对虾白斑综合症病毒(WWSV)衣壳蛋白Vp28的纯化与多克隆抗体的制备

PAGE对虾白斑综合症病毒（WWSV）衣壳蛋白Vp28的纯化与多克隆抗体的制备班级：2姓名：学号：2同组者：PAGE0PAGE1对虾白斑综合症病毒（WWSV）衣壳蛋白Vp28纯化与多克隆抗体的制备摘要：对虾白斑综合征病毒（WSSV）是一种能快速繁殖并且传播的病毒，它感染的宿主范围很广，而且致死性很高，严重危害虾蟹养殖业，衣壳蛋白VP28是WSSV病毒粒子的一个重要的囊膜蛋白。本试验成功构建了VP28的原核表达体系，并对表达的蛋白进行亲和纯化，最终成功制备了VP28的多克隆抗体，为进一步研究对虾白斑综合征病防治措施的免疫试验提供抗体和依据。关键词：Vp28WSSV亲和纯化多克隆抗体PAGE161引言对虾白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus,WSSV)是引起包括中国在内的东亚及东南亚地区养殖业对虾暴发性流行病的主要病原体，可造成大面积对虾死亡，带来巨大的经济损失。白斑综合征病毒于1992年在中国台湾首次被发现,随后迅速扩散到日本和东南亚地区ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[\o"Sanchez-Paz,2010#1"1]。WSSV是一种无包涵体、具囊膜、一端有尾巴状结构、杆状的双链环状DNA病毒ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>WongteerasupayaC</Author><Year>1995</Year><RecNum>2</RecNum><DisplayText>[2]</DisplayText><record><rec-number>2</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rdz2sz9x4z0wroev0snxeavmrees2szt2xr5">2</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">WongteerasupayaC</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">,</style><styleface="normal"font="default"size="100%">VickersJE</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">,</style><styleface="normal"font="default"size="100%">SriurairatanaS</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">,</style><styleface="normal"font="default"size="100%">etal</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"size="100%">Anon</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">－</style><styleface="normal"font="default"size="100%">occluded</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">,</style><styleface="normal"font="default"size="100%">systemicbaculovirusthatoccursincellsofectodermalandmesodermaloriginandcauseshighmortalityintheblacktigerprawnPenaeusmonodon</style></title><secondary-title>Diseasesofaquaticorganisms</secondary-title></titles><periodical><full-title>Diseasesofaquaticorganisms</full-title></periodical><pages>69-77</pages><volume>21</volume><dates><year>1995</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[\o"WongteerasupayaC,1995#2"2],毒力极强,宿主范围较广泛，可造成对虾厌食、空胃、红体和白斑。WSSV的DNA分子长度为305Kbp,约有181个开放阅读框,其病毒粒子至少包含5种结构蛋白,分子大小分别为:28kDa(VP28)、26kDa(VP26),24kDa(VP24),19kDa(VP19)和15kDa(VP15),其中VP28和VP19是囊膜蛋白，VP26/VP24、VP15是核衣壳蛋白。VP28是对虾白斑综合征病毒的主要囊膜蛋白,研究证实VP28是对虾致病的主要蛋白之一。