基因工程涉及的主要技术

基因工程涉及的主要技术遗传专业姓名：张红学号1310170039导师：张斌基因工程

基因工程（Geneticengineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。基因工程的操作流程DNA和RNA的提取和纯化PCR扩增构建基因文库，从基因文库中“钓”取1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定限制酶的切割与连接农杆菌转化法等分子杂交及DNA测序基因工程主要技术DNA和RNA的提取和纯化凝胶电泳基因扩增技术-PCR反应分子杂交DNA序列测序12345一、DNA和RNA的提取和纯化

核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。一般程序1、供体的核酸分离

供体细胞培养收集(菌体)细胞细胞破碎分离总DNA分离细胞器分离总RNA分离细胞器DNARNApoly(A)RNA特异性RNA染色体DNA(组建基因组文库)

cDNA（组建cDNA文库）DNA提取的几种方法

（1）基因组DNA的提取

CTAB法SDS法其它（2）非基因组DNA的提取

质粒DNA的提取

碱裂解法煮沸法

线粒体、叶绿体DNA的提取

差速离心结合SDS裂解法基因组DNA-CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液质粒DNA－碱裂解法

碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液碱裂解法流程图蛋白质的的去除：酚/氯仿抽提提使用变性性剂变性性（SDS、异硫氰氰酸胍等等）高盐洗涤涤蛋白酶处处理多糖的去去除：高盐法：：用乙醇醇沉淀时时，在待待沉淀溶溶液中加加入1/2体积积的5MNaCl，，高盐可可溶解多多糖。用多糖水水解酶将将多糖降降解。在提取缓缓冲液中中加一定定量的氯氯苯(1/2体体积)，，氯苯可可以与多多糖的羟羟基作用用，从而而去除多多糖。。用PEG8000代替替乙醇沉沉淀DNA：在在500μLDNA液中加加入200μl20%PEG8000(含含1.2MNaCl)，，冰浴浴20min。。多酚的去去除：在抽提液液中加入入防止酚酚类氧化化的试剂剂：β-巯基乙乙醇、抗抗坏血酸酸、半胱胱氨酸、、二硫苏苏糖醇等等加入易与与酚类结结合的试试剂：如如PVP、PEG(聚聚乙二醇醇)，它它们与酚酚类有较较强的亲亲和力，，可防止止酚类与与DNA的结合合盐离子的的去除：：70％的的乙醇洗洗涤总RNA的提取取根据所用用蛋白质质变性剂剂种类不不一样分分为以下下三种制制备方法法：1）热苯苯酚抽提提法2）胍盐盐法：异异硫氰酸酸胍和硫硫氰酸胍胍3）LiCl/尿素法法其中以胍胍盐法最最好，对对于从那那些RNase含量很很高的组组织（胰胰脏）中中提取RNA特特别有效效，可使使RNase迅迅速变性性，制备备的RNA有较较高翻译译活性。。在RNA制备备中，细细胞破碎碎与蛋白白质变性性是同步步进行的的。二、凝胶胶电泳常见的凝凝胶电泳泳琼脂糖凝凝胶电泳泳凝胶电泳泳的原理理：分离原理理-在电场的作作用下，，DNA分子在在琼脂糖糖凝胶中中移动时时，有电荷效应应和分子筛效应。检测原理理-溴化乙乙锭（EB）在在紫外光光照射下下能发射射荧光，，当用EB对DNA样样品染色色时，加加入的EB就插插入DNA分子子中，荧荧光强度度与DNA含量量成正比比。琼脂糖凝凝胶电泳泳分辨大大小在0.1-60kb间的DNA片段；而要分分辨较小小分子质质量的DNA片段，要要用聚丙丙烯酰胺胺凝胶，，它的分分辨率在在0.001-1kb之间。聚丙酰胺胺凝胶电电泳三、基因扩增增技术---PCR反应1.PCR的的发明（1）（2）Mullis由由此获得得1993年诺诺贝尔化化学奖。1985年Cetus公司的的科学家家K.B.Mullis发发明了PCR，，使这一一设想变变成现实实。1971年Khorana提提出体外外人工复复制DNA的设设想。当时由由于引引物和和DNA聚聚合酶酶及DNA测序序技术术都没没有解解决，，设想想未能能实现现。