首乌中有效成分的提取探究

首乌中有效成分的提取探究[摘要]首乌藤是传统的药食同源植物，为进一步研究其生物活性成分提取，以无水乙醇（分析纯）和石油醚为提取液，采用不同提取方式，提取时间以及提取液的百分比为研究影响因素，设计了实验方案并研究提取了首乌中有效成分。结果表明，有效成分最佳提取工艺条件为：提取温度95℃，乙醇体积分数65%，提取时间4h，料液比1∶7，该条件下总提取率可达3.8%。[关键词]首乌有效成分提取率影响因素0引言何首乌,又称首乌、赤首乌、乌肝石等,是蓼科植物何首乌(PoyonummultiflorumThunb)的干燥块根[1]。多年生草本，块根肥厚，长椭圆形，黑褐色。首乌自古以来就分为赤、白两个品种，唐元和七年李翱作《何首乌录》，始有何首乌“雌、雄”同用的记载，宋《开宝本草》中更明确指出何首乌有“赤、白两种，赤者雄，白者雌”，“春夏用其根，雌雄并用。野生何首乌主产于我国河南、湖北、安徽、四川一带。现代人工种植技术以贵州省和江苏省的广植技术最为普遍。根据本草学考证及商品原植物调查，何首乌与赤首乌一致，确系蓼科植物（PolygonummultiflorumThunb.），而白首乌即为山东泰安一带、辽宁等地野生或者江苏滨海等地栽培的3种萝藦科植物：CynanchumbungeiDesce.、Cwil-fordii(Maxim.)hemsl.和C.auriculatumRoyleexWight.(中文名分别为泰山白首乌、隔山消和耳叶牛皮消)，均为白首乌，苟占平认为C.bungei作为白首乌正品最确切[2-4]。根据首乌炮制方法不同可分为生首乌和制首乌两种。将原药洗净切片或切成块状,晒干为生首乌。生首乌味苦、涩、性平,具有润肠、解毒和截疟之功效,用于肠燥便秘、痈疽等。若将生品以黑豆汁拌蒸者或其他炮制法炮制者称为制首乌。制首乌味苦、甘、涩,性微温,具有补肝肾、益精血、壮筋骨、乌须发、抗衰老之功效,主要用于肝肾精血亏虚、头昏目眩、须发早白、腰膝酸软、遗精、高血脂等症[5]。现代研究表明何首乌中含有丰富的锰、钙,长期服用可补充体内这些元素的不足,达到“乌须黑发”的功效[6]。《开宝本草》称其可“益气血,黑髭鬓,悦颜色,久服长筋骨,益精髓,延年不老”。0.1首乌综述0.1.1首乌有效成分化学性质简述首乌块根含蒽醌类化合物，主为大黄素（emodin），大黄酚（chrysophanol）以及大黄素甲醚（physcion），大黄酸（rhein），大黄酚蒽酮（chrysophanolanthrone）。又含芪类化合物：白藜芦醇（resveratrol），云杉新甙（piceid），2，3，5，4′-四羟基芪-2-O-D-葡萄糖甙（2，3，5，4’－tetrahydroxystilbene－2－O-β-D-glu－copyranoside）、2，3，5，4′-四羟基芪-2－O-葡萄糖甙-2″-O-没食子酸酯（2，3，5，4’－tetrahydroxystilbene－2－O-β-D－glucoPyranoside－2″-O-monogalloylester）、2，3，5，4′-四羟基芪-2－O-葡萄糖甙-3″-O-没食子酸酯（2，3，5，4’－tetrahydroxystilbene－2－O-β-D－glucopyrano-side-3″-monogalloylester)。还含没食子酸（gallicacid），右旋儿茶精（catechin），右旋表儿茶精（epicatechin），3－O-没食子酰（－）-儿茶精[3-O-galloyl(-)－catechin]，3－O-没食子酰（-）-表儿茶精[3-O-galloyl(-)-epicatechin]，3－O-没食子酰原矢车菊素（3-O-galloyl-procyanidin）B-2，3，3′-二-O-没食子酰原矢车菊素（3，3′-di－O－galloyl－Procyanidin）B-2和β-谷甾醇（β-sitosterol），卵磷脂[7].细分如下：（1）大黄酚（chrysopanol）

