甜草化学成分的研究

甜草化学成分的研究刘文基李厚金*(中山大学化学与化工学院，广州，510275)摘要甜草是我国南方的一种民间草药。本文对采集于江西赣南的甜草化学成分进行了系统研究。用95%的乙醇浸泡提取，用柱层析，薄层层析，以及重结晶的方法分离提纯甜草中的化学成分。低极性成分的组成和含量通过GCMS分析确定，中等极性组分主要运用柱色谱法进行了分离、纯化,得到4个纯化合物，脂肪酸，谷甾醇和2个三萜类化合物，化合物结构通过紫外光谱法，红外光谱法，质谱法，核磁共振等实验综合解析确定。同时对得到的三萜化合物进行了药理测试。关键词：甜草，化学成分，三萜AbstractOldenlandiacantonensisHowisoneoffolkmedicineinsouthofchina.TheOldenlandiacantonensisHowwasextractedwith95%alcohol.Thecrudeextractswassubjectedtoseparationandpurificationbythinlayerchromatography(TLC)andcolumnchromatography(CC).TheconstitutionandcontentoflowpolaritycomponentareanalyzedbyGCMS.Thecomponentsofmiddlepolarityareseparatedandpurifiedbycolumnchromatography(CC).TheirstructureswereelucidatedbyUV,IR,NMR,MS.Asaresult,fourcompoundswereobtained,fattyacid,plantsterolalcoholandtwoTriterpenoidcompounds.AlsowemakesomemedicinetestingtoTriterpenoidcompounds.Keywords:OldenlandiacantonensisHow,Chemicalconstitute,Triterpenoid甜草是茜草科植物，在《江西草药》有药用记载，其性平，味甘，有治疗黄疸型肝炎、糖尿病、外伤出血、清热解毒的功效，其叶子榨汁，可用于蜜蜂、黄蜂等蜂类的蛰伤。目前尚未见到关于甜草OldenlandiacantonensisHow化学成分的研究报告，本实验对甜草化学成分的分离，提纯，鉴定，低极性成分用GCMS分析确定，中等极性成分中分离到4个纯化合物，脂肪酸，谷甾醇和2个新的三萜类化合物。通过对三萜化合物药理测试，2个三萜化合物活性显著,对人肝癌细胞株Bel-7402的IC50值分别为6.5mg/ml，7.0mg/ml，对人胃腺癌细胞株Mcg-803的IC50值分别为8.0mg/ml，7.0mg/ml，化合物具有明显的制备抗肿瘤药物的前景。1实验部分1.1仪器与试剂仪器：HP6890/5973GC/MS联用仪，红外光谱仪（KBr压片），300MHz、500MHz核磁共振仪。试剂：95%乙醇，甲醇，乙酸乙酯，石油醚，氯仿，H-硅胶，1.2采集与提取原料甜草，2004年7月份采集于江西省地区的向阳山坡，取地上全草，晒干剪碎，用95%乙醇多次浸泡，合并浸泡液，旋转蒸发浓缩至干，浓缩物再用甲醇溶解，溶解液拌硅胶。1.3分离提纯将硅胶拌样吹干至呈粉末状态，进行柱层析初步分离。先用石油醚湿法装柱，然后用PE和EA配比溶液梯度冲洗柱子。对初次柱层析得到的溶液,低极性成分用GC-MS分析，中等极性成分进行柱层析分离操作。用重结晶方法对化合物进一步提纯，最后从中等极性成分中分离得到四个化合物成分（A，B，C，D）。2结果讨论2.1低极性成分的GC-MS分析液体油状物用氯仿溶解，进行GC-MS分析。色谱条件：HP25MS30m×0.25mm×0.25μm弹性石英毛细管柱。程序升温：初始柱温50℃，5℃/min升至250℃，运行时间50min。进样口温度230℃，He气为载气，流速0.5mL/min，分流比20∶1，进样量1μL。质谱条件：离子源为EI源，离子源温度230℃，质量范围40～500amu。表1甜草OldenlandiacantonensisHow的低极性成分及相对含量序号化合物含量(%)序号化合物含量(%)13,3,6-三甲基-2,5-庚二酮0.10313,7-二甲基-7-羟基-二甲缩醛0.7326,10,14-三甲基-2-十五烷酮1.25321-二十八烷醇0.9239-十八烯酸-1-甲基酯0.21332-二十七烷酮0.904Z-8-十六烯0.7534二十六烷酸甲基酯0.8051-十六酸乙基酯1.6435十四烷酸十四烷基酯0.9961,1-二甲氧基十二烷0.1736十一烷二甲缩醛0.8178,11-十八二烯酸甲基酯1.4337二十六烷0.6789(Z)-十八烯酸甲基酯2.14382-甲基丙基酸-十二烷基酯0.909十八烷酸甲基酯0.783928-Nor-17α-(H)-hopane0.54101-十七碳烯0.13401-烯-3-酮-10-二甲氧基甲基-17-乙酰氧基-雄甾烷0.48119,12-十八二烯酸乙基酯0.44413,5,22-三烯-豆甾烷0.5712油酸乙基酯0.51422-二十九烷酮1.2613十八烷酸乙基酯0.4243二十七酸甲基酯0.72145(Z)-十九碳烯0.2244VitaminE1.08153,7