植物基因工程

关于植物基因工程第一页，共一百一十七页，2022年，8月28日

转基因植物(Transgeneplant)是拥有来自其他物种基因的植物。该基因变化过程可以来自不同物种之间的杂交，但现在该名词更多的特指那些在实验室里通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物。

第二页，共一百一十七页，2022年，8月28日第一节植物基因的克隆与分离第二节植物基因工程研究常用的基因第三节植物基因转移的病毒载体第四节植物基因转移的质粒载体第五节植物基因转化方法第六节转基因植物的检测鉴定

第三页，共一百一十七页，2022年，8月28日第一节植物基因的克隆与分离一、根据基因的功能分离目的基因但在任何类型的细胞中，都仅有少数的基因表达成相应的蛋白质，而且其表达活性和种类还会随着发育阶段及环境因素的变化而变化。因而单从蛋白质水平出发分离目的基因，显然是存在着相当的难度和一定的局限性。

一种比较有效的分离高等植物基因的策略，它涉及目的基因编码产物蛋白质的分离、纯化及突变体表型的互补克隆。

在纯化相应的编码蛋白后，构建cDNA文库或基因组文库，DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行：

将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因；(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。从蛋白到DNA第四页，共一百一十七页，2022年，8月28日二、根据mRNA特异分离目的基因mRNA差别显示技术、cDNA代表性差示分析（RDA）2.mRNA差别显示的技术

1993年，由美国波斯顿Dena-Farber癌症研究所工作的两位科学家P.Liang和建立。

1.

mRNA差减杂交(subtractivehybridization)技术，又叫差减cDNA克隆根据不同材料mRNA种类的差别分离目的基因。只适用于缺失突变体，在很大程度上受生物体核DNA复杂性的影响，而且又存在着实验周期长、重复性差、效率低等缺点。1992年，美国哈佛大学的实验室，应用该法从拟南芥菜中克隆到了一个与植物茎杆高度相关的基因，这可能是已见报道的为数不多的典型例子之一。第五页，共一百一十七页，2022年，8月28日3.cDNA代表性差示分析(representationaldifferenceanalysis)技术，cDNARDA1994年M.Huband和D.G.Scatz在N.Lisitsyn等人的基础上，发展了一种用于克隆差别表达的基因的方法。此法保留了差减杂交和差别显示的精髓，并充分发挥了PCR反应以指数形式扩增双键模板而仅以线性形式扩增单链模板这一特性，并通过降低cDNA群体复杂性和多次更换cDNA两端接头等方法，特异地扩增目的基因片段。现已被广泛地应用于分离编码产与未知的发育基因。第六页，共一百一十七页，2022年，8月28日第七页，共一百一十七页，2022年，8月28日Neurospheres(NS)areculturedbytheusualmethods.Sisterculturesaredifferentiatedfor24hoursandeacharesubjectedtorepresentationaldifferenceanalysis(RDA)withtworoundsofsubtraction.Thesubtractedproductsarethenclonedintoplasmids,propagatedinbacteria,andarrayedathighdensityontoaglassslide.ThecustommicroarrayisthenscreenedwithamplifiedcomplementaryDNAderivedfromadifferentsetofneurosphereanddifferentiatingcell(DC)cultures.Thegenesthatareverifiedtobeenrichedinneurosphereculturesarethensubjectedtosequenceanalysisandfurtherscreeningbyinsituhybridization.Cy3andCy5aregreenandredfluorescentdyes,respectively.bFGF,basicfibroblastgrowthfactor;E17,embryonicday17;P0,dayofbirth;P1ctx,postnatalday1cortex.第八页，共一百一十七页，2022年，8月28日三、根据DNA的插入作用分离目的基因

当一段特定的DNA序列，插入到植物基因组中目的基因的内部或其邻近位点时，便会诱发该基因发生突变，并最终导致表型变化，形成突变体植株。如果此段DNA插人序列是已知的，那么它便可用来作为DNA杂交的分子探针，从突变体植株的基因组DNA文库中筛选到突变的基因。而后再利用此突变基因作探针，就能从野生型植株的基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因。由于插入的DNA序列相当于人为地给目的基因加上一段已知的序列标签，因此DNA插入突变分离基因的技术，又叫做DNA标签法(DNA-tagging)。

DNA标签法克隆植物组织中的基因是较为常用的一种方法，T-DNA（T-DNAtagging）和转座子（transposontagging）均可作为基因标签。第九页，共一百一十七页，2022年，8月28日

转座的结果是使被转入的基因失活，从而有效地诱导产生表型突变株。然后构建一个对应于突变株的基因库，用作标签的转座子作为探针从基因库中筛选相对应的克隆，分离得到相对应于变异的基因，这就是转座子标签克隆基因。异源转位子标签法(hetrologoustransposontagging)

利用已经在分子水平上研究得比较清楚的外源转位子，分离异源基因的技术同源转位子标签法(homologoustransposontagging)：

用内源转位子分离同源寄主基因的技术

1.转座子标签法（Transposontagging）第十页，共一百一十七页，2022年，8月28日第十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日第十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日（1）采取农杆菌介导等适当的转化方法把转座子导入目标生物体；（2）转座子在目标生物体内的初步定位；（3）转座子插入突变的鉴定及分离；（4）转座子在目标生物体内的活动性能检测；（5）对转座子插入引起的突变体，利用转座子序列作探针，分离克隆目的基因。转座子标签法的主要步骤：(2)其次，转位子转位插入突变的频率比较低，而且在植物基因组中还常常存在着过多拷贝的转位子序列。因此，应用转位子标签法分离植物基因，不仅实验周期长，工作量大，同时还需花费大量的人力和财力。转位子标签法的局限性：(1)首先，转位子标签法只适用于存在着内源活性转位子的植物种类。而在自然界中这样的植物并不多。(3)再者，如果转位子的转位插入作用引起了致死突变，或是对于由多基因控制的某种性状，转位插入造成的单基因突变就不足以使植株产生出明显的表型变异，就难以分离到我们所期望的目的基因的。第十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日Transposontagging,expressionandsequenceofthera1gene