金黄色片状结晶。Mp196℃（乙醇或苯），能升华，可溶于丙酮、醋酸、氯仿、甲醇、乙醇、热苯，微溶于石油醚、乙醚，不溶于水，NaHCO3和Na2CO3水溶液，可溶于NaOH溶液。（2）大黄素（Emodin）橙黄色针状结晶，mp256～257℃（乙醇或冰醋酸）能升华，其溶解度：乙醚0.14%，苯0.041%,

氯仿0.0718%，几不溶于水，易溶于乙醇，可溶于稀氨水，Na2CO3水溶液。大黄素具有抑制小鼠黑色瘤和小鼠乳腺瘤的作用。（3）芦荟大黄素（Aloeemodin）黄色针状结晶，mp223～224℃（甲苯）能升华，可溶于乙醚、苯、热乙醇、稀氨水、Na2CO3和NaOH水溶液。（4）大黄酸（Rhein）

黄色针状结晶，mp321～322℃（升华）。不溶于水，能溶于吡啶、碳酸氢钠水溶液，微溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚、石油醚。大黄酸对艾氏腹水癌有抑制作用。（5）大黄素甲醚（Physcion）红色针晶mp206℃（苯）能升华。溶解性能似大黄酚。（6）羟基蒽醌甙类①大黄素甲醚葡萄糖甙（Physcion

