2017年最新 Illumina 16S rRNA文库制备流程_第1页
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文档简介

Illumina16S宏基因组学文库制备流程DNA制备、质检V3、V4区扩增扩增产物纯化、质检PCR导入测序接头文库纯化、质检上机前文库定量、pooling文库变性、稀释上机一、DNA制备、质检：提取试剂：OMEGA试剂盒：Soil，Water，Stool等。具体看样品。购买裂解液，组合AMPureXPbeads提取。DNA质量：浓度≥5ng/μl；260/280=1.8；260/230=1.8；如果纯度低，用Qubit测值。琼脂糖凝胶电泳没有严重降解；将DNA稀释到5ng/μl；二、V3.V4区扩增：序列：另附文献；Forward：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG--CCTACGGGNGGCWGCAG-3'Reverse：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG--GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'试剂：2xKAPAHiFiHotStartReadyMix；Code：KK2601；操作流程：三、扩增产物纯化、质检：20μl（0.8×）BECKMANAMPureXPbeads纯化PCR产物；磁珠回溶52μl，吸取50μl。测试阶段根据浓度大小：琼脂糖电泳或者Agilent2100确定扩增是否准确。四、PCR导入测序接头：序列：Nexteraindexkit-PCRPrimerN701:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-TCGCCTTA-GTCTCGTGGGCTCGG-3’N501:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TAGATCGC-TCGTCGGCAGCGTC-3’试剂：2xKAPAHiFiHotStartReadyMix；Code：KK2601；操作流程五、文库纯化、质检56μl（1×）BECKMANAMPureXPbeads纯化PCR产物；回溶27μl，吸取25μl；QubitHSdsDNAKit测定文库浓度；根据文库浓度：琼脂糖电泳或者Agilent2100确定扩增是否准确。六、上机前文库定量、pooling根据公式：；计算文

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