a,DNAgelblotshowingco-segregationofra1-m2andSpm.Lanes1–5,Spmprobe;lanes6–10,sameblotprobedwithDNAflankingtheSpmtransposonthatco-segregatedwithra1-m2.Phenotypesandgenotypesoflanes:1and6,normalhomozygousprogenitorra1+;lanes2and7,mutanthomozygousra1-R;lanes3,4,8and9,somaticmosaicofmutantandnormalheterozygousra1-R/ra1-m2;lanes5and10,normal,heterozygousra1-R/ra1-m2rev4(astable,normalallelederivedfromra1-m2).The5.5-kbfragment(arrowheads)containsbothSpmandra1.The7.8-kbprogenitorra1+fragmentisrestoredbySpmexcision,eitherinvariablestoichiometrieswhenexcisionoccurssomatically(lanes8and9)orentirelywhenitoccursgerminally(lane10).The14-kbfragment(lanes7–10)derivesfromra1-R.b,RNAgelblot.Lane1,vegetativeshootapices;lanes2–6,equallystagedimmaturetassels.c,Singleletteramino-acidcodetranslationofthera1openreadingframe.Solidlineindicatesthezinc-finger,dottedlinehighlightstheEARdomain.Changesinmutantallelesareshownabovethesequence,adjacenttothealleledesignation:insertionlocationsindicatedbycarets;ra1-RSalternativemethioninecodonindicatedwithanarrow;aminoacidchangesshown.d,Multipleaminoacidsequencealignmentofthezinc-fingerandEARdomainsofRA1frommaize(RA1maize),sorghum(S_bicolor_2)andMiscanthus(M_sinensis),andofEPFsfrommaize,rice(AAAA...)andArabidopsis(gi...).Absolutelyconservedresidueshighlightedinred,highlyconservedresiduesinyellow.第十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日

转座子标签法不但可以通过上述转座突变分离基因，而且当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时，还会由于T-DNA（transferredDNA）整合到染色体中引起插入突变，并进而分离基因，因此大大提高了分离基因的效率。第十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日SystemsforinsertionalmutagenesisinArabidopsis

萘乙酰胺(Naphthaleneacetamide,NAM)IAAH：吲哚乙酰胺水解酶基因(对萘乙酰胺NAM敏感)；NPTII：新霉素磷酸转移酶基因(对卡那霉素敏感)第十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日2.T-DNA标签法花椰菜花叶病毒(CaMV)35S多聚增强子

在根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefactyns)中，存在着一种决定植物产生冠瘿病的Ti质粒。这种质粒的T-DNA能够发生高频的转移。当根瘤土壤杆菌感染了寄主植物细胞之后，T-DNA通过其两端的25bp的同向重复序列，完全整合到植物的核基因组上。根据目前的实验结果，一般认为T-DNA在植物核基因组中的插入位置是随机的。在T-DNA标签法中，可通过在T-DNA序列中插入一个报告基因或是一个增强子，以有利于对转化的原生质体或是培养的细胞进行筛选。T-DNA第十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日Reversegenetics:Top,genestructureofFASCIATA1withexonsinblueandintronsinyellow.ReddenotesabacterialT-DNAthathasinsertedintothegene.Bottom,mutantslackingthewild-typeFAS1genehavealtereddevelopment.

第十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日第十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日第二节植物基因工程研究常用的基因一、选择标记（selectablemarkergenes）标记基因与选择标记?

如何选择和筛选转化体同样是一个重要问题。克隆的外源目的基因，对于植物受体细胞的转化频率往往是相当低的。在数量庞大的受体细胞群体中，通常只有为数不多的一小部分获得了外源的DNA，而其中目的基因已被整合到核基因组并实现表达的转化细胞，则更加稀少。

为了有效地选择出这些真正的转化子，就有必要使用特异性的选择标记基因(标记基因)。科学家一直试图把转化体带上一个标记，从而便于选择和筛选。至今己建立了许多标记基因，并已插入各种转化载体中，作为一种标记基因。第二十页，共一百一十七页，2022年，8月28日植物细胞转化实验中，应选择何种选择标记基因：1)其代谢产物不干扰寄主细胞的正常的新陈代谢活动；2)为转化细胞提供抵抗选择剂抑制作用的能力；3)选择培养基中所用的抗代谢物对转化细胞再生植株的生长，不应有明显的影响。

主要是一类编码可使抗菌素(诸如新霉素、潮霉素、链霉素以及庆大霉素等)或除草剂失活的蛋白酶的基因。第二十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日标记基因抗菌素抗性基因新霉素(neomycin)

磷酸转移酶基因潮霉素(hygromycin)磷酸转移酶基因链霉素(streptomycin)磷酸转移酶基因庆大霉素(gentamycin)乙酰转移酶基因抗除草剂抗性基因膦丝菌素(phosphinothricin)乙酰转移酶基因，即bar基因5-烯醇丙酮酰草莽酸合成酶基因，即EPSP合成酶基因植物基因工程研究常用的标记基因1.新霉素磷酸转移酶基因2.Bar基因例：第二十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日

卡那霉素是由卡那霉素链霉菌(Streptomyceshanamyceticu)产生的一种氨基糖苷类抗菌素，新霉素是弗氏链霉菌(Streptompcefradiae)产生的另一种氨基糖苷类抗菌素。这种抗菌素抗菌作用的机理是，通过与30S核糖体亚基的结合作用，而抑制蛋白质的合成。将neo基因转移到真核细胞中表达，同样能够使卡那霉素、新霉素以及G418失活。因此，获得了neo基因的转基因寄主植物细胞便具备了抵抗这些抗菌素作用的能力。该基因已被广泛地用作植物细胞转化的选择标记基因。不过有许多单子叶植物培养细胞，天然具有抵抗高水平卡那霉素的能力，因此在选用neo作选择标记基因时，这一点是要认真汲取的。

