精液的质量控制陆金春

按照WHO5规范化评估男性生育力:

精液分析的质量控制

陆金春武警江苏总队南京医院

1主要内容QC的概念精液分析QC的重要性质量控制的过程精子浓度、活力及形态学分析的质量控制精浆生化检测的质量控制抗精子抗体检测的质量控制质量控制的实施措施2

质量控制（QC）

即质量管理。实验室为了达到质量的要求，自行或由权威部门建立观察分析步骤的变异性，随时评估检测结果准确性的一系列相关制度。

目的：寻找和发现检测分析过程中的误差和产生误差的原因，保持检测结果准确性的稳定。

是达到质量保证（QA）的一种手段3QC的分类内部质量控制（IQC）：实验室内部所进行的QC。监测精确性，并通过控制限外的结果提示分析可能有缺陷。实施IQC的一种方式是将IQC材料与实验室常规工作一起检测，以使用质控图表监测这些材料的结果。外部质量控制（EQC）：不同的实验室就同一样本进行检测并对所得结果进行评估。EQC允许一个实验室的结果与其他实验室比较。其允许不同方法被评估，并以一定规格比较，其不可能仅在单一实验室进行。4QC的重要性

保证不同时间同一实验室检验结果的一致性；保证不同实验室检验结果的可比性5

质量控制过程

分析前质量控制：精液样本的留取、接受、编号、保存等分析中质量控制：精液分析过程中的质控措施，如质控品、SOP、95%可信区间等分析后质量控制：报告的正确发出至临床医生做出诊断61.禁欲时间因素待做精液常规检查者的禁欲天数规定为2-7天。

2.精液收集的完整性因素推荐采用广口容器为采精器皿，保证精液没有丢失。3.精液体积测量的准确性因素采用5版推荐的天平称重法计算精液体积（推荐使用自动去皮的精密度达0.01g的天平），这是获得一次射精的精子总数的关键步骤。分析前质量控制74.杂质的干扰因素使用第5版推荐的相差显微镜，相差显微镜这种高级光学系统能使精液中的大部分杂质与精子区分，使精子头部发光，杂质显示为灰色，这样可以过滤大部分的杂质。5.计数板间隙的准确性因素

计数板间隙对浓度检测数据的准确性的影响巨大，常使误差达50%以上。计数板的深度按照5版要求每6~12个月必须校准一次。分析前质量控制8我们使用FilmetricsF20间隙测量仪分别对Makler（单池，19块）、Macro（单池，32块）、Geoffrey（双池，34块）、Glodcyto（四池，20块）、Leja（八池，20块）和Cell-VU（双池，20块）等6种精子计数池的深度进行精确测量，计算出每个计数池的平均深度、极差和变异系数（CV）以及每种计数池的平均深度、偏差及合格率。