monoglucoside）黄色针晶mp235℃②芦荟大黄素葡萄糖甙（Aloe-emodin

monoglucoside）mp239℃③大黄素葡萄糖甙（Emodin

monoglucoside）mp190～191℃浅黄色针晶④大黄酸葡萄糖甙（Rhein

monoglucoside）mp266～270℃⑤大黄酚葡萄糖甙（Chrysophanol

monolucoside）mp245～246℃⑥大黄素-l-O-β-D-葡萄糖甙（1-0-β-D-glucopyranosyl

emodin）mp239～241℃⑦芦荟大黄素-W-O-β-D-葡萄糖甙（W-O-β-D-

glucopyranosyl

aloe-emodin）mp187～189℃⑧大黄酸甙A、B、C、D

大黄酸甙A：R=OH

大黄酸甙B：R=OH大黄酸甙C：R=H

大黄酸甙D：R=H0.1.2首乌药理活性简述(1)抗肿瘤作用体外抗肿瘤实验发现白首乌新甙(cynanauriculoside)A55μmol/L对4种人癌细胞株—Hce-8693(人大肠癌细胞)、PC3(人前列腺癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、PAA(人肺癌细胞)抑制率分别为51%、71%、68%和70%:白首乌新甙B56μmol/L对Hce-8693、PC3、Hela、PAA4种细胞抑制率分别为64%、72%和74%[8]。白首乌甾体总甙(CG)对Hce-8693、PC3、Hela、种实体瘤细胞均有较强的体外细胞毒作用,且呈浓度依赖性[9]。白首乌甙单体AK,在实验瘤株范围内对肿瘤细胞的杀伤无选择性,且有药物剂量一时间依赖效应;与化疗药顺铂(CDDP)合用,显著降低CDDP有效浓度[10];AK抗肿瘤作用机理可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关[11]。白首乌C21总甾甙腹腔注射给药法能够显著延长荷S180小鼠的寿命,口服给药法只表现出延长荷S180小鼠寿命的倾向,没有统计学意义[12]。隔山消中化合物[13]在1μmol/L下能完全逆转KB-V1和MCF7/ADR肿瘤细胞的多药耐药性。(2)对免疫功能的影响白首乌甙体外在高浓度(50、25、12μg/mL)时对小鼠脾脏Ti淋巴细胞增殖反应及IL-2、IFN-γ的活性均有抑制作用,而在低浓度(1.5μg/mL)时则有促进作用[14]。根据胸腺指数和脾指数,白首乌总甙对小鼠免疫器官的重量无影响;能激活小鼠腹腔MΦ,显著提高其吞噬消化功能,从而提高小鼠的非特异性免疫力:能显著提高MΦ提呈抗原的能力,从而提高机体的特异性免疫作用[15]。(3)清除自由基能力去皮白首乌及白首乌栓皮均能直接清除超氧阴离子自由基(O-2),其IC50分别为69.69μg/mL和2.298μg/mL,而且后者对O-2的清除能力比前者高出30多倍。去皮白首乌清除O-2的能力显著低于何首乌和灵芝,与西洋参和当归相差不大,显著高于黄芪、菊花和竹叶。而白首乌栓皮清除O-2的能力却高于其中任何一种中药[16]。白首乌C21甾甙及甾甙元具有较强的清除羟自由基的能力;C21甾甙元的C3-OH成甙与否并不从根本上影响其活性;C21甾甙元清除羟自由基的活性与母核上羟基取代的数目有关,而母核无清除作用[17]。(4)抗氧化作用自首乌总甙可抑制由剧烈过度运动所引发的氧化损伤[18]。Gagaminine能显著减少小鼠肝脏中过氧化脂质的形成和在剂量依赖效应下有效抑制肝醛氧化酶活性,其IC50为0.8μg/mL[19]。Gagaminine结构上的肉桂酰基(Cin)可抑制肝醛氧化酶活性,而烟酸基团(Nic)可抗脂质过氧化[20]。双乙酰苯CynandioneA50μg/mL能显著减少(约50%)受CCl4损伤的小鼠肝细胞分泌谷丙转氨酶和山梨醇脱氢酶,通过保持谷胱甘肽水平和抑制丙二醛产生来保护肝细胞[21]。CynandioneA50μg/mL能够明显减弱H202导致的神经毒性,降低谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和其它氧化酶活性[22]。