1.新霉素磷酸转移酶基因（NeomycinPhosphotransferaseⅡ,

NPT-Ⅱ）第二十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日

卡那霉素抗性(Kanr)基因即新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)，亦可称为氨基糖苷磷酸转移酶Ⅱ基因(aph2Ⅱ)，它来自大肠杆菌(E.coli)的aphA2基因。是目前在植物基因转化中应用最广泛的选择标记基因。它编码的产物氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3′)Ⅱ—酶)能对氨基糖苷类抗生素—卡那霉素具有抗性。此酶最早是从细菌转座子Tn5中分离得到的，它的作用原理是：NPTⅡ基因产物通过酶促磷酸化使氨基糖苷类抗生素失效，从而解除毒性。因为卡那霉素能干扰一般植物细胞叶绿体及线粒体的蛋白质合成，引起植物绿色器官的黄化，最终导致植物细胞的死亡。而转基因植物由于含有卡那霉素抗性(NPTⅡ)基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素，转化体就很容易从非转化体中筛选出来。第二十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日

从吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)中克隆的bar基因，是一种十分有用的、尤其是对于禾谷类粮食作物特别有效的选择标记基因。它编码的膦丝菌素乙酸转移酶，通过乙酸化作用会使膦丝菌素失去毒性。表达bar基因的植物转化细胞，在经受致死剂量的膦丝菌素处理之后，仍能正常生长或是以接近正常的速率生长，而敏感的非转化植株则迅速停止生长，并在10—21天内死亡。这个选择标记基因，已成功地应用于水稻、玉米、小麦、高粱以及大麦、燕麦、黑麦等多种禾谷类粮食作物的转基因研究。当然，在使用除草剂抗性基因bar作为选择标记基因时。要特别小心，以避免产生抗除草剂的转基因杂草。2.Bar基因第二十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日A:Transgenicrice(BarGene)B:None-transgenicRice

Transgenicherbicide-resistant（抗除草剂）rice

第二十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日TheseDNAcassetteswereinsertedintoplasmidpJR1withthebargeneunderthecontrolofthe35Spromoterforselectionoftransformantsonbialophos.EiStua1andEiRtua1,sensitiveandresistant-tubulingenes;Zmtub1,-tubullingene;nos,nopalinesynthasegene;term,terminus.第二十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日二、报告基因（reportergene）1.概念：一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

一种理想的报告基因，最基本的要求是在转化的寄主细胞中应不存在相应的内源等位基因的活性，其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而且还应具有快速、灵敏、定量和可重复的检测特性。

2.报告基因的应用：启动子的检测、反式作用因子的检测、相关蛋白质的分离、基因工程细胞系的构建。第二十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日3.常用的报告基因

报告基因实质上起到了判断目的基因是否表达的标记基因的作用，故报告基因有时也可叫做选择标记基因(selectablemarkergene)。目前研究工作者已经从大量的基因中挑选出了若干种有用的报告基因。

在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。第二十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。

nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。第三十页，共一百一十七页，2022年，8月28日

目前常用的一种报告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。例：GUS(β-glucuronidase)、大肠杆菌β-葡萄糖醛酸糖苷酶、萤光素酶基因、GFP第三十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-glucurondase，GUS)

大肠杆菌β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-glucurondase，GUS)，具有良好的稳定性，灵敏度高，易于检测。作用的底物是无色的X-葡萄糖苷酸(X-glucuronide简称Xgluc，是Xgal的类似物)。当把表达β-葡萄糖醛酸糖苷酶的转基因植物细胞，同5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-glucuronide)一道温育时，GUS酶就会把反应体系中的此种无色的底物水解产生出深蓝色的5-溴-4-氯靛蓝。GUS酶的此种显色水解作用，依所用的X-gluc底物的不同而有所差别。第三十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日大肠杆菌β-葡萄糖醛酸糖苷酶

β-(glucuronidase)GUS

转基因烟草的幼苗，在CaMV-35S启动子作用下表达

GUS(beta-glucuronidase)，不同的底物颜色不同：转基因烟草第三十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日promotertrapvectorwithpromoterlessgusgene第三十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日pCAMBIA1301pBS-RSP1/235SHyg(R)T3PGusRSP2LacZNcoIpCAM-GusBamHIHindIIIKpnIBamHIKpnIHyg(R)T7PGusRSP1KpnIBamHIGusNos3’pCAM-RSP1/2-GusHyg(R)35S35S35SRSP2RSP1KpnI用KpnI和BamHI双酶切后连接BamHINos3’Nos3’LBRB(1715bp)Firstintron(1182bp)LBLBRBRB水稻蔗糖合酶基因启动子驱动Gus基因的表达载体构建第三十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日萤光素酶基因

使用β-葡萄糖醛酸糖苷酶的编码基因gusA作报告基因有一个明显的缺点，即组织化学检测法会使细胞致死。若是改用萤光素酶的编码基因(luc)则可避免细胞致死，而且表达目的基因的活细胞的分布状况还可根据萤光的产生被测定出来。因此，被广泛地用作植物基因工程研究的报告基因。

最常用的是来自萤火虫(Photinuspyralis)的萤光素酶(luciferase)。这是一种分子量为60.7kD的单体蛋白质多肽，共有550个氨基酸，它的编码基因luc已经被克隆。

第三十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日

LucReporterGeneSystem

Photinuspyralis萤光素酶基因（luciferase）第三十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日第三十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日第三十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日promotertrapvectorwithpromoterlessfireflyluciferasegene第四十页，共一百一十七页，2022年，8月28日GFP

(GreenFluorescentProtein)

绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内，能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因表达情况。第四十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日被烟草花叶病毒感染的烟草，通过GFP可观测病毒的侵染。

