第七章基因的定点诱变优质课件

第七章基因的定点诱变第七章基因的定点诱变1第七章基因的定点诱变第七章基因的定点诱变2突变是研究基因结构与功能的最基本手段。经典的方法是根据突变体的表型，采用遗传学的方法鉴定相应的基因。突变是研究基因结构与功能的最基本手段。3传统的诱变方式利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体射线（紫外线、X射线、γ射线等）化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等）传统的诱变方式利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生4不足生物体的任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质不足5Directedevolution

（定向进化或直接进化）

对目的基因人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适合特定目的的分子筛选出来，获得满足需要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管中分子水平的模拟进化。Directedevolution

（定向进化6基因直接进化的步骤突变基因突变库的建立筛选

基因突变库的活体或离体筛选基因直接进化的步骤突变7KeystepsofatypicaldirectedenzymeevolutionexperimentKeystepsofatypicaldirecte8局限性突变体子代频率低二、AlteredSites®IIinvitromutagenesissystem重叠部分在5’末端，与待融合的DNA片段序列互补。外切核酸酶III的消化利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列4.在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上生物体的任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频率较小。DNaseI的消化目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中除了所需的碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因经典的方法是根据突变体的表型，采用遗传学的方法鉴定相应的基因。把该库的重组质粒转化到正常宿主中，筛选鉴定突变体。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能在扩增目的基因的过程中，通过改变PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入碱基错配，导致目的基因的随机突变体外诱变是对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列，获得突变基因。研究基因的结构与功能的关系，获得所需功能的突变体蛋白质主要方法有随机诱变，DNA体外重组，寡核苷酸介导的定点诱变，嵌套缺失局限性突变体子代频率低体外诱变是对克隆化的DNA进行诱变处理9第一节随机诱变随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突变，引入位置和性质均为随机性的。包括1.错误掺入诱变（易错PCR)2.盒式诱变3.增变菌株的诱变作用4.化学诱变第一节随机诱变随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突变，引入10随机突变的策略1.易错PCR（errorpronePCR）

在扩增目的基因的过程中，通过改变PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入碱基错配，导致目的基因的随机突变随机突变的策略1.易错PCR（errorpronePCR11第七章基因的定点诱变优质课件122.盒式诱变

Cassettemutagenesis利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列

包括两种方式盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变2.盒式诱变

Cassettemutagenes13简单盒式取代诱变简单盒式取代诱变14混合寡核苷酸诱变用于取代的是含有随机突变的混合双联寡核苷酸，可引入大量的随机突变。在合成寡核苷酸片段时，需要带限制性内切酶位点，以便介导它们互为引物混合寡核苷酸诱变用于取代的是含有随机突变的混合双联寡核苷酸，15利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体还是一个内切核酸(单链，nick,gap)即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上可用于将两个DNA片段在所期望的位点进行连接InserttargetDNAdut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补(dut+/ung+)水解U和脱氧核糖磷酸的N-糖苷键Mg2+:独立作用于每条DNA链，位点随机目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等）DigestDNA(primarydigestion)dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置ssDNA制备载体利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体DNaseI酶切将基因随机切割成约50～100bp左右的小片段Splicingbyoverlapextension3增变菌株的诱变作用因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频率较小。与校正和修复有关的基因突变后细胞内基因突变频率大大增加，这样的菌株叫突变菌株。利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体3增变菌株16流程把携带待突变基因的质粒转入增变菌株扩增，随机突变体库。把该库的重组质粒转化到正常宿主中，筛选鉴定突变体。流程174化学诱变化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS（甲基磺酸乙酯）、亚硝基胍等）处理DNA片段，产生随机突变体库。4化学诱变化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS（甲基磺酸乙酯）18DNA体外重组依赖序列同源性的DNA体外重组，包括DNA洗牌(DNAshuffing)，交错延伸（StEP)，随机引发重组（RPR).DNA体外重组依赖序列同源性的DNA体外重组，包括DNA洗牌192.DNAshuffling