实验一9不论是10μm深的计数池（Makler、Macro、Geoffrey）还是20μm深的计数池(Glodcyto、Leja、Cell-VU)，没有一种精子计数池的深度是100%的合格。Makler、Macro和Geoffrey计数池的深度分别为（12.72±1.08）、（10.19±0.48）和（10.00±0.28）μm，Glodcyto、Leja和Cell-VU计数池的深度分别为（23.76±2.15）、（20.49±0.22）、（24.22±2.58）μm。Geoffrey计数池的合格率最高，为94.12%，其次为Macro（65.63%）和Leja（35%）计数池，其余三种计数池的合格率均为0。10我们们利利用用Filmetrics间间隙隙测测量量仪仪精精确确测测量量5种种不不同同深深度度的的Geoffrey精精子子计计数数池池，，然然后后按按照照WHO5手手册册的的要要求求利利用用CASA分分析析高高[标标称称值值为为50××106/ml]、、低低浓浓度度[标标称称值值为为30××106/ml]的的质质控控珠珠的的浓浓度度，，以以及及31例例精精液液标标本本的的精精子子浓浓度度。。并并分分析析不不同同精精子子计计数数池池深深度度所所得得结结果果的的相相关关性性、、相相对对偏偏差差以以及及校校正正系系数数。。实验验二二115种种精精子子计计数数池池的的深深度度分分别别为为8.1、、9.1、、10.2、、11.1、、11.9μμm。。不不同同深深度度的的精精子子计计数数池池计计数数的的低低、、高高浓浓度度质质控控珠珠浓浓度度结结果果均均有有显显著著差差异异（（P<0.01）），，但但低低、、高高浓浓度度质控控珠珠浓浓度度与与计计数数池池深深度度均均呈呈显显著著正正相相关关（r均为为0.997，，P均<0.01））。。以以10.2μμm的的计计数数板板为为基基准准（（100%）），，5种种计计数数板板深深度度的的相应应校校正正系系数数分别别为为：：1.26（（10.2/8.1））、、1.12（（10.2/9.1））、、1.00（（10.2/10.2））、、0.92（（10.2/11.1））和和0.86（（10.2/11.9）），，校校正正后后的的各各计计数数池池相相对对偏偏差差均均低低于于5%。。31例例精精液液标标本本用用不不同同深深度度的的精精子子计计数数池池进进行行检检测测，，精精子子浓浓度度结结果果类类似似于于质质控控珠珠悬悬液液。。12在精精子子浓浓度度分分析析中中，，精精子子计计数数池池的的深深度度非非常常关关键键，，使使用用不不合合格格的的计计数数板板，，将将导导致致检检测测结结果果产产生生误误差差，，这种种误误差差和和计计数数板板深深度度误误差差成成正正比比。因因此此，，精精子子计计数数板板深深度度应应该该进进行行定定期期校校验验，，并并应应以以相相应应的的校正正系系数数对检检测测结结果果进进行行纠纠正正。。13我们们利利用用Filmetrics间间隙隙测测量量仪仪精精确确测测量量4种种不不同同深深度度的的Geoffrey精精子子计计数数池池，，然然后后按按照照WHO5手手册册的的要要求求利利用用CASA系系统统分分析析36例例精精液液标标本本的的前前向向运运动动精精子子百百分分率率（（PR））、、非非前前向向运运动动精精子子百百分分率率（（NP））和和总总活活动动率率（（PR+NP）），，并并进进行行比比较较分分析析。。实验验三三144种种精精子子计计数数池池的的深深度度分分别别为为9.8、12.7、、15.7和和19.9μm，，测测得得的的PR分分别别为为（（44.00±±11.63））%、、（（41.96±±12.62））%、、（（40.86±±11.71））%和和（（37.78±±11.38））%，，NP分分别别为为（（13.54±±3.01））%、、（（14.13±±2.94））%、、（（14.91±±3.02））%和和（（16.53±±2.77））%，，总总活活动动率率分分别别为为（（57.53±±11.06））%、、（（56.08±±11.97））%、、（（55.78±±11.55））%和和（（54.31±±12.11））%。。精精子子计计数数板板深度与PR呈呈显著负相关关（r=-0.993，P<0.05）），与NP呈显著著正相关（r=0.989，P<0.05）），与活动率率呈显著负相相关（r=-0.978，P<0.05））。尽管精子子总活动率在在4种不同深深度的计数池池之间没有显显著差异，但但PR和NP在在9.8μμm深的计数数池和19.9μm深深的计数池之之间均有显著著性差异（P<0.05））。15精子计数池的的深度对精子子活力的影响响不容忽视，，不同深度计计数池获得的的结果差异将将会给临床医医生对患者做做出正确的诊诊断（如弱精精子症）和采采取合适的治治疗措施带来来一定的负面面影响。不同深度的精精子计数池应应有相应的精精子活力正常常参考值范围围。166.检测时间和和液化程度的的影响检查精子活力力，必须在精精液完全液化化后进行，最最好在60分钟以内内进行检测，以以防止脱水、、pH值或温温度的变化对对精子活力的的有害影响。。对射出60分分钟后仍没有有完全液化的的精液，必须须采取措施促促使其液化，，常用的方法法是用注射器器连接18号号钝性针头反反复缓慢抽吸吸，或加入等等体积的培养养液用加样器器反复吹打，，也可以使用用菠萝蛋白酶酶消化。分析前质量控控制17分析前质量控控制7.充分混匀后后取样为确保获得可可重复的数据据，在取样用用于检测前，，应充分混匀匀标本。当重重复取样的结结果一致时才才能认可此测测定值。混匀精液时不不要太剧烈震震荡而产生气气泡。不要在在漩涡震荡器器上高速混匀匀，这样会损损伤精子。建议使用盘式式混匀器或三三维混匀器。。