检测方法：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞。对于转化植株，可在激发光照射下利用解剖照相系统进行绿色荧光蛋白检测和定位。第四十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日报告基因β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase)基因荧光素酶(luciferase)基因氯霉素乙酰转移酶(chioramphenicolacetyltransferase)基因β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)基因胭脂碱合成酶(nopalinesynthetase,nos)基因章鱼碱合成酶(octopinesynthetase,ocs)基因乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthetase)基因苏氨酸脱水酶(threoninedehydratase)基因绿色荧光蛋白质(greenfluorescentprotein)基因植物基因工程研究常用的报告基因第四十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日三、抗虫基因1.微生物源的抗虫基因；2.植物源的抗虫基因；3.动物源的抗虫基因。

虫害是造成农作物减产的最重要的自然灾害之一，全世界每年粮食总产量因病虫害而减产的幅度约为37％，其中仅虫害一项就占13％，经济损失达数千亿美元(转引自L.Jouanin，1998)。目前农作物的虫害防治，仍然是主要依靠化学农药(agrochemicals)的使用。但它同时也存在着诸多方面的弊端，直接地影响到农业生产的进一步发展。植物基因工程的建立，特别是转基因技术的应用，为农业害虫的防治提供了一条全新的途径。第四十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日微生物源的抗虫基因

cry基因：苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)最早于1902年在日本国发现，1911年在德国再次被发现并得鉴定，是一种格兰氏阳性细菌。在它的孢子形成过程中，合成出大量的杀虫结晶包涵体(insecticidalcrystallineinclusions)，其中的晶体蛋白质(crystallineprotein，Cry)是由叫做σ-内毒素(σ－endotoxins)的原毒素亚基(protoxinsubunit)组成的。大多数的苏云金芽孢杆菌菌株都会产生一系列的σ-内毒素，它对许多昆虫都具有特异的毒性，故这种蛋白质又叫做杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalprotein，ICP)，或苏云会芽孢杆菌毒蛋白(Bttoxin)。此外，苏云金芽孢杆菌在生长及芽孢形成期间，还能分泌一些外毒素，叫做苏云金毒素或β-外毒素(β-exotoxin)，同样也具有抑制幼虫生长的能力。第四十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日Cry基因转双抗虫基因741杨优良白杨杂种741杨表达载体上构建了两种不同杀虫机制的BtCryIAc基因和慈菇蛋白酶抑制剂基因（API）。并获得了一批对多种鳞翅目害虫具有高抗虫性的株系。国内第一批应用于商品化生产的转基因树木品种。

第四十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日植物源的抗虫基因

1）蛋白酶抑制剂基因：

在昆虫的体内存在着一些特殊的蛋白酶；常见的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等丝氨酸类蛋白酶。这些蛋白酶是昆虫生理代谢过程中的必要成分，负责裂解和消化食物中的蛋白质。一旦昆虫体内的这些蛋白酶的活性受到抑制，就将无法消化食物中的蛋白质成分，致使饥饿而死亡。

有一些植物在长期的进化过程中，产生出了一种用以抵抗害虫侵染的天然的免疫体系，在这类植物细胞中含有相当丰富的蛋白酶抑制剂(proteinaesinhibitor，PI)，它可使昆虫体内相应的蛋白酶丧失活性。植物的蛋白酶抑制剂，是一类小分子量的蛋白质(5～25kD)，共有10个家族。根据它们作用的靶酶，又可分成四种不同的类型：丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酰蛋白酶抑制剂(aspartylproteaseinhibitor)。若干种已报道的表达蛋白酶抑制剂的转基因植物的抗虫特性。

第四十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日植物蛋白酶抑制剂家族及类型（1）S=丝氨酸蛋白质酶抑制剂；M=金属蛋白酶抑制剂；

C=半胱氨酸蛋白酶抑制剂；A=天冬氨酸蛋白质抑制剂。（2）Bowman-Birk系指发现这种蛋白酶抑制剂的两位科学家的姓氏。序号家族类型（1）1大豆胰蛋白酶抑制剂家族(Soybeantrypsininhibitorfamily)S2Bowman-Birk抑制剂家族(Bowman-Birkinhibitorfamily)S3大麦蛋白酶抑制剂家族Barleytrypsininhibitorfamily)S4马铃薯抑制剂Ⅰ家族(PotatoinhibitorⅠfamily)S5马铃薯抑制剂Ⅱ家族(PotatoinhibitorⅡfamily)S6南瓜抑制剂家族(Squashinhibitorfamily)S7Ragi1-2/玉米双功能抑制剂家族Ragi1-2/maizebifunctionalinhibitorfamily)S8羧肽酶A、B抑制剂家族(CarboxypeptidaseA,Binhibitorfamily)M9半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族(Cysteineproteaseinhibitorfamily)C10天冬氨酸蛋白酶抑制剂家族(Aspartylproteaseinhibitorfamily)A第四十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日若干种已报道的表达蛋白酶抑制剂的转基因植物的抗虫的特性植物基因类型目标昆虫烟草CpTI豇豆丝氨酸PI鳞翅目昆虫：烟草天蛾(ManducaSexta)

烟草夜蛾(Heliothisvirescens)烟草PPI-IITI-II马铃薯丝氨酸PI番茄丝氨酸PI鳞翅目昆虫：烟草天蛾(ManducaSexta)烟草夜蛾(Heliothisvirescens)烟草PPI-II马铃薯丝氨酸PI鳞翅目昆虫：南方锞纹夜蛾(Chrusodeixiseriosoma)

烟草SpTi-I甜味马铃薯PI鳞翅目昆虫：淡边翅夜蛾(Spodopteralitura)

水稻CpTI马铃薯丝氨酸PI鳞翅目昆虫：番茄蛾(Lacanobiaoleracea)

水稻PPI-II豇豆PI鞘翅目昆虫：山杨叶甲(Chrysomelatremulae)