(5)促进毛发生长作用以白首乌为主制成复方—10—白首乌生发酊用于临床,经126例临床观察,治愈率达96%,特别是对于眉发成片脱落者疗效显著[23]。(6)保肝作用实验研究证实，白首乌总苷对乙酰苯肼造成的溶血性贫血的肝脏有明显的保护作用，药物可使受损动物肝脏的酶活性有不同程度的恢复，有的可恢复到正常水平，肝细胞内RNA及蛋白合成增加，表明肝脏功能的恢复；通过增加肝细胞代谢功能，改善机体缺氧状态，减轻发绀，增强机体活力；保护细胞或促进网织红细胞发育成熟红细胞，对乙醇诱导的及乙酰苯肼造成的脂质过氧化反应均可有显著的抑制作用，从而对受损肝脏起到良好的保护作用[24]。(7)对心脏功能的影响八莫氏离体蛙心实验表明，白首乌总磷脂0.1%的任氏液有明显的强心作用。经用细胞电生理实验技术研究表明，10mg/100mL、20mg/100mL的总苷台氏液可抑制心肌收缩力，同是能缩短APD。按抗心肌缺氧缺血药物的实验方法证实白首乌总苷有降低机体耗氧量，延长缺氧条件下动物生存时间的作用[25]。生化方法研究发现，白首乌总苷可明显降低心肌细胞的耗氧量，与药物浓度有明显的量效关系。(8)对脑细胞的保护作用氧化应激反应被认为是在某些神经退化紊乱和脑老化中引起神经死亡的主要原因，在亚洲应用天然产品治疗这样的神经退化紊乱。例如，老年痴呆已有几百年，应用鼠脑神经胚胎和植细胞作为筛选系统，从已用天然药物中筛选活性脑神经保护物质。研究表明，隔山消干燥根的甲醇提取物具有明显的减轻由H202引起的神经毒性。(9)毒理学评价白首乌片小鼠经口服LD50大于10g/kg,属实际无毒;Ames、小鼠骨髓微核和精子畸形试验结果显示对体外细胞、体内细胞及生殖细胞无致畸作用;30d喂养试验显示白首乌片在一定的剂量下,出现了明显的毒性作用。白首乌片能引起雌性动物血小板减少,雄性动物谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)升高倾向及高剂量组动物出现轻度肝细胞颗粒样变性[26]。白首乌醇提物比白首乌总甙、全粉的增强免疫和抗氧化能力强;醇提物和全粉末表现出急性毒性反应,总甙具有一定的急性毒性,其LD50=5.49g/kg[27]。0.1.3有效成分提取工艺作为天然植物的何首乌，其中有效成分的提取在长久的生产工艺及其研究中有多种方法，特别是随着科技的不断进步，其提取技术也在不断创新，提取用途也趋于多样化。以下是几种首乌常用的提取方法：传统方法，超声提取技术，超临界流体萃取技术，微波协助萃取，酶法提取工艺，膜法超滤工艺。下面我们主要介绍几种。（1）传统工艺所谓的传统方法不外乎有溶剂分离法、溶剂萃取法、沉淀法、透析等方法。这些方法大多是采用固液萃取即浸提方法，对首乌提取液进行除杂精制，在应用这些传统的方法对天然植物首乌有效成分提取过程中，提取过程非常复杂。对于存在于首乌细胞不同位置和细胞器中的目标产物，若将其从细胞内浸取到液相中，目标分子将经历液泡和细胞器的膜透过、细胞浆中的扩散、细胞膜和细胞壁的透过等复杂的传质过程。若细胞壁没有破裂，浸取是靠细胞壁的渗透作用来完成的，浸取速率慢。细胞壁破坏以后，传质阻力减小，目标产物比较容易进入到萃取剂中，并依据相似相容的原理而溶解，达到萃取的目的[28]。通过传统提取得到的产品为粗产品。大多作为进行深加工原料。（2）超声提取工艺所谓超声提取技术就是利用超声作用，可以改变植物的组织，破碎细胞，加速溶解有效成分，促进扩散和传质超声提取适用于多种天然植物的有效成分的提取，如生物碱、萜类化合物、黄酮化合物、脂质核挥发油等[29]。相比较于传统首乌提取工艺提取液除含有效成分之外，还含有植物蛋白、鞣质、菌体、酶以及常规过滤未能除去的微粒传统方法不同程度地存在过程繁复、生产周期长、溶剂消耗大且回收困难、设备投资大等缺点该法比传统提取法处理时间短、提取温度低、保持有效成分活性的同时也减少了色素和蛋白质等杂质的析出，简化了提取纯化的流程，是一种良好的提取多糖的方法。超声提取伴随强度很大的声波的传播会出现声空化、声冲流、声辐射力以及声致发光等许多非线性过程，具有空化效应、热效应、机械效应和化学效应等特点[30]。