew.Chem.Int.Ed.,2020,52(42):11154-11157.[89]WangCX,WangY,XuL,ShiXD,LiXW,XuXW,SunHC,YangB,LinQ.Small,2020,9(3):413-420.[90]WuG,FangYZ,YangS,LuptonJR,TurnerND.J.Nutr.,2004,134(3):489-492.[91]ChenDH,ZhaoCQ,YeJ,LiQW,LiuXL,SuMN,JiangH,AmatoreC,SelkeM,WangXM.ACSAppl.Mater.Int.,2021,7(32):18163-18169.[92]WangY,DaiC,YanXP.Chem.Commun.,2020,50(92):14341-14344.[93]WangYL,CuiYY,ZhaoYL,LiuR,SunZP,LiW,GaoXY.Chem.Commun.,2020,48(6):871-873.[94]ZhangWS,LinDM,WangHX,NienhausGU,SuZQ,GangW,ShangL.BioconjugateChem.,2021,28(9):2224-2229.[95]LiJJ,DaiY,WangS,HanCP,XuK.Sens.ActuatorsB,2021,232:1-8.[96]ShangL,D?rlichRM,BrandholtS,SchneiderR,TrouilletV,BrunsM,Ger