马铃薯CpTI豇豆PI鳞翅目昆虫：番茄蛾(Lacanobiaoleracea)白杨OCI水稻半胱氨酸PI鞘翅目昆虫：山杨叶甲(Chrysomelatremulae)豌豆

а-AI菜豆а-淀粉酶I鞘翅目昆虫：四纹豆象(Callosobruchusmaculatus)豌豆а-AI菜豆а-淀粉酶I鞘翅目昆虫：豌豆象(Bruchuspisorum)Azukibeanа-AI菜豆а-淀粉酶I鞘翅目昆虫：绿豆象(Callosobruchuschinensis)

四纹豆象(Callosobruchusmaculatus)

鹰嘴豆象(Callosobruchusanalis)

第四十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日半胱氨酸蛋白酶抑制剂

CysteineproteinaseinhibitorPredictedthreedimensionalstructureoforyzacystatin-ⅠI.Oc-Ⅰ(lightblue)ispositionedabovetheactivesiteofpapain木瓜蛋白酶(darkbluewiththeactivecysteineshowninyellow)toshowhowthetwomoleculesmayinteract半胱氨酸蛋白酶抑制剂(oryzacystatin-Ⅰ)

可以抑制木瓜蛋白酶的活性，其mRNA在水稻开花两周时表达量最高，到种子成熟时则下降到了难以检测的程度。第五十页，共一百一十七页，2022年，8月28日PictureoftomatohairyrootsEffectofhairyrootsexpressingacystatinonthegrowthofGloboderapallida.Redgrowthcurvedescribesthoseanimalscollectedfromtransgenicplantsexpressingthecystatin,thebluegrowthcurvedescribesanimalscollectedfromwildtypeplants.Picturesshowrepresentativeanimalscollectedfromthetwosetsofplants.Thedensityofanimals,theirgrowth,developmentandfecunditywereallaffected.第五十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日α-淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因

α-淀物酶抑制剂(α-amylaseinhibitor，α-AI)最初定名为凝集素类蛋白质(lectin-likeplotein)，它在高等植物，尤其是禾谷类作物和豆科作物的种子中，存量相当丰富。它们能够同一些昆虫肠道中的淀粉酶形成复合物，从而抑制淀粉酶的活性，因此α-淀粉酶抑制剂刘在植物防卫昆虫侵害方面起着重要的作用。

α-淀粉酶抑制剂、植物凝集素(phytohemagglutinin，PHA)以表壳蛋白(arcelin，ARL)，三者组成了一种植物防卫蛋白质(plantdefenceproteins)家族。。第五十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日α-淀粉酶抑制剂（α-amylaseinhibitor）AIα-淀粉酶抑制剂与哺乳动物或鞘翅目昆虫肠道中的结合α-淀粉酶形成复合物的方式，抑制淀粉酶的活性。植物防卫蛋白质（plantdefenceproteins）:植物凝集素（phytohemagglutinin,PHA）通过同哺乳动物或昆虫的肠道粘膜上的糖蛋白结合，发挥毒性表壳蛋白(arcelin,ARL)有待于作进一步阐明，可能具有毒性，可能难以消化第五十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日烟草花叶病毒（tobaccomosiavirus）TMV第五十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日凝集素基因高等植物的许多组织，特别是种子和贮藏器官中，含有丰富的凝集素(lectins)，这是一类结合碳水化合物的蛋白质(carbohydrate-bindingproteins)。事实已经证明，凝集素对于哺乳动物和鸟类是有毒性的，同时也已经观察到(Homoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Diptera)的昆虫均有毒害作用。然而有关其确切的作用机理，目前尚不清楚。第五十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日其它植物来源的抗虫基因几丁质酶的确会干扰昆虫的消化作用。几丁质酶的编码基因已经克隆，并被导入到其它植物。例如，在转基因的马铃薯植株中芽豆几丁质酶的表达，虽然对于鳞翅目昆虫番茄蛾的生长与发育并无有害的影响，但却使茄无网蚜虫的生殖力(fecundity)明显地下降。

烟草阴离子过氧化物酶(anionicperoxidase)的编码基因，当其被转移到不同种的烟草、番茄以及胶皮糖香树(sweetgun)中超量表达时，会对许多种鳞翅目昆虫、鞘翅目昆虫，以及紫色马铃薯蚜虫产生高水平的抗性。第五十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日动物源的抗虫基因

主要集中于哺乳动物的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因和烟草天蛾的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。基因产物目标昆虫转基因植物蛋白酶抑制剂烟草天蛾的抗胰凝乳蛋白酶同翅目昆虫同翅目昆虫棉花，烟草烟草天蛾的抗弹性蛋白酶紫苜蓿，棉花，烟草а1-抗胰蛋白酶（а1-AT）鳞翅目昆虫马铃薯烟草天蛾的抗胰蛋白酶同翅目昆虫棉花，烟草牛胰腺胰蛋白酶抑制剂鳞翅目昆虫莴苣，矮牵牛，马铃薯正翅目昆虫烟草，白车轴草脾抑制剂（SI）鳞翅目昆虫马铃薯几丁质酶烟草天蛾几丁质酶鳞翅目昆虫烟草动物源抗虫基因及其在转基因植物中的表达

第五十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日四、抗病基因

1)抗病毒基因

病毒交叉保护作用:早在1929年就已经观察到，感染了某种温和病毒株(mildvirusstrain)的植物，能够抵抗同种或相关的烈性病毒株(severevirusstrain)的感染。这种现象叫做交叉保护作用(crossprotection)，它在许多病毒中普遍存在。近年来，在表达正链RNA病毒外壳蛋白基因的转基因植株中，也观察到了类似的保护作用。病毒外壳蛋白是交叉保护作用的关键因子

两种病毒外壳蛋白质接近，交叉保护作用的效果就越强烈。据此科学工作者设想，将编码外壳蛋白的基因克隆出来，并导入到敏感的植株进行表达，应有可能使之获得抵抗相关烈性病毒株侵染的能力。后来的实验证明了这一观点的可行性。