,11,15-四甲基-2-烯-1-十六醇0.3545十四酸十六烷基酯2.1616二十烷酸甲基酯0.4946十一烷基二甲缩醛0.9317正二十三烷0.774711-甲基-二十九烷0.79182,4-二-(1-甲基-1-苯基)乙基-苯酚0.7448桉叶油醇0.7619二十二烷酸甲基酯1.1549丁基酸环己醇酯1.5120二-n-辛基-邻苯二甲酸酯1.04501,1-二甲氧基-9-(Z)-十八烷烯1.51212-十二烷基菲0.4751软木三萜酮0.6622二十三烷酸甲基酯1.16523,5-二烯-3,17-二（三甲基硅氧基）-雄甾烷1.6323二十五碳烷1.2553十六烷基环氧丙烷0.89241-二十六碳烯1.32547-酮基-3-乙酰氧基-胆甾烷1.3425二十四烷酸甲基酯1.32551-氨基-4-甲基-哌嗪1.21263-甲酰氧基-11-羟基-17-酮基-雄甾烷0.40565,9(11)-二烯-3β-乙酰氧基-胆甾烷1.392711,13-二甲基-12-十四烯-1-醇-乙酸酯0.845722,23-二氢豆甾醇1.73281,1-二甲基-十四烷基-叔硫醇1.13583-酮基香树脂0.95291-(2-十二烷烯)-丁二酸酐0.39595-雄甾烷烯-3β,17β-二乙酰氧基1.7430二十二烷酸甲基酯0.71609-十八烯酸-二十烷醇酯2.072.2中等极性成分分析分离到的第一种化合物A：为浅白奶油色油状固体，微加热即融化,1H-NMR（CDCl3,TMS,ppm）：7.223，3.634，2.340，2.316，2.291，2.272，2.246，1.277，1.232，1.144，1.123，0.877，0.855，0.832，0.810。7.223为氘带氯仿的溶剂峰；3.634为连氧氢所显示的峰（可能是化合物中含有羟基）。2.340，2.316，2.291，2.272，2.246，前后之间ppm值的差分别为0.024，0.025，0.019，0.026，通过分析，可能是T，D峰的重叠，可确定此化合物中碳氢连着羰基。1.277，1.232，1.144，1.123，峰的高度较高，可确定这些峰是烷基长链所显示的峰，其中通过高度可确定有7个亚甲基相连。0.877，0.855，0.832，0.810，前后之间的ppm值平均相差为0.22，J=300*0.22=6.6，为四重峰，可确定化合物A中含甲基。A红外光谱，IR/cm－1（KBr）：3448，2920，2851，2366，2342，1740，1652，1545，1463，1438，1378，1172。其中3448为羟基伸缩振动峰，2920和2851为碳氢伸缩振动吸收峰，2366和2342为空气中二氧化碳吸收峰，1740为羰基吸收峰，1378-1463为甲基伸缩振动峰。确定此化合物为十二碳脂肪酸。图1化合物A的1H-NMR图化合物B，白色粉末固体,1H-NMR（CD3COCD3，TMS，ppm）：5.226，2.793，2.057，2.049，1.293，1.171，1.128，0.988，0.969，0.952，0.943，0.918，0.898，0.884，0.865，0.839，0.810，0.783。5.226为连双键氢的吸收峰；2.793，为单峰，可初步确定此峰型为水（羟基）的吸收峰；2.057，2.049，其为背景溶剂氘带丙酮的吸收峰；1.293，1.171，1.128为烷基长链的吸收峰；0.988-0.783号峰为甲基吸收峰。IR/cm－1（KBr）：3421，2927，1690，1651，1574，1456，1407，1273，1185。其中3421为羟基伸缩振动吸收峰，2927为碳氢伸缩振动吸收峰，1690和1651为双键伸缩振动吸收峰，1456和1407为甲基吸收峰。确定此化合物为谷甾醇。图2化合物B的1H-NMR图化合物C，白色固体，可结晶成透明针状晶体。1H-NMR（CD3COCD3，TMS，ppm）：7.981，5.222，5.208，5.197，2.794，2.250，2.213，2.045，1.957，1.943，1.933，1.922，1.902，1.891，1.168，1.125，0.982，0.964，0.949，0.937，0.914，0.894，0.870，0.835，0.777。7.981，为单峰，可初步确定此峰型为活泼氢的吸收峰，可能是羟基或羧基；5.222、5.208、5.197，确定为双键氢的吸收峰；2.794，确定为水的吸收峰；2.045，为丙酮溶剂的吸收峰；ppm值在1-2之间，可确定为亚甲基和次甲基烷基长链的吸收峰；ppm值为0.7-1之间，确定为多个甲基吸收峰。红外光谱分析，IR/cm－1（KBr）：3428，2927，2856，2337，1736，1689，1632，1574，1458，1404，1385，1274，1254，1170，1107，1042，997。其中3428为羟基的红外吸收峰；2927和2856为碳氢吸收峰；2337为空气中二氧化碳吸收峰；1736羰基吸收峰；1458，1404，1385为甲基吸收峰。化合物C其结构还在测定中。图3化合物C的1H-NMR图化合物D，白色固体，其核磁共振谱NMR数据如表2所示。