（3）超临界流体萃取工艺所谓超临界流体是指在临界温度(Tc)和临界压力(Pc)以上,以流体形式存在的物质,这种流体同时具液体的高密度和气体的低粘度的双重特点。超临界CO2萃取技术(SFE-CO2)就是在超临界状态下,将超临界流体CO2，NH3，H2O，C2H5OH，C2H6等代替常规有机溶剂，利用流体(溶剂)在其临界点附近的某一区域内，与待分离的物质接触,使其有选择性地把极性、沸点和分子量不同的成分依次萃取出来,兼有萃取和蒸馏的双重作用。1实验部分1.1试剂与仪器本实验研究用到的实验主要试剂及仪器如表1，表2所示。表1试剂名称规格生产厂家无水乙醇AR江苏彤晟化学试剂有限公司石油醚AR江苏彤晟化学试剂有限公司首乌粉60目盐城果老首乌有限公司清水表2仪器名称型号生产厂家循环式多用真空泵SHB-Ⅱ郑州长城科工贸有限公司电子天平JY10001上海民桥精密科学仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱DGG-9053A上海森信实验仪器有限公司电子恒温水浴锅DK-98-1宁波天恒仪器厂索氏提取器GZ10-北京东方德教育科技有限公司1.2实验内容1.2.1实验原理由下式计算首乌有效成分的提取率（%）：有效成分提取率=样品中有效成分物质含量/干物料含量×100%. 1.2.2实验步骤(1)石油醚提取时间对提取率影响石油醚120ｇ与首乌粉混合加热回流，时间分别为4h，8h，12h，16h，20h五个时间段。回流完毕，蒸馏出石油醚残留物得馏分，根据不同时间段所得馏分，计算每个时间段提取率绘制成图表1。（2）无水乙醇提取时间对提取率的影响无水乙醇120ｇ与首乌粉混合加热回流，时间分别为4h，8h，12h，16h，20h五个时间段。回流完毕，蒸馏出无水乙醇残留物得馏分，根据不同时间段所得馏分，计算每个时间段提取率绘制成图表2。（3）无水乙醇百分比对提取率的影响无水乙醇120ｇ，按照无水乙醇/水为:(95:5)(85:5)(75:5)(65:5)(55:5)五个不同的百分比进行对比试验，根据所得馏分数据结果，绘制成图表3。（4）不同提取方式对提取率的影响分别用无水乙醇与首乌粉混合直接加热回流和进行索氏提取加热回流，对比两种方式下，所得馏分数据结果，绘制成图表4。2结果与分析2.1石油醚提取不同时间对提取率影响石油醚提取时间对提取率的影响见图1。由图1可以看出，当无水乙醇提取时间为4h时，提取率随时间的延长而升高；超过4h后，时间对提取率的影响已经很小。这可能是因为用无水乙醇提取4h时间内，总有效成分的浸出已经很充分；从节约时间、能耗和提取率等角度考虑，石油醚提取最佳时间为4h。图表1石油醚提取不同时间对提取率的影响2.2无水乙醇提取不同时间对提取率的影响无水乙醇提取时间对提取率的影响见图2。由图2可以看出，当无水乙醇提取时间为4h时，提取率随时间的延长而升高；超过4h后，时间对提取率的影响已经很小。这可能是因为用无水乙醇提取4h时间内，总有效成分的浸出已经很充分；从节约时间、能耗和提取率等角度考虑，无水乙醇提取最佳时间为4h。图表2无水乙醇提取时间对提取率的影响2.3不同乙醇体积百分比对提取率的影响乙醇体积分数对提取率的影响见图3。从图3中可以看出，在乙醇体积分数55%~65%时，总有效成分的提取率随着乙醇体积分数的增大而提高，在65%处达到最大值；在乙醇体积分数高于65%后，总有效成分的提取率随着其体积分数的增加而降低。图表3不同体积分数对提取率的影响2.4不同提取方式对提取率的影响不同提取方式对提取率的影响见图4。从图4中可以看出，在相同条件不同方式提取下，用无水乙醇直接煮比索氏提取效率高。图表4提取方式对提取率的影响3结论通过实验探究，以无水乙醇（分析纯）和石油醚为提取液，采用不同提取方式，提取时间以及提取液的百分比为研究影响因素，设计了实验方案并研究提取了首乌中有效成分。结果表明，有效成分最佳提取工艺条件为：提取温度95℃，乙醇体积分数65%，提取时间4h，料液比1∶7，该条件下总提取率可达3.8%。[参考文献][1]张爱珍，周萌.周萌重用制首乌治疗色素性疾病经验举隅.江西中医药，2007.[2]许益民，任仁安.赤、白首乌中磷脂成分的分析.药物分析杂志，1990，10(2)：105~107.