第五十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日(2)抗细菌基因

抗细菌的蛋白质(antibacterialproteins)是许多动物，包括节肢动物(尤其是昆虫)、两栖动物以及哺乳动物，抵抗病原微生物侵害的防卫机理的重要成分。这类蛋白质对众多的格兰氏阴性细菌及格兰氏阳性细菌，均具有灭活作用。其编码基因已经克隆、并已在转基因植株中表达的抗细菌蛋白质，有昆虫的裂解肽(lyticpeptides)和溶菌酶(lysozymes)两大类。(3)抗真菌基因

现已发现在自然界中有许多植物、动物和微生物，都能够产生出抗真菌的蛋白质。现在有一部分抗真菌蛋白质的编码基因已经被克隆，并被转化到有关的植物当中，获得了抗性的表达。常见的有：几丁质酶基因和葡聚糖酶基因、核糖体失活蛋白基因、防卫蛋白基因、硫蛋白素。

第五十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日转Ｘa21基因抗白叶枯病水稻第六十页，共一百一十七页，2022年，8月28日4)植物抗病的分子机理

植物的防卫反应

感染植物的病原微生物有病毒、细菌和真菌三大类。植物体本身具有抵抗病原微生物的两种防卫系统：

被动的防卫系统是植物对付广谱病原微生物侵染的机械防御体系比如在细胞外壁上形成角质、蜡质、栓质以及木质素等附属结构物。而主动防卫体系，则是植物体针对特异性病原微生物侵染的一种特殊的防卫反应。

目前已从多种植物病原微生物中，分离到了可激活植物发生防卫反应的激活子(elicitor)。它可通过与存在于植物细胞表面的受体蛋白质之间的结合作用，而激活植物发生防卫反应，包括过敏性反应(hypersensitiveresponse，HR)和系统获得性抗性(systemicacquiredresistance，SAR)两种类型。与此相对应，病原微生物还存在一种抑制子，它可能通过干扰激活子与受体蛋白质之间的结合作用、信号传导通路、基因表达的启动以及某些防卫蛋白质的活性等多种途径，来抑制植物的防卫系统，从而完成病原微生物的致病作用。

第六十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日植物抗病基因与病原体无毒基因

早在1941年，等人提出了描述植物与病原体之间相互关系的“基因对基因”的假说(“gene-for-gene”hypothesis)。该假说认为，毒性病原体的无毒祖先菌株，携带有一种专门对具有相应R基因的寄主植株无毒害作用的无毒基因(avirulencegene，Avr)；对病原体抗性(或不相容性)的植株必定存在着一种R基因，而在病原体中也必定存在着一种与之相应的Avr基因；这两种基因中的任何一种的缺失或功能的丧失，寄主植株与病原体之间就不能发生相互作用，抗病反应就不会被激活，结果导致寄主植株染病(或与病原体相容)。

在“基因对基因”假说的基础上，人们又提出了一种描述R基因功能的激发子-受体模型(elicitor/receptormodel)。根据这个模型，R基因编码的受体蛋白质，通过与病原体Avr基因编码的配体蛋白质之间的相互作用，使寄主植物能识别感染的病原体。由此看来，R基因编码的蛋白质产物可能有两种不同的功能：其一是分子识别，其二是激发植株发生防卫反应。

第六十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日

五、非生物胁迫的抗性基因

(1)重金属抗性基因

金属硫蛋白(metallothionein，MT)，是一类在生物界广泛分布的、小分子量的、富含半胱氨酸的金属结合蛋白质。由于这类蛋白质与重金属离子，诸如镉(Cd)、锌(Zn)、铜(Cu)、汞(Hg)、金(Au)、银(Ag)、钴(Co)、镍(Ni)等，具有高度稳定的结合能力。到目前为止，已经分离了100多种金属硫蛋白基因。

(2)抗盐基因

人们发现在盐胁迫条件下生长的植物细胞中，会累积许多种低分子量的渗透调节剂，诸如甜菜碱(betaine)、脯氨酸(proline)以及糖醇(sugaralcohols)类物质包括甘露醇(mannitol)和山梨醇(sorbitol)等，从而使植物获得抵抗盐胁迫的能力。目前，以提高渗透调节剂合成水平为目标的植物耐盐基因工程已经开展，并已取得了若干有意义的实验结果。

betaine第六十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日(3)抗低温胁迫基因

在自然界中，因低温(coldtemperature)胁迫对农作物造成的冷害(coldinjury)，包括寒害(chillinginjury)和冻害(freezinginjury)两个方面，两者之间是有着明确的界限的。一般说来，寒害是指0℃以上的低温对农作物生长造成的伤害，而冻害则是指0℃以下的低温对农作物的生长造成的伤害，主要是植物体内结冰，导致细胞受伤，甚至死亡。

农作物的抗寒性状，往往是受多基因控制的，这些基因的表达特性可分为诱导型的和组成型的两大类。农作物在0℃以上低温的环境下经过一段时间的抗寒锻炼或低温适应性生长之后，就会被诱导合成出许多与抗寒性状有关的蛋白质，我们特称此类蛋白质的编码基因为冷诱导基因(coldinduciblegene)或冷调节基因(coldregulatedgene)。目前研究较多的是，甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(glycerol-3-phosphateacyltransferase)基因。

