血片制作染色和血检质量控制二

一、血片制作血膜的制作用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。发热病人血片标本片1血膜的制作（取血时间）取血时机现症病人一般可随时取血，疟疾普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环状体期；发作后数小时，环状体发育到滋养体期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断的有利时机；36~48小时，可检出裂殖体；发作一、二次后，配子体出现较多。恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。2血膜的制作（取血操作）取血方法采血部位一般人为耳垂，指头，通常在耳垂取血（现场取血用采血针采血，一人一针，避免血传疾病）先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒针迅速刺入耳垂下端1~2毫米，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向上挤压出血。3取血量及涂片法（涂片操作）薄血膜取洁净的载玻片2张，1张平置在桌上，以左手拇指，食指夹持载玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另一张边缘平滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片，用推片一端边缘的中点从取血部分取约1微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25~30度夹角，待血液向两侧扩展约2厘米长度时，均匀而迅速地轻轻向左推出（约2.5厘米长）。4（涂片操作）厚血膜用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外或由外向里一个方向旋转，转2~4圈，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。5血膜的制作（涂片操作）涂制厚、薄血膜的位置通常是将厚、薄血膜涂在一张载片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个；门诊和发热病人血片涂2个厚血膜1个薄血膜，以防血膜脱落而影响检查；疟疾调查时，每张玻片可涂制2~3人血膜。6血膜的制作血膜编号血膜制成后，立即用特种蜡笔或水笔于玻片面上写上受检者的号码，以防差错，待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。7制作血膜的注意事项

1.玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。8制作血膜的注意事项2.刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不一溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。9制作血膜的注意事项3.血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能24~48小时内固定染色；冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，膜血膜宜先用甲醇固定（1~3分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。10二、血片片的染色色

（一一）染液液的种类类及染色色原理染液种类类：目前所用用的血片片染色液液，虽然然名称很很多，但但都是从从罗门诺诺夫斯基基氏创造造的染液液变化过过来的。。总的可可分为水水溶液和和酒精溶溶液两大大类，前前者包括括罗氏、、西氏（（Simon)、J.S.B氏染液等等，后者者包括利利氏(Leishman)、瑞氏和吉吉氏染液液等。这这些染液液中的主主要染剂剂都包含含美兰、、伊红和和由美兰兰氧化所所成的天天青，所所以称多多色性染染剂。11血片的染染色（（一）染染液的种种类及染染色原理理染色原理理：伊红是酸性水溶性钠钠盐，美美兰是碱性水溶性盐盐酸盐，，当它们们各自溶溶化水中中时，就就离解为为带阳电电和阴电电的离子子。伊红红主要离离解为酸酸性的12血片的染染色（（一）染染液的种种类及染染色原理理染色原理理：美兰与与伊红都都不能使使原虫和和白细胞胞的核着着色，必必须由天天青作为为媒介（（染媒））才能使使其着色色。天青青虽然也也是碱性性染剂，，但又具具有染媒媒作用，，使原虫虫核和白白细胞核核等原来来只能染染上极淡淡兰色的的结构染染上显著著的酸性性染剂伊伊红，这这样，就就使白细细胞粗大大的核染染成显著著的既兰兰又红的的紫兰色色，而较较小或菲菲薄的原原虫核和和淋巴细细胞原浆浆中的颗颗粒染成成紫红色色。13血片的染染色（（一）染染液的种种类及染染色原理理注意：蛋白质质是二性电解质，，当其处处于较等电点为酸的溶溶液中时时，便呈呈硷的作作用，即即与酸结结合*，这就说说明为何何在染液液偏酸时时，伊红红的着色色力强，，使红细细胞着色色鲜艳而而淋巴细细胞和原原虫的胞胞浆着色色不著；；反之，，蛋白质质在偏硷硷的溶液液中呈酸酸的作用用而中和和硷基，，也就说说明为何何染液偏偏硷时，，红细胞胞和嗜伊伊红白细细胞的颗颗粒等被被染成紫紫兰色。。伊红在水水溶液内内遇到美美兰或天天青，时时间一长长即可互互相化合合而产生生沈淀从从而失去去染色力力，因此此，吉氏母液液绝对不不能进水水。14血片的染染色（（二）吉吉氏染液液母液配配置方法法取吉氏粉粉0.5克置于研研钵中，，加少量量甘油充充分研磨磨，再加加再磨，，至25毫升加完完为止，，倒入60或100毫升带有有玻塞的的有色玻玻瓶中。。在研钵钵中加少少量甲醇醇，洗去去甘油浓浓液混入入瓶内，，至25毫升甲醇醇洗净钵钵中甘油油染液为为止，塞塞紧瓶塞塞，充分分摇匀，，置于55~60℃水浴中或或温箱内内24小时或室室温内3~5天，多加摇摇动，即成成原液。吉吉氏染液是是目前较优优良的血膜膜染剂，即即使在炎热热天气中，，亦可经久久不变。材料：1、吉氏粉粉0.5克克2、甘油25毫升3、甲醇25毫升15血片的染色色