2.PCR的发展过过程：开始使使用大大肠杆杆菌DNA聚聚合酶酶Klenow片段段，该该酶不不耐热热，每每次加加热变变性DNA后都都要重重新补补加。。耗时时、费费力、、易出出错。。耐热热DNA聚聚合酶酶的应应用使使得自自动化化1986年年H.A.Erilish从从嗜热热水水生菌菌分离离出耐耐高温温的TaqDNA聚合合酶，，代替替大肠肠杆菌菌DNA聚聚合酶酶Klenow片断断（37oC)，PCR技术术才进进入实实用阶阶段。。1988年年R.K.Saiki把把TaqDNA聚合合酶用到PCR反应应中。。使PCR自自动循循环仪仪成为为可能能。1988年年Cetus公司司发明明自动动热循循环仪仪。3.基基本原原理模板DNA变性性引物DNA复性性引物DNA延伸伸双链DNA在受热后，配配对碱碱基的的氢键键断裂裂，DNA两条条链分分开成成为单链。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’3’3’5’5’3’TAGAACTTGACGTACGTA95oC（1））DNA模模板变变性模板模板（（template）95oCTGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’人工合合成的的单链链DNA小小片断断，碱碱基顺顺序分分别与与所要要扩增增的模模板DNA双链链的5‘端端相同同。（2））DNA模模板与与引物物复性性模板模板ATCTTGAAC5’3’ACGTACGTA5’3’引物引物引物（（primer）:40-65oCDNA聚合合酶按按碱基基配对对原则则在模模板上上延伸伸DNA链链。（3））DNA链链的延延伸TGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’模板模板ATCTTGAAC5’ACGTACGTA5’TaqTaq72oC理论上上25-30次次循环环就可可以合合成225-230条DNA。。变性——复性性—延延伸。。（4）1个个循环环的结结果（5）新一一轮循循环开开始总体积积50-100lBuffer缓缓冲液液dNTP原料Primer引物（（0.1-0.5mol/L）DNA分子子模板（（50-100ng））Taq酶DNA聚聚合酶酶（0.5-2.5U/50L）4.反应体体系：：5.PCR的应用理论上上只要要一条条模板板链，，32次循循环就就可合合成约约109条！（1））扩增增某一一段DNA从基因因组中中扩增增；从载体体上扩扩增；；组织样样本原原位扩扩增；；微量残残留DNA扩增增；分析模模板序序列；；在基因因的某某处引引入核核苷酸酸突变变（缺缺失、、重复复、插插入、、替换换等））。（2））基因因的体体外诱诱变技术关关键：：利用引引物的的5‘‘端序序列不不要求求与模模板严严格配配对，，设计计引物物时引引入突突变序序列。。五、分分子杂杂交概念：：将存存在于于凝胶胶中的的生物物大分分子转转移（（印迹迹）于于固定定化介介质上上并加加以检检测分分析的的技术术。可用于于从基基因文文库中中"钓钓"取取目的的基因因等。。目前常常使用用的主主要有有Sourthern杂杂交、、Northern杂交交、Western杂交交和原原位杂杂交等等。核酸分分子杂杂交核酸分分子杂杂交技技术（（DNA/DNAorDNA/RNA），，是在在1968年由由华盛盛顿卡卡内基基学院院（CavnegieInstituteofWashington））的RoyBritten及其其同事事发明明的。。所依据据的原原理是是，带带有互互补的的特定定核苷苷酸序序列的的单链链DNA或或RNA，，当它它们混混合在在一起起时，，其相相应的的同源源区段段将会会退火火形成成双链链的结结构。。DNA-DNA杂交双链分子同源或或部分分同源源探针针总cDNA探针针特异性性cDNA探针针人工合合成的的寡核核甘酸酸探针针探针标标记放射性性标记记32P，3H，，35S，，14C，，125I等等非放射射性标标记地高辛辛，生生物素素，荧荧光素素等用于标标记dUTP（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片Southern凝凝胶胶转移移杂交交技术术如图:基因组组DNA经经限制制性内内切酶酶消化化后，，进行行琼脂脂糖凝凝胶电电泳，，将含含有DNA片断断的凝凝胶放放入变变性溶溶液变变性后后，将将硝酸酸纤维维膜(NC)膜膜放在在胶上上，上上面放放吸水水纸巾巾，利利用毛毛吸作作用使使胶DNA转移移质NC膜膜上，，然后后利用用杂交交技术术检测测NC膜上上的DNA片断断。