第六十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日

农作物的抗冻性(freezingtolerance)是同抗冻蛋白(antifreezeprotein，AFP)的作用密切相关的。抗冻蛋白质是一类能够抑制体液中冰晶生长的特殊的蛋白质，它可以使水溶液的冰点下降，但对熔点的影响却十分微弱，这就造成了水溶液的冰点和熔点之间出现差值。我们称这种差值为热滞活性(thermalhysteresisactivity，THA)，因而抗冻蛋白质亦叫做热滞蛋白(thermalhystereslsnrotelns，TBPs)。目前，已经从海洋鱼类的血清中发现了抗冻的蛋白质，而有关植物抗冻蛋白的报道比较少，近年来已从冷诱导的黑小麦叶片类囊体中分离到了部分纯化的植物抗冻蛋白。已有一些研究工作者开始使用抗冻蛋白基因进行转基因植物方面的试验。这些试验最主要的一个结果是，证实了来自鱼类的抗冻蛋白基因是能够在转基因植物中正确表达的。

第六十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日(4)抗除草剂基因

应用基因工程技术，培育具有抗除草剂特性的转基因农作物，不仅可以克服化学除草剂的花费大、专一性低等局限性，还可避免因之造成的环境污染和生态失衡的问题。

目前，在发展用于培育抗除草剂转基因农作物的研究策略方面，已经取得了明显的进展。第一种策略是，利用能解除化学除草剂毒性的外源基因转化目标作物。第二种策略是，使除草剂作用的目标蛋白质超量表达。第三种策略是，表达脱敏感的目标蛋白质(desensitizedtargetprotein)。第六十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日(5)抗氧化胁迫基因

大气中的氧和绿色植物光合作用产生的氧，在各种不同的生理胁迫的条件下，特别是在光合作用电子转运被阻断的情况下，便会在植物细胞中被还原成总称为活性氧的高毒性的化学物质，包括过氧化氢、羟自由基以及超氧化物阴离子等。经过长期自然选择的结果，植物已进化出了处理这类毒性物质的相应的机理，包括过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等的催化作用。

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)能够将两个超氧化物阴离子自由基，转换成过氧化氢和分子氧。由此产生的过氧化氢又会被细胞中的过氧化物酶或过氧化氢酶分解成水。因此SOD酶能够将植物细胞中的毒性物质超氧化物阴离子清除掉。

植物基因工程学家将超氧化物歧化酶的编码基因克隆出来，插入到植物细胞当中，由于超氧化物歧化酶表达的结果，转基因植物获得了抵抗活性氧毒害的能力。第六十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日

植物病毒及其它的一些病原体，是一类能够在感染的植物寄主细胞中进行复制和表达的“外来的”核酸类型。它们本身不能编码为其整个复制周期所需要的全部的产物，必须依赖并适应于寄主细胞的功能。它们除了具有与其复制及转录有关的一些酶的识别序列之外，还编码有一些可改变寄主功能的蛋白质产物。

以植物病毒作为植物基因工程的克隆载体具有的优点。第一，有一部分植物病毒对寄主的感染是系统性的，它能够将其基因组扩散到被感染植株的所有细胞。第二，植物病毒载体，如双子座病毒组病毒(geminiviruses)由于具有广泛的寄主范围，存在着被发展作为单子叶植物基因克隆载体的潜力。第三，被感染的植株能够繁殖出大量的病毒颗粒。

类型：单链的RNA植物病毒、单链的DNA植物病毒和双链的DNA植物病毒。第三节植物基因转移的病毒载体第六十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日植物病毒介导的转染程序

随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入，用病毒基因组作为载体转化植物细胞日益受到人们的重视，因为病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。在大约300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒约占91%，双链RNA病毒、双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。利用植物病毒载体转化植物细胞大致有以下两种战略：第六十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日一、单链RNA植物病毒

大约90％以上的植物病毒的遗传物质，都是具有感染性的正链RNA(即mRNA)。在RNA病毒中，研究比较详细的是一种小型多组分的雀麦草花叶病毒。根据P.AhlgUISt的报道，BMV可以感染包括禾谷类作物在内的许多种单子叶植物。

TMV病毒的基因组是一种单链互补的RNA，亦即是一种信使RNA。1、单链RNA植物病毒第七十页，共一百一十七页，2022年，8月28日第七十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日TobaccoMosaicVirusSchematicrepresentationoftheTMVagroinoculationdeliveryvectorsusedtoinfectplants.

(a)Infectionwiththe'unmodified'vectorresultsinfewGFP-fluorescentlesionsonplantleaves.(b)Infectionwiththe'modified'vectorresultsinmostofthecellsoftheleafshowingGFPfluorescence.

第七十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日2、单链植物DNA病毒

双子座病毒组病毒(Geminiviruses)，是一类具有成对或成双颗粒的单链DNA植物病毒。这类病原体专门侵染寄主植株的韧皮部组织，并在细胞核中进行复制和增殖，对农业生产的危害相当严重。双子座病毒组病毒具有广泛的寄主范围，对单子叶及双子叶植物都有感染性。

双子座病毒的基因组比较小，其分子大小约为2.5～3.0kb，而且主要是由环状的DNA分子组成。具有2种不同的分子，是一种二连的基因组(bipartitegenome)。

番茄金色花叶病毒(tomatogoldenmosaicvirus

)是一种双子座病毒组病毒，是最有发展前途被发展作为植物基因转移载体的一种。

第七十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日

第七十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日转染植物组织双生病毒家族成员蕃茄金花叶病毒（TGMV）克隆表达载体的构建程序第七十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日三、双链DNA植物病毒

花椰菜花叶病毒组(Caulimoviruses)是唯一的一群以双链DNA作为遗传物质的植物病毒,这一组病毒共有12种。寄主范围比较局限，虽然在实验室中可以转移到十字花科以外的少数几种植物，而在自然界中则只感染十字花科的若干种植物。

花椰菜花叶病毒组病毒，诱导被感染的细胞形成一种折射性的圆形包涵体(inclusionbody)。包涵体可能是聚集病毒的场所。

花椰菜花叶病毒(CaMV)，是花椰菜花叶病毒组中研究得最为详尽的一种典型的代表性病毒。

第七十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日

植物双生病毒（Geminiviruses）为一单链DNA病毒，成熟的双生病毒呈双颗粒状，每一个颗粒中含有一条不同的DNA单链。其中A链能单独在植物细胞中复制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因；B链编码另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B两条链必须同处于一个植物细胞中，方能形成有感染力的病毒。双生病毒具有广泛的宿主细胞范围，因此是一种很有潜力的植物病毒载体。