vp28首先由MariëlleC.WvanHulten从纯化的病毒中分离并进行蛋白N-末端测序ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>vanHultenMC1</Author><Year>2000</Year><RecNum>4</RecNum><DisplayText>[3]</DisplayText><record><rec-number>4</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rdz2sz9x4z0wroev0snxeavmrees2szt2xr5">4</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>vanHultenMC1,WestenbergM,GoodallSD,VlakJM</author></authors></contributors><titles><title>Identificationoftwomajorvirionproteingenesofwhitespotsyndromevirusofshrimp</title><secondary-title>Virology</secondary-title></titles><periodical><full-title>Virology</full-title></periodical><pages>227-236</pages><volume>266</volume><number>2</number><dates><year>2000</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[\o"vanHultenMC1,2000#4"3],他们发现抗VP28的动物血清对于WSSV具有中和作用,这显示VP28可能在WSSV的吸附与入侵中具有关键作用ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>VanHultenMCW</Author><Year>2001</Year><RecNum>3</RecNum><DisplayText>[4]</DisplayText><record><rec-number>3</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rdz2sz9x4z0wroev0snxeavmrees2szt2xr5">3</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>VanHultenMCW,WitteveldtJ,VlakJM,etal</author></authors></contributors><titles><title>Whitespotsyn-dromevirusenvelopproteinVP28isinvolvedinthesystemicinfec-tionofshrimp</title><secondary-title>Virology</secondary-title></titles><periodical><full-title>Virology</full-title></periodical><pages>228-233</pages><volume>285</volume><dates><year>2001</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[\o"VanHultenMCW,2001#3"4]，而且研究发现，VP(19+28)融合蛋白的抗血清在15~22℃对对虾抗WSSV有100%的保护率,在26℃时有65%的保护率ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>LiHX</Author><Year>2005</Year><RecNum>5</RecNum><DisplayText>[5]</DisplayText><record><rec-number>5</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rdz2sz9x4z0wroev0snxeavmrees2szt2xr5">5</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">LiHX</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">,</style><styleface="normal"font="default"size="100%">MengXL</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">,</style><styleface="normal"font="default"size="100%">XuJP</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"size="100%">Protectionofcrayfish</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，Cambarusclarkia，fromwhitespotsyndromevirusbypolyclonalantibodiesagainstaviralenvelopefusionprotein</style></title><secondary-title>FishDiseases</secondary-title></titles><periodical><full-title>FishDiseases</full-title></periodical><pages>285-291</pages><volume>28</volume><number>5</number><dates><year>2005</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[\o"LiHX,2005#5"5]，所以vp28的诱导表达以及抗体的制备对对虾养殖业有重大意义。本次实验我们成功构建了VP28的原核表达体系，并使蛋白得到大规模表达，最后用纯化后的蛋白成功制备了多克隆抗体，并对其进行了检测，为深入研究WSVV的致病机制和开发新型生物制剂奠定基础。