（三））吉氏染液液血片染色色方法先用甲醇或或无水酒精精固定薄血血膜，待干干后进行染染色。亦可可在固定薄薄血膜后用用清水对厚厚血膜溶脱脱血红蛋白白，然后才才进行染色色。成批血片染染色：将已固定定薄血膜的的血片插入入染色缸，，倒入2%吉氏染液稀稀释液（2毫升原液加加中性蒸馏馏水98毫升稀释均均匀即成）），同时对对厚薄血膜膜染色30分钟（如染染液不合标标准时，得得酌情增减减染色时间间），然后后用清水轻轻轻将染液液冲去，再再用清水轻轻轻冲洗一一次，干净净后将血片片标本（血血膜面朝下下）插于晾晾干板上，，待干镜检检。16血片的染色色

（三））吉氏染液液血片染色色方法先用甲醇或或无水酒精精固定薄血血膜，待干干后进行染染色。亦可可在固定薄薄血膜后用用清水对厚厚血膜溶脱脱血红蛋白白，然后才才进行染色色。单张血片染染色：薄血膜经经固定干燥燥后，用2%吉氏染液稀稀释液1~2毫升，滴入入血片标本本上染色30分钟左右，，或用中性性蒸馏水1毫升，加吉吉氏母液1~2滴，混合均均匀后滴入入血片标本本上，染色色10~20分钟，然后后用清水轻轻轻将片上上的染液冲冲洗干净，，晾干镜检检。17影响染色效效果的因素素血片染色好好坏除了与与玻片是否否清洁，血血片制作质质量好坏等等有关外，，还受到以以下几个因因素的影响响：（1）染料溶剂剂的质量染染料、、甲醇和甘甘油如果不不纯，常使使配制的染染液偏酸或或偏碱而影影响染色效效果。因此此必须用分分析纯的甲甲醇和中性性甘油，而而且在配制制时所用的的器具必须须干净而无无水份。18影响染色效效果的因素素（2）染液的新新旧新新配制的染染液因色素素尚未充分分溶解，染染色力较弱弱且常呈现现偏碱性。。染液存放放时间越久久，染色力力越强。通通常在染液液配制1~2周后才使用用，盛装染染液的瓶子子应加塞盖盖密。以防防吸潮而影影响染液质质量。19影响染色效效果的因素素（3）染液稀释释后使用时时间吉吉氏和瑞氏氏染液的主主要成份是是美蓝、伊伊红和由美美蓝氧化产产生的天青青，三者能能在酒精溶溶液中溶解解，但在水水溶液中伊伊红遇到美美蓝和天青青即产生沉沉淀。因此此，必须在在稀释染液液当时使用用，一般在半小小时内染色力最强强。20影响染色效效果的因素素（4）染液的稀稀释浓度染染液的的浓度高其其着色就快快而深，从从而疟原虫虫寄生红细细胞的薛氏氏点粗大显显著，但颜颜色常偏碱碱；染液浓浓度过低则则染色时间间久，颜色色偏酸，薛薛氏点不明明显或消失失。21影响染色效效果的因素素（5）染色时间间染色色时间长染染色效果好好，反之较较差。室温温高则着色色快，染色色时间可略略缩短，气气温低可适适当延长。。因此染色色时间应根根据染液的的质量、新新旧、稀释释浓度和气气温而适当当增减。22影响染色效效果的因素素（6）染色用水水染液液的稀释用用水和染色色后冲洗用用水应选择择Ph7.0~7.2清洁水，通通常使用的的新鲜的蒸蒸馏水或过过滤的冷开开水，以及及自来水、、井水、河河水、泉水水和雨水等等。如果偏偏酸或偏碱碱，可用缓缓冲蒸馏水水调整。染染色后发现现血膜颜色色偏蓝（偏偏碱）或偏偏红（偏酸酸）时，可可用与之相相反的酸、、碱度水冲冲洗血片予予以纠正。。23影响染色效效果的因素素（7）染色后不不要直接将将染液倒掉掉，应沿玻玻片或染色色缸边缘加加水使染液液表面一层层溢出，并并轻轻冲洗洗，以免染染液色素颗颗粒沾污血血膜。24三、发热病病人血检的的质量控制制19世纪后后期，显微微镜的出现现使人们不不断发现了了传染病的的病因，1880年年法国军医医拉韦朗（（Laveran）第一次见到到并描述了了人红细胞胞内的疟原原虫，至此此才解开了了困扰人们们数千年的的疟疾的病病因之谜。。25三、发热病病人血检的的质量控制制此后，随着着显微镜的的不断改进进和血膜上上疟原虫染染色方法的的出现，使使显微镜检检查疟原虫虫的方法成成为疟疾病病原学诊断断的重要手手段。尽管管这种方法法存在着操操作复杂、、技术难于于掌握等缺缺点，但以以其高特异异性一直被被作为确诊诊病例主要要依据。时时止今日，，由于技术术的、经济济的等原因因，镜检疟疟原虫仍是是我国疟疾疾病例确诊诊的金标。。26三、发热病病人血检的的质量控制制在疟疾诊断断标准中把把疟疾病例例分为疑似似病例、临临床病例、、确诊病例例和带虫者者，前两者者依据流行行病学史和和临床表现现即可做出出诊断，而而后两者需需通过发现现病原方能能做出诊断断。