（DNA重排或改组）

DNAshuffling

是指DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能2.DNAshuffling20基本步骤:目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因DNaseI酶切将基因随机切割成约50～100bp左右的小片段不加引物的PCR在Taq酶的作用下将切割后的DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可能发生许多突变和重组加引物的PCR加入目的基因片段两端的引物,使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。基本步骤:目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片21基因家族的改组基因家族的改组22交错延伸重组图105以两个以上的有一定同源性的DNA片段为模板进行PCR反应，通过交换模板机制实现DNA序列的重新组装。不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。交错延伸重组图105以两个以上的有一定同源性的DNA片段为23随机引发重组图106用一套随机引物与模板配对延伸，产生不同位点的短DNA片段混合物（含有少量点突变），以这些短DNA片段为引物重新组装成全长基因。随机引发重组图106用一套随机引物与模板配对延伸，产生不同24寡核苷酸介导的定点诱变

①基本原理使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列寡核苷酸介导的定点诱变25第七章基因的定点诱变优质课件26作为诱变剂的寡核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中除了所需的碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子的中央部位，每侧至少1015个碱基通常采用化学合成无回文，重复和自身互补序列作为诱变剂的寡核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中除27②基本步骤将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体，制备单链DNA将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火，在DNA聚合酶作用下合成互补的双链DNA将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变基因突变体的筛选寡核苷酸探针杂交筛选法②基本步骤282.外切核酸酶III的消化作为诱变剂的寡核苷酸序列加引物的PCR加入目的基因片段两端的引物,使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。依赖钙离子EGTA可抑制活性在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质DigestDNA(primarydigestion)coliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频率较小。细胞内甲基介导的错配修复机制会修复新合成链中的错配碱基在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补ssDNA制备载体dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置Mg2+:独立作用于每条DNA链，位点随机（DNA重排或改组）利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列(dut+/ung+)水解U和脱氧核糖磷酸的N-糖苷键Splicingbyoverlapextension利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体TransformE.2.29局限性突变体子代频率低退火时，有些单链模板DNA未与寡核苷酸配对细胞内甲基介导的错配修复机制会修复新合成链中的错配碱基局限性突变体子代频率低30

dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置一、Kunkel法或称“U”法ung-UDG酶缺陷,UDG酶[尿嘧啶(uracil)-N-糖基化酶(glycosylase)]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基1．背景知识dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把31E.coli(dut-/ung-)

合成的DNA含有尿嘧啶，M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基E.coliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)pCJ105isaF’plasmidE.coli(dut-/ung-)E.coliCJ32ssDNA制备载体ssDNA制备载体33ssDNA制备载体单链噬菌体载体phagemid载体ssDNA制备载体单链噬菌体载体34UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA转化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA与突变寡核苷酸退火T4DNApolymeraseDNAligase2．原理只有突变链能复制转化E.coliMV1190(dut+/ung+)水解U和脱氧核糖磷酸的N-糖苷键图10-7UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttar35二、AlteredSites®IIinvitromutagenesissystem位点选择定点诱变法

二、AlteredSites®IIinvitro36第七章基因的定点诱变优质课件37三、TransformerSite-Directedmutagenesis转化子诱变法

三、TransformerSite-Directedmu38SynthesizesecondstrandDigestDNA(primarydigestion)TransformE.coli

mutS

topropagateplasmidsIsolateanddigest(Seconddigestion)TransformE.coliIsolateDNASynthesizesecondstrandDigest39DNAshufflingAdigestionDNaseI酶切将基因随机切割成约50～100bp左右的小片段生物体的任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难突变体的筛选寡核苷酸探针杂交筛选法加引物的PCR加入目的基因片段两端的引物,使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中除了所需的碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火，在DNA聚合酶作用下合成互补的双链DNATransformE.（DNA重排或改组）即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上四、PCR定点诱变DigestDNA(primarydigestion)Synthesizesecondstrand把该库的重组质粒转化到正常宿主中，筛选鉴定突变体。依赖钙离子EGTA可抑制活性设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在3‘末端，起引物作用；利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列DNAshuffling40四、PCR定点诱变1.大引物PCR诱变图10-10四、PCR定点诱变1.大引物PCR诱变412.重叠延伸Overlapextension对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链2.重叠延伸Overlapextension对于两个423、SOE重叠延伸剪接术