转染植物组织第七十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日有两种主要办法可以用来检验CaMVDNA作为植物基因工程克隆载体的可能性。一种是从分子水平上研究CaMVDNA的复制及表达(即DNA的转录与转译)，并鉴定出具有基本功能的DNA区段。另一种办法是测定DNA的缺失或外源DNA的插入对CaMVDNA的感染性造成的影响。

存在的困难：CaMV虽然可以作为承载小片段外源DNA插入的克隆载体，但由于在它的大多数限制酶位点中插入外源DNA都会导致病毒的失活，而且它不能包装具300bp以上插入片段的重组体基因组，同时CaMV的绝大多数基因都是必不可少的，不能被外源DNA所取代。

多年来有关CaMV克隆载体的设计思想，主要集中在以下三个方面：第一，由缺陷性的CaMV病毒分子同辅助病毒分子组成互补的载体系统；第二，将CaMVDNA整合在Ti质粒DNA分子上，组成混合的载体系统；第三，构成带有CaMV355启动子的融合基因，在植物细胞中表达外源DNA。第七十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日第七十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日

以双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物。第八十页，共一百一十七页，2022年，8月28日第四节植物基因转移的质粒载体一、病原土壤杆菌根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)发根农杆菌(Agrobateriumrhizogenis)Ti(Tumer－inducingplasmid）Ri(Root－inducingplasmid）冠瘿病毛根病冠瘿瘤产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝。诱导冠瘿瘤及合成冠瘿碱第八十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日二、植物冠瘿的诱发与冠瘿细胞的特性

冠瘿瘤的侵染过程：细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。

根癌农杆菌侵染植物后产生两种物质：类植物激素和冠瘿碱。类植物激素使细胞大量扩增，出现冠瘿瘤；冠瘿碱是受侵染植物组织合成的稀有氨基酸（正常植物不能够合成的的分子量的碱性氨基酸衍生物），是根癌农杆菌生活的C、N和能量来源。

根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型（agropine）和农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)第八十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日三、Ti质粒的遗传特性Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95～156×106D,约有200kb组成。第八十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日ThenaturalinfectioncycleofA.tumefaciens

第八十四页，共一百一十七页，2022年，8月28日Ti质粒的基因位点及其功能区域T－DNA区（transferred-DNAregions）：T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。Vir区（virulenceregion）：该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。Con区（regionsencodingconjugations）：该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。Ori区（originofreplication）：该区段基因调控Ti质粒的自我复制起始。(肿瘤基因)第八十五页，共一百一十七页，2022年，8月28日章鱼碱pTiAch5和胭脂碱pTiC58质粒的遗传图第八十六页，共一百一十七页，2022年，8月28日Ti质粒的遗传功能参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些细胞分裂素的活动。1)为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力5)决定寄主菌株的植物寄主范围3)赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力4)赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性

有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体生长与发育，即具有对噬菌体的“排外性”2)诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分Opine代谢区合成吲哚乙酸合成植物分裂素合成氨基酸衍生物－冠瘿碱第八十七页，共一百一十七页，2022年，8月28日Ti质粒致瘤的分子机制

损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。乙酰丁香酸第八十八页，共一百一十七页，2022年，8月28日T-DNA的染色体整合机制第八十九页，共一百一十七页，2022年，8月28日四、T-DNA的结构与功能第九十页，共一百一十七页，2022年，8月28日

1.T-DNA的发现

Chilton等人（1982）利用同位素标记的Ti质粒做探针发现，加入高浓度烟草肿瘤细胞的DNA后，Ti质粒DNA的复性速度有加快的趋势。这表明肿瘤DNA中有Ti质粒的顺序，但该顺序不多，而且没有检测到完整的Ti质粒。以后这些作者将章鱼碱型的Ti质粒B6-806用内切酶SmaI分解成19个片段，分别用同位素标记做成探针，然后与肿瘤DNA进行分子杂交，结果有二段Ti质粒的DNA（3b和10c。）能和肿瘤DNA杂交，也就是Ti质粒中这两段DNA是与肿瘤DNA同源的部分。进一步研究证明，这部分DNA是从质粒DNA上切割后，转移到肿瘤细胞，故称之为转移DNA（transferred-DNA）。这是首次证明在高等植物的细胞内存在有微生物的DNA顺序。第九十一页，共一百一十七页，2022年，8月28日2.T-DNA的结构特点

Ti质粒T-DNA区的长度约为23kb；

T-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中，T-DNA含有激发和保持肿瘤状态所必需的基因，T-DNA和植物DNA之间没有同源，在T-DNA的5´端和3´端都有真核表达信号。如TATAbox、AATAAbox及polyA等。

T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列（bordersequence），分别称之为左边界（BL或TL）和右边界（BR或TR）。该25bp边界序列属保守序列,但通常右边界（TR）序列更为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。其核心部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)两部分,是完全保守的。左边界（TL）缺失突变仍能致瘤,但右边界（TR）缺失则不再能致瘤,这里几乎完全没有T-DNA的转移,这说明右边界(TR)在T-DNA转移中的重要性。

第九十二页，共一百一十七页，2022年，8月28日T-DNA区基因的功能

研究方法：用遗传学方法在T-DNA区中引入转座子，使特定的基因发生突变，从而在肿瘤细胞中T-DNA的一个或多个转录产物也随之消朱。基因突变后不能转录出它所编码的

mRNA，这时可观察到带有突变基因的T-DNA的植物细胞的表型，从而确定这些基因转录产物的功能。用这种方法证明了编码两类转录产物的基因序列：

第九十三页，共一百一十七页，2022年，8月28日3.Ti质粒作为植物基因工程的载体

1、可行性2、存