1979年年，J.C.Alwine等等人发发展而而来，，是将将RNA分子从从电泳泳凝胶胶转移移到硝硝酸纤纤维素素滤膜膜或其其他化化学修修饰的的活性性滤纸纸上，，进行行核酸酸杂交交的一一种实实验方方法。。由于于这种种方法法与萨萨瑟恩恩DNA印印迹杂杂交技技术十十分类类似，，所以以叫做做诺赛赛恩RNA印迹迹技术术（Northernblotting）但它不需要限制制性内切酶酶切割。用用于基因表表达的特异异性分析和和定量分析析。而将蛋白质从电泳凝胶胶中转移到到硝酸纤维维素滤膜上上，然后同同放射性同同位素125I标记的特定蛋白质质的抗体进行反应，，这种技术术叫做韦斯斯顿蛋白质质杂交技术术（Westernblotting）。原位杂交：：是将分子杂交与组织化学相结合的一一种技术。。它是利用用标记的已已知核酸探探针，在组组织、细胞胞及染色体体上检测特特异的DNA或RNA序列的的核酸杂交交技术。如如菌落和噬噬菌斑印迹迹法(colonyandplaqueblotting)；五、DNA测序技术术一、Sanger双双脱氧链终终止法二、Maxam-Gilbert化学学分析法双脱氧链终终止法是现现在应用最最多的核酸酸测序技术术，由Sanger等1977年提出出。主要用用于DNA基因分析析。FrederickSanger,1980年年NobelPrize化化学奖一、Sanger双双脱氧链终终止法DNA测序序的自动化化用四甲基若若丹明（tetramethylrhodamine））作荧光剂剂，预先标标记M13引物DNA5’-末端，按按标准的双脱氧链终终止法同引物进行行反应，用用聚丙烯酰酰胺电泳分分析。在电电泳过程中中，用激光光激发电泳泳的片断产产生荧光，，被荧光感感受器接受受，最终转转换成电信信号，被计计算机读出出，或打印印出来二、Maxam-Gilbert化学学分析法1977年年，哈佛大大学的A.M.Maxam和W.Gilbert发发明。用化学试剂处理末端放放射性标记记的DNA片断，造造成碱基的的特异性切割割。由此产生生的一组具具有不同长长度的DNA链的反反应混合物物，经凝胶胶电泳按大大小分离和和放射自显显影之后，，便可根据据x光底片片上所显示示的相应谱谱带，直接接读出待测测DNA片片断的核苷苷酸序列。。WalterGilbert,1980年NobelPrize化学奖常规的基因因工程技术术的研究方方法：除了凝胶胶电泳技术术、核酸分分子杂交技技术、PCR技术、DNA测序技术，，还涉及细细胞转化、、文库构建建、酵母双双杂交技术术等。噢噢噢！GAMEISOVER.与待扩增的的模板DNA区段的的两3’端序列列互补（5‘端相相同）的短DNA。引物（primer)①位置3’3’即2.751011bp的基因因组中有一一次完全与与19个核核苷酸的序序列相同的的机会（或或机会是约约2×10-11）。引物的长度度理论计算：：419=2.751011。一般引物设设计为长15—30bp。引物的碱基基序列5’端根据据需要可设设计成某个个内切酶的切切点顺序、突变变位点或生生物素标记记等，方便便与以后操操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’3’GCTAGCTACTTAAG5’3‘端必须须与模板正正确配对，，5’端可可以不配对对。templateprimer3）避免形成引物二二聚体（dimer）两个引物之之间不能有有两个以上上的连续碱碱基序列互互补。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’’3’CAGGACTTAGTCACT5’primer1primer2尽可能提高高G+C含量量，以提高引引物与模板板的结合力力引物的碱基基组成避免连续相同碱碱基排列或内部部回文序列.5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’’CTGCCAGTCTAC3’GACGG5’T发卡结构1）2）⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2当引物中的的（G+C）含量低低于50%时，复性性温度低于于55oC。