18精子浓度分析析的质量控制制19分析精子数为了获得可接接受的较低的的吸样误差，，每次至少分析200条精子评价相同的计计数池两次，，或评价从单单一稀释液充充两次的池都都不是真正的的重复，由于于其不能反映映吸样、混合合和稀释的误误差20通过评估更多多精子可以减减小取样误差差，但需权衡衡增加精确度度与时间花费费及因检测人人员疲劳导致致准确性下降降之间的利弊弊。当至少计数400个精子子时，抽样误误差相对较小小，约5%。。精子计数与取取样误差21稀释两份标本本，分别计数数，可接受差差异见下表22表示存在计数数错误或者取取样误差，或或者精液未充充分混匀，以以及在计数池池上精子未随随机分布。此此时需要放弃弃第一次的两两个值并重复复评估（不要要计数第三个个样本，取3个值的平均均值，或者取取3个值中最最相近的两个个值的平均值值）。对一些不常见的的精液标本，如非均质的的精液标本，，甚至取第三三批重复样本本仍不能获得得可接受差异异值。在这种种情况下，计计算所有重复复样本的平均均值，并记录录在报告中。。当计数结果大大于可接受差差异23不同类型标本本的处理方法法高浓度精液标标本运用CASA分析时，精精子浓度高于于50×106/ml的标本本，由于精子子之间的相互互碰撞，会影影响CASA的分析质量量，为了保证证CASA对对于浓度分析析的准确性，，可对标本进进行稀释。一般仪器对于于50×106/ml—100×106/ml浓度度的标标本能能够进进行分分析，，但准准确性性不高高，要要发表表论文文或者者质控控要求求高的的实验验室最最好对对高于于50×106/ml的标标本进进行稀稀释。。浓度超超过100×106/ml的标标本必必须进进行稀稀释24精子活活力分分析的的质量量控制制25CASA较较人工工分析析的优优势用CASA（计算算机辅辅助精精液分分析））分析析精子子活力力，较较人工工方法法具有有两大大优势势：高精确确性和提供精精子动动力学学参数数的量量化数数据（前向向运动动和超超活化化运动动，即即获能能精子子特征征参数数）。。CASA分析视频记记录的功能能更容容易实实现标标准化化和更更好地地实施施质量量保证证程序序。26WHO第5版对对评估估精子子活力力的温度条件非非常重重视，，要求求每个个实验验室都都必须须标准准化。。虽然然室温温和37℃℃都可可取，，但我我国幅幅员辽辽阔，，各地地气温温相差差很大大，室室内保保温条条件各各不相相同，，唯有有统一一37℃的的恒温温标准准才能能使检检测结结果可可以比比较。。WHO第5版提提出：：在37℃℃评估估精子子活力力，保保温板板（计数板板）应预预热10分分钟。。最好好在带带有恒温载载物台台的显微微镜下下进行行检查查。同同时标本也必须须在相相同的的温度度下孵孵育。。27分析时时要注注意的的细节节1.加样后后应静静置5~15秒再检检查，，避免免液体体流动动（漂漂移））影响响判断断。但但最好好在10分分钟内内检查查完毕毕，防防止温温度变变化和和脱水水等因因素对对精子子活力力的影影响。。2.为防止止干燥燥影响响观察察精子子活力力的效效果，，应在在距离离盖玻玻片（（实际际可检检查范范围））边缘缘至少5mm的区区域观察精精子。。3.为了避避免重重复观观察相相同的的区域域，最最好根根据精精子浓浓度利利用网网格事事先随机选选择视视野。在视视野中中界定定的区区域内内要评评估所所有精精子的的活力力。28活力质质控必必须解解决的的问题题1.检检测全全程要要采取取有效效的保保温措措施，，使检检测标标本保保持在在37℃。。2.必必须使使用高高帧速速率CCD实时时记录录精子子运动动的连连续轨轨迹。。3.规规定计计数板板的间间隙标标准，，统一一精子子的运运动条条件。。4.利利用视视频录录像（（包括括刻录录软件件和光光盘））进行行可重重复的的人工工评估估。5.高高浓度度样本本要稀稀释。。29精子形形态学学分析析的质质量控控制30精子形形态学学分析析操作作的标标准化化精子形形态学学分析析过程程中的的所有有操作作步骤骤都可可能影影响精精子形形态学学分析析的结结果，，如精精液样样本的的洗涤涤、制制片、、固定定、染染色方方法、、显微微镜质质量、、自动动化分分析系系统的的质量量等。31正常形态精精子判断标标准的一致致性精子头外形形上应该是是光滑、轮轮廓规则，，大体上呈椭圆形形，顶体区区可清晰分分辨，占头头部的40%~70%，没有大空空泡，并且且不超过2个小空泡泡，空泡大大小不超过过头部的20%，顶顶体后区不不含任何空空泡中段应该细细长、规则则，大约与与头部长度度相等，中中段主轴应应与头部长长轴成一条条直线，残残留胞浆不不超过精子子头大小的的1/3；；主段应该比比中段细，，均一，长长约45um，可以自身卷卷曲成环状状，尾部没有有显示鞭毛毛折断的锐锐利折角。。32α葡糖苷酶酶、ACP、Zn、、果糖等严格的标准准操作程序序（SOP）标准液的吸吸光度相对对恒定或定定标室内质控品品（每次与与样本同时时检测）精浆生化检检测的质量量控制33抗精子抗体体检测的质质量控制严格的SOP（加样样、稀释、、洗涤、孵孵育时间等等）每次带有阴阴、阳性对对照准备两种试试剂，阳性性样本复核核阳性判断标标准34QC的实施施措施35QC样本来源购买——比比较贵、缺缺乏，有靶靶值实验室制备备——费用用低，靶值值未知精子浓度QC样本：：乳胶珠、保保存时间、、聚集精子形态学学QC样本本：固定或染色色玻片精子活动率率QC样本本：录像带、DVD视频频、网格胶胶片精浆生化和和AsAb的QC样样本：中、低值精精浆，阳性性精浆36QC图——Xbar图图37QC图的基基本控制规规则一个结果在在控制线之之外随机误差3个点中的的2个在警警告线之外外系统误差5个点中的的4个在警警告线之外外系统误差两个连续的的结果均在在上或下控控制线之外外系统误差两个连续的的结果一个个在上控制制线外，一一个在下控控制线外随机误差8个连续的的结果均在在均值上或或下系统误差38失控的原因因样本不恰当当的混匀（（常见于粘