[3]李军，徐国钧，徐路珊等.中药首乌类的研究.中草药，1995，26(1)：33.[4]宋俊梅，曲静然，丁霄霖等.白首乌一般成分的研究.食品研究与开发，2002，23(1)：52~53.[5]雷载权.中药学.上海:上海科学技术出版社，1995.[6]廖海民，胡正海.何首乌的生物学及化学成分研究进展.中草药，2005，36(2)：311~31.[7]《中华本草》2(6)：671~678.[8]张如松.白首乌体外抑制肿瘤细胞的成分研究.2000，35(6)：43l~437.[9]张如松.白首乌甾体总苷的体外抗肿瘤作用.中草药，2000，31(8)：599~601.[10]曾郁敏，顾立刚.白首乌甙体外抗肿瘤作用的实验研究.中国中医药信息杂志，2000，7(4)：30~32.[11]曾郁敏，顾立刚.白首乌甙诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究.中国中医药信息杂志，2000，7(6)：25~26.[12]宋俊梅.白首乌C21总甾甙对S180腹水瘤抑制作用的研究.山东轻工业学院学报，2002，16(2)：52~55.[13]HwangBY，KimSE，KimYH.Pregnaneglycosidemultidrug-resistancemodulatorsfromCynanchumwilfordii.J.Nat.Prod，1999，62：640~643.[14]顾立刚，郑嘉.白首乌甙体外对小鼠T淋巴细胞功能影响的研究.中国中医药信息杂志，2001，8(1)：34~35.[15]宋俊梅.白首乌C21甾甙对小鼠免疫功能影响的研究.无锡轻工业大学学报，2001，(6)：588~593.[16]宋俊梅，丁霄霖.白首乌对超氧阴离子自由基清除作用的研究.中国野生植物资源，1998，17(2)：l~4.[17]宋俊梅，丁霄霖.白首乌中C21甾甙及甾甙元清除羟自由基的功能.无锡轻工业大学学报，1998，17(2)：43~46.[18]宋俊梅.白首乌C21甾甙抗氧化作用的研究.食品科学，2001，22(12)：22~25.[19]LeeDU，ShinUS，HuhK.InhibitoryeffectsofGagaminine，aSteroidalAlkaloidfromCnanchumwilfordii，onLipidPeroxidationandAlde-hydeoxidaseactivity.PlantaMedica，1996，62：485~487.[20]LeeDU，ShinUS，HuhK.Structure-activityrelationshipsofgagami-nineanditsderivativesontheinhibitionofhepaticaldehydeoxidaseactivityandlipidperoxidation.Arch.Pharm.Res.，1998，21(3)：273~277.[21]LeeMK，YeoH，KimJ.ProtectionofrathepatocytesexposedtoCCl4in-vitrobyCynandioneA，abiacetophenonefromCynanchumwilfordii.J.Pharm.Pharmacol.，2000，52(3)：341~345.[22]LeeMK，YeoH，KimJ.CynandioneAfromCynanchumwilfordiiprotectsculturedcorticalneuronsfromtoxicityinducedbyH202，L-glutamate，andkainite.J.Neurosci.Res.，2000，59(2)：259~264.[23]李欣，鞠文建.白首乌生发酊的制备.中国医院药学杂志，1997，17(12)：564~565.[24]董筱玉，何原惠，于静云．白首乌对D-氨基半乳糖所致肝损伤的防治作．南京中医学院学报.1990，6(4)：234[25]杨秦飞，房良敏，甄薇．白首乌C21甾体酯苷对心肌细胞电活性的影响．中国医药学报，1987，2(6)：23[26]陆琮明，张小强.白首乌片的食品安全性毒理学研究.南京铁道医学院学报，1