适当提高复复性温度可可以提高引引物与模板板结合的特特异性，减减少非特异异产物的出出现。实际复性温温度选择低于Tm值值55oC。手工计算：：一般估计：：Tm是指半数双双链DNA分子解链链时的温度度Tm是指半数双双链DNA分子解链链时的温度度Tm是指半数双双链DNA分子解链链时的温度度⑥引物的浓浓度一般使用终终浓度各0.5mol/L。⑦简并引物物如果引物的的序列是从从基因产物物蛋白质的的氨基酸序列列反推出来来的，就必须考考虑密码的的简并性。。需要合成多多种序列的的引物，彼彼此间只有有一个或几几个碱基差差异。这样样的混合引引物称简并并引物。但不能有蛋白质变性性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶酶的活性。。模板（template)②模板的的量：不能太多，100l反应体系系中20ng足够。。①纯度：：PCR对模模板DNA的纯度要要求不高。。dNTPs是dATP、、dTTP、dCTP和dGTP的总总称。dNTPs一般反应体体系中dNTP混合合液终浓度度用0.2mmol/L。浓度过高会会抑制TaqDNA聚合酶酶的活性并并增加错配配率。9、静夜四四无邻，，荒居旧旧业贫。。。12月-2212月-22Wednesday,December28,202210、雨中黄黄叶树，，灯下白白头人。。。20:43:2920:43:2920:4312/28/20228:43:29PM11、以我独沈沈久，愧君君相见频。。。12月-2220:43:2920:43Dec-2228-Dec-2212、故人江海海别，几度度隔山川。。。20:43:2920:43:2920:43Wednesday,December28,202213、乍见翻翻疑梦，，相悲各各问年。。。12月-2212月-2220:43:2920:43:29December28,202214、他乡乡生白白发，，旧国国见青青山。。。28十十二二月20228:43:29下下午20:43:2912月月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月228:43下下午午12月月-2220:43December28,202216、行行动动出出成成果果，，工工作作出出财财富富。。。。2022/12/2820:43:2920:43:2928December202217、做前，能够够环视四周；；做时，你只只能或者最好好沿着以脚为为起点的射线线向前。。8:43:29下午8:43下下午20:43:2912月-229、没有有失败败，只只有暂暂时停停止成成功！！。12月月-2212月月-22Wednesday,December28,202210、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有结结果果，，但但是是不不努努力力却却什什么么改改变变也也没没有有。。。。20:43:2920:43:2920:4312/28/20228:43:29PM11、成功就是是日复一日日那一点点点小小努力力的积累。。。12月-2220:43:2920:43Dec-2228-Dec-2212、世间成事事，不求其其绝对圆满满，留一份份不足，可可得无限完完美。。20:43:2920:43:2920:43Wednesday,December28,202213、不知香积寺寺，数里入云云峰。。12月-2212月-2220:43:2920:43:29December28,202214、意志志坚强强的人人能把把世界界放在在手中中像泥泥块一一样任任意揉揉捏。。28十十二二月20228:43:29下下午20:43:2912月月-2215、楚塞三三湘接，，荆门九九派通。。。。十二月228:43下午午12月-2220:43December28,202216、少年年十五五二十十时，，步行行夺得得胡马马骑。。。2022/12