表2化合物的NMR数据(DMSO-d6,TMS,500MHz)位置编号DEPT13CNMR1HNMR1CH238.21.542CH223.71.50,1.913CH76.83.004C38.3——5CH54.70.666CH226.91.467CH232.61.578C46.7——9CH46.91.4510C41.6——11CH222.71.8612CH124.55.1313C138.1——14C41.5——15CH227.51.8016CH217.91.46,1.3017CH232.61.25,1.4318CH52.32.1119CH315.90.6820CH328.10.9021CH315.10.8722CH316.90.7623CH323.21.0424CH38.30.9425C178.1——26CH230.01.4227CH38.40.9528CH316.80.8229CH320.90.923-OH——4.1525-COOH——11.8C29H48O3,FABMS：m/z445[M+1]+，表明相对分子量为444。元素分析结果C,78.33;H,10.90;N,0.000。红外光谱数据（KBr）：3420,2970,2928,2871,1693,1575,1455,1407,1313,1279,1249,1142,1091,1032,996,758,661,568。经过文献查阅，此化合物为新化合物。图4化合物D的13C-NMR图图5化合物D的1H-NMR图图6化合物D的结构示意图化合物C，D药理测试结果：表3对拓扑异构酶（hTOPI）的IC50测定结果产物编号结构产物来源IC50（μg/mL）C三萜甜草18D三萜类甜草15表4对肝癌细胞株Bel-7402的IC50值测定结果产物编号结构产物来源IC50（μg/mL）C三萜甜草6.5D三萜类甜草7.0表5对人胃腺癌细胞株Mcg-803的IC50值测定结果产物编号结构产物来源IC50（μg/mL）C三萜甜草8.0D三萜类甜草7.03结论对甜草化学成分提取方法中，用有机溶剂浸泡提取的方法非常有效，此法能提取出甜草中大部分有效药用成分。对提取出的化合物用柱层析、薄层层析、重结晶方法进行有效的分离提纯。在中草药化学成分的鉴定中，利用光谱法中的红外、紫外、核磁共振以及质谱法鉴定化合物结构，这些方法也将长期作为鉴定化合物的有效方法。通过对甜草中化合物的提取、分离、提纯与鉴定，得到三个不同化合物，分别是甾醇类，脂肪酸类，三萜类化合物。甜草中的三萜类化合物，其抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗高血压、抑制HIV逆转录酶和多聚酶活性效果非常好，具有有意义细胞毒性，其IC50值为对人肝癌细胞株Bel-7402的IC50值分别为6.5g/ml，7.0g/ml，对人胃腺癌细胞株Mcg-803的IC50值分别为8.0g/ml，7.0g/ml，在拓扑异构酶活性实验中，它们的IC50分别为18和15μg/mL。对此类化合物的进一步发现和研究将推进中药学的发展，并制造出新的药物更好的治疗肿瘤等疾病。致谢本实验是创新基金资助项目（批准号32），感谢化学与化学工程学院创新化学实验与研究基金项目。本实验是在李厚金副教授的亲自指导下完成的。在实验中碰到不少困难，李老师都耐心仔细给予知道，引导我从实验中发现问题、分析问题和解决问题。致诚挚的感谢！同时也得到实验室师兄师姐的悉心指导，在此向他们表示深深的感谢！最后感谢我的朋友，同学对我的支持和帮助！参考文献Bao-NingSou,Young-HwaKang,RosaElenaPinos,BernardD.Santarsiero.Isolationandabsolultestereochemistryofcoussaricacid,anewbioactiveTriterpenoidfromthestemsofCoussareabrevicaulis.Phytochemistry64(2003)293-302OmP.SharmaU,AnitaSingh,SaritaSharma.Levelsoflantadenes,bioactivepentacyclictriterpenoids,inyoungandmatureleavesofLantanacamaravar.aculeate.Fitoterapia712000487-491[3]T.R.Govindachariu,G.Suresh,G.N.KrishnaKumari,T.Rajamannar,P.D.Partho.Nymania-3:abioactiveTriterpenoidfromDysoxylummalabaricum.Fitoterapia70199983-86.[4]YuShao,BingNanZHOU.TownewTriterpenoidsaponinsasterbatanosideBandCfromAsterbatangensis.ChineseChemicalLettersVol.5.No.10.pp835-8391994[5]LuZeng,Zhe-mingGu,Ching-jerChang,KarlV.Wood,bandJerryL.Mclaughlin.Mefiavolkenin,aNewBioactiveTriterpenoidfromMeliavolkensii(Mefiaceae).Bioorganic&MedicinalChemistry,Vol.3,No.4,pp.383-390,1995[6]FRANCISCOA.MACfAS,*ANA