Splicingbyoverlapextension可用于将两个DNA片段在所期望的位点进行连接设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在3‘末端，起引物作用；重叠部分在5’末端，与待融合的DNA片段序列互补。设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补3、SOE重叠延伸剪接术可用于将两个DNA片段在所期望的43ATGATGEcoRIBamHIBamHIATGEcoRIATGBamHIATGEcoRIPCRPCR重叠延伸PCRABATGATGEcoRIBamHIBamHIATGEcoRIA44第二节嵌套缺失1.外切核酸酶III的消化ExonucleaseIII5‘3‘5‘3‘5‘3‘第二节嵌套缺失1.外切核酸酶III的消化Exonuc45第七章基因的定点诱变优质课件462.BAL31的消化主要活性为3’外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3’端去掉除单核苷酸，还是一个内切核酸(单链，nick,gap)

依赖钙离子

EGTA可抑制活性2.BAL31的消化主要活性为3’外切核酸酶活性，可从线47AABAdigestionvectorinsertBAL31BdigestionDeletedinsertsclonedtoplasmidvectorAABAdigestionvectorinsertBAL483.DNaseI的消化内切酶，可优先嘧啶核苷酸水解dsorssDNAMg2+:独立作用于每条DNA链，位点随机Mn2+:大致在同一位置切割dsDNA

产生平端或1-2个核苷酸突出3.DNaseI的消化内切酶，可优先嘧啶核苷酸水解d49第七章基因的定点诱变第七章基因的定点诱变50第七章基因的定点诱变第七章基因的定点诱变51突变是研究基因结构与功能的最基本手段。经典的方法是根据突变体的表型，采用遗传学的方法鉴定相应的基因。突变是研究基因结构与功能的最基本手段。52传统的诱变方式利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体射线（紫外线、X射线、γ射线等）化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等）传统的诱变方式利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生53不足生物体的任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质不足54Directedevolution

（定向进化或直接进化）

对目的基因人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适合特定目的的分子筛选出来，获得满足需要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管中分子水平的模拟进化。Directedevolution

（定向进化55基因直接进化的步骤突变基因突变库的建立筛选

基因突变库的活体或离体筛选基因直接进化的步骤突变56KeystepsofatypicaldirectedenzymeevolutionexperimentKeystepsofatypicaldirecte57局限性突变体子代频率低二、AlteredSites®IIinvitromutagenesissystem重叠部分在5’末端，与待融合的DNA片段序列互补。外切核酸酶III的消化利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列4.在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上生物体的任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频率较小。DNaseI的消化目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中除了所需的碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因经典的方法是根据突变体的表型，采用遗传学的方法鉴定相应的基因。把该库的重组质粒转化到正常宿主中，筛选鉴定突变体。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能在扩增目的基因的过程中，通过改变PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入碱基错配，导致目的基因的随机突变体外诱变是对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列，获得突变基因。研究基因的结构与功能的关系，获得所需功能的突变体蛋白质主要方法有随机诱变，DNA体外重组，寡核苷酸介导的定点诱变，嵌套缺失局限性突变体子代频率低体外诱变是对克隆化的DNA进行诱变处理58第一节随机诱变随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突变，引入位置和性质均为随机性的。包括1.错误掺入诱变（易错PCR)2.盒式诱变3.增变菌株的诱变作用4.化学诱变第一节随机诱变随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突变，引入59随机突变的策略1.易错PCR（errorpronePCR）

在扩增目的基因的过程中，通过改变PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入碱基错配，导致目的基因的随机突变随机突变的策略1.易错PCR（errorpronePCR60第七章基因的定点诱变优质课件612.盒式诱变

Cassettemutagenesis利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列

包括两种方式盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变2.盒式诱变

Cassettemutagenes62简单盒式取代诱变简单盒式取代诱变63混合寡核苷酸诱变用于取代的是含有随机突变的混合双联寡核苷酸，可引入大量的随机突变。在合成寡核苷酸片段时，需要带限制性内切酶位点，以便介导它们互为引物混合寡核苷酸诱变用于取代的是含有随机突变的混合双联寡核苷酸，64利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体还是一个内切核酸(单链，nick,gap)即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上可用于将两个DNA片段在所期望的位点进行连接InserttargetDNAdut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补(dut+/ung+)水解U和脱氧核糖磷酸的N-糖苷键Mg2+:独立作用于每条DNA链，位点随机目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等）DigestDNA(primarydigestion)dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置ssDNA制备载体利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体DNaseI酶切将基因随机切割成约50～100bp左右的小片段Splicingbyoverlapextension3增变菌株的诱变作用因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频率较小。与校正和修复有关的基因突变后细胞内基因突变频率大大增加，这样的菌株叫突变菌株。利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体3增变菌株65流程把携带待突变基因的质粒转入增变菌株扩增，随机突变体库。把该库的重组质粒转化到正常宿主中，筛选鉴定突变体。流程664化学诱变化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS（甲基磺酸乙酯）、亚硝基胍等）处理DNA片段，产生随机突变体库。4化学诱变化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS（甲基磺酸乙酯）67DNA体外重组依赖序列同源性的DNA体外重组，包括DNA洗牌(DNAshuffing)，交错延伸（StEP)，随机引发重组（RPR).DNA体外重组依赖序列同源性的DNA体外重组，包括DNA洗牌682.DNAshuffling