另外，，除带虫者者外，病例例的最基本本临床表现现为发热。。1、目的的与意义27三、发热病病人血检的的质量控制制因此血检的的目的在于于通过对发发热病人血血检达到确确诊疟疾病病例。它的意义在在于及时发发现传染源源和明确感感染的疟原原虫种类，，以能针对对虫种选择择正确的治治疗方案。。1、目的的与意义28三、发热病病人血检的的质量控制制在疟疾严重重流行时期期，卫生部部有关文件件中提出，，疟区的各各级医疗卫卫生单位，，都要把发发热病人血血检疟原虫虫列为常规规。2、血检检对象29三、发热病病人血检的的质量控制制2、血检检对象但根据20世纪80年代各地地的观察结结果表表明明，全部血血检阳性的的病例中，，有47.8%（江江苏）、73.5%（山东））、77.7%（南南方7省））、84.1%（河河南）是在在临床初诊诊为疟疾、、疑似疟疾疾的发热病病中查出的的，而其它它15%~42%的的病例，是是在临床初初诊为发热热原因不明明和感冒及及其它发热热病人中查查出的。30三、发热病病人血检的的质量控制制2、血检检对象因此，为尽尽可能多地地发现病人人，各地把把临床初诊诊为疟疾、、疑似疟疾疾、发热原原因不明和和感冒及其其它发热的的“四热””病人列为为血检对象象。31三、发热病病人血检的的质量控制制2、血检检对象但是，随着着疟疾流行行程度的降降低，“四四热”病人人中查出的的疟疾病例例所占的比比例也发生生了变化。。上世纪90年代初初，在全国国10省省、区发病病率稳定在在1/万以以下地区开开展研究，，发现92.33%的病病例发生在在临床诊断断为疟疾、、疑似疟疾疾（包括来来自高疟区区流动人口口）中（见见表）。32三、发热病病人血检的的质量控制制2、血检检对象临床初诊血检人数阳性人数阳性率%占总阳性人数%疟疾1093167064.4964.24疑似疟疾247332932.3528.09发热原因不明10602760.027.29其它9608440.0040.38表各类类发热病人人血检原虫虫阳性率33三、发热病病人血检的的质量控制制2、血检检对象表中显示，，在诊断为为发热原因因不明的病病人中，原原虫阳性率率仅为0.02%，，也就是说说检出1例例病人要镜镜检5000张以上上血片；而而在“其它它”发热病病人中检查查2.4万万病人方检检出1例病病人。34三、发热病病人血检的的质量控制制2、血检检对象因此提出发发病率在1/万地区区，由于92%以上上的病例在在诊断为疟疟疾、疑似似疟疾（包包括来自高高疟区流动动人口）““二热”病病人中发现现，因此以以“二热””病人为血血检对象即即可。至于于在发热原原因不明中中查出的7%病例，，可在其出出现疑似疟疟疾的症状状时再做血血检，这就就极大的减减少了工作作量。35三、、发发热热病病人人血血检检的的质质量量控控制制2、、血血检检对对象象提供供以以上上资资料料，，仅仅供供在在确确定定血血象象时时参参考考，，各各地地可可根根据据当当地地的的疟疟疾疾流流行行程程度度、、血血检检的的具具体体目目的的来来确确定定血血检检对对象象。。36三、、发发热热病病人人血血检检的的质质量量控控制制3、、血血检检率率发热热病病人人血血检检率率是是指指血血检检的的人人数数占占血血检检范范围围人人口口的的比比率率。。血血检检率率的的高高低低应应以以疟疟疾疾的的流流行行程程度度来来定定。。20世世纪纪50年年代代WHO提出出，，在在实实施施抗抗疟疟计计划划的的攻攻击击期期，，年年血血检检率率在在10%以以上上。。我我国国基基本本消消灭灭疟疟疾疾标标准准中中提提出出年年血血检检率率5%以以上上。。37三、、发发热热病病人人血血检检的的质质量量控控制制3、、血血检检率率在目目前前，，年年检检率率应应多多高高？？各各地地应应根根据据当当地地疟疟疾疾的的流流行行水水平平，，在在以以临临床床初初诊诊为为疟疟疾疾和和疑疑似似疟疟疾疾为为重重点点的的基基础础上上，，来来确确定定血血检检对对象象。。38三、、发发热热病病人人血血检检的的质质量量控控制制3、、血血检检率率根据据上上世世纪纪90年年代代初初，，在在全全国国10省省、、区区发发病病率率稳稳定定在在1/万万以以下下地地