（DNA重排或改组）

DNAshuffling

是指DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能2.DNAshuffling69基本步骤:目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因DNaseI酶切将基因随机切割成约50～100bp左右的小片段不加引物的PCR在Taq酶的作用下将切割后的DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可能发生许多突变和重组加引物的PCR加入目的基因片段两端的引物,使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。基本步骤:目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片70基因家族的改组基因家族的改组71交错延伸重组图105以两个以上的有一定同源性的DNA片段为模板进行PCR反应，通过交换模板机制实现DNA序列的重新组装。不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。交错延伸重组图105以两个以上的有一定同源性的DNA片段为72随机引发重组图106用一套随机引物与模板配对延伸，产生不同位点的短DNA片段混合物（含有少量点突变），以这些短DNA片段为引物重新组装成全长基因。随机引发重组图106用一套随机引物与模板配对延伸，产生不同73寡核苷酸介导的定点诱变

①基本原理使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列寡核苷酸介导的定点诱变74第七章基因的定点诱变优质课件75作为诱变剂的寡核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中除了所需的碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子的中央部位，每侧至少1015个碱基通常采用化学合成无回文，重复和自身互补序列作为诱变剂的寡核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中除76②基本步骤将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体，制备单链DNA将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火，在DNA聚合酶作用下合成互补的双链DNA将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变基因突变体的筛选寡核苷酸探针杂交筛选法②基本步骤772.外切核酸酶III的消化作为诱变剂的寡核苷酸序列加引物的PCR加入目的基因片段两端的引物,使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。依赖钙离子EGTA可抑制活性在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质DigestDNA(primarydigestion)coliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频率较小。细胞内甲基介导的错配修复机制会修复新合成链中的错配碱基在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补ssDNA制备载体dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置Mg2+:独立作用于每条DNA链，位点随机（DNA重排或改组）利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列(dut+/ung+)水解U和脱氧核糖磷酸的N-糖苷键Splicingbyoverlapextension利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体TransformE.2.78局限性突变体子代频率低退火时，有些单链模板DNA未与寡核苷酸配对细胞内甲基介导的错配修复机制会修复新合成链中的错配碱基局限性突变体子代频率低79

dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置一、Kunkel法或称“U”法ung-UDG酶缺陷,UDG酶[尿嘧啶(uracil)-N-糖基化酶(glycosylase)]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基1．背景知识dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把80E.coli(dut-/ung-)

合成的DNA含有尿嘧啶，M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基E.coliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)pCJ105isaF’plasmidE.coli(dut-/ung-)E.coliCJ81ssDNA制备载体ssDNA制备载体82ssDNA制备载体单链噬菌体载体phagemid载体ssDNA制备载体单链噬菌体载体83UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA转化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA与突变寡核苷酸退火T4DNApolymeraseDNAligase2．原理只有突变链能复制转化E.coliMV1190(dut+/ung+)水解U和脱氧核糖磷酸的N-糖苷键图10-7UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttar84二、AlteredSites®IIinvitromutagenesissystem位点选择定点诱变法

二、AlteredSites®IIinvitro85第七章基因的定点诱变优质课件86三、TransformerSite-Directedmutagenesis转化子诱变法

三、TransformerSite-Directedmu87SynthesizesecondstrandDigestDNA(primarydigestion)TransformE.coli

mutS

topropagateplasmidsIsolateanddigest(Seconddigestion)TransformE.coliIsolateDNASynthesizesecondstrandDigest88DNAshufflingAdigestionDNaseI酶切将基因随机切割成约50～100bp左右的