2材料与方法2.1材料pGEX-4T-1载体、限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、Amp、表达菌株BL21(DE3)、EK蛋白酶、新西兰大白兔、弗氏佐剂(Sigma)、氨苄青霉素、丙烯酰胺和N,N'-亚甲双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠SDS溶液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、Tris-甘氨酸电泳缓冲液、SDS-PAGE加样缓冲液、转移缓冲液、脱脂奶粉、过氧化物酶标记的第二抗体、考马斯亮蓝、及其他药品。e)亲和纯化试剂：Ni-NTA亲和柱10×PBS：80gNaCl，2gKCl，14.4gNa2HPO4，2.4gKH2PO4，双蒸水定容至1L。(各组分的终浓度为1.37MNaCl，27mMKCl，101.4mMNa2HPO4，17.6mMKH2PO4，此时pH为6.7，用时稀释十倍，pH变为7.4)8×平衡缓冲液100mL：13.3g2.4MNaCl,4.8g400mMNaH2PO4,0.544g80mM咪唑,0.9691g80mMTris,1.5gNaOH，溶于80mL蒸馏水，用1MNaOH调PH至8.0，用水定容到100mL，使用时稀释成1×8×WashBuffer100mL：13.3g2.4MNaCl,4.8g400mMNaH2PO4,3.264g480mM咪唑,0.9691g80mMTris,1.5gNaOH，溶于80mL蒸馏水，用1MNaOH调PH至8.0，用水定容到100mL，使用时稀释成1×4×EluteBuffer100mL:6.9g1.3MNaCl,2.4g200mMNaH2PO4,27.2g4M咪唑,0.4846g40mMTris,用浓盐酸调PH至8使用时稀释成8.0，使用时稀释成1×梯度洗脱液：EluteBufferWashBuffer1/20150μL2.85mL1/10300μL2.7mL2/10600μL2.4mL3/10900μL2.1mL4/101.2mL1.8mLf)PEG20000，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，Bradford液2.3材料和仪器灭菌枪头与枪盒，试管，试管塞，平皿，EP管（1.5ml、2ml），滤纸，烧杯量筒，试剂瓶，电子天平、分光光度计、亲和纯化柱及填料、兔笼、兔粮、无菌注射器、研钵、兔子、高压灭菌锅、单人单面净化工作台、振荡培养箱、制冰机、冷冻离心机、超声破壁仪、低温恒温槽电泳仪。3实验方法3.1重组蛋白表达条件优化3.1.1基因的试表达：挑取含有pet-30A-vp28重组质粒的菌株，接种于5mL加有卡那霉素（终浓度100ug/ml）的LB培养基中,37℃、220r/min振荡过夜培养，作为母液。3.1.2转培养和诱导从母液中按1:100比例取出菌液，接种于5mlLB液体培养基（含卡那霉素,终浓度100ug/ml）中转培养，接四管（分别标记0,0.1,0.5,1.0mM，然后每组选择一个温度，例如25,29,33,37℃，及共摇菌16管），培养3-3.5小时至OD值0.8-1.0。然后向菌液中加IPTG至终浓度为0,0.1,0.5,1.0mM，然后每组在各自选定的温度振荡诱导表达8h。c）6000rpm离心10min收集菌体，重悬于0.5ml预冷的PBS，加入5ul20%的TritonX-100,充分混匀后用超声破碎细胞，循环为：超声1s；间隔2s;全程10min。超声过程中将菌液至于冰浴条件下，避免局部温度过高而使蛋白变性。d）留全蛋白0.1ml待跑胶是取用，将其余破碎后的菌液10000rpm离心20min，收集上清液和沉淀（沉淀用0.3mlPBS重悬），分别留样，-20℃存放，留待SDS检测。3.1.3电泳检测将玻璃板洗净，晾干，固定在电泳槽中，灌入去离子水以检测是否漏水。根据表达蛋白的大小（VP2828kDa）配制一定浓度的分离胶（12.5%）。立即将配制好的分离胶沿着边缘缓慢加入玻璃夹层中，注意不要产生气泡，加至距离玻璃板顶端1.5-2cm处，在上面覆盖一层蒸馏水或30%乙醇封胶，使凝胶表面变得平整，静放大约1-2h，使凝胶聚合，聚合后，会在分离胶和水层出现一个清晰的界面,此时抬起电泳槽的一侧水层流动而胶不会流。倒去分离胶上面的水层，用吸水纸吸尽残留的液体，向电泳槽中间加些去离子水，避免浓缩胶溢出在底部凝固。配制5%浓缩胶，迅速混匀浓缩胶，然后倒入分离胶上层，将梳子插入凝胶，使梳子齿的底部与前玻璃板顶端平齐。避免产生气泡，注意梳子正反面。将待分析的蛋白质样品与等体积样品处理液混合，沸水煮沸5min，进行SDS检测。注意标明加样顺序电泳时先用低电压95V，等到样品浓缩成一条线后，在加大电压，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时便可停止电泳。3.1.4染色和脱色及成像按分子生物学实验指导方法将凝胶去下，注意保护玻璃及凝胶完整，弃去浓缩胶，切去右下角作为定位标记，放入考马斯亮蓝染液中染色0.5-1小时后将染液到处，用清水将胶冲洗干净，加入脱色液进行脱色。直至背景蓝色褪淡，条带清晰，中间大约换3-4次脱色液。通过扫描纪录蛋白诱导表达后的存在形式。3.1.5重组蛋白表达条件优化根据实验需要对表达菌株进行不同诱导剂浓度（0.1-1mM),不同诱导表达时间（4-5h），不同温度（16,28,37℃），不同培养基（高浓度培养基等）等条件下表达情况的实验，进行SDS检测，确定表达量较高的条件或者目的表达形式出现最多的条件，进行后续大规模表达。3.2重组蛋白大规模表达3.2.1菌种筛选在原平板上挑出三个菌，在3.1.5中得到的最佳条件下培养，进行3.1.1-3.1.4的操作，最后跑SDS，染色成像后筛选大规模培养的菌株。3.2.2大规模培养根据试表达中的实验结果，选择最适的条件培养重组菌株。大规模诱导表达具体操作方法同2.2.1，仅在转培养时增加培养基体积，按1/100接种，诱导表达，离心后按1/100比例加入PBS进行浓缩，再按PBS体积的1/100加入20%的TritonX-100进行超声破碎。按优化后表达条件进行重组蛋白的诱导表达。表达前后留样检测。3.3蛋白纯化（根据载体特点及重组蛋白表达形式选择纯化方式。）3.3.1清洗Ni-NTA柱（多次使用后进行）向柱子中依次加入以下溶液：2倍体积6M盐酸胍+0.2M乙酸；1倍体积25%乙醇；1倍体积50%乙醇；1倍体积75%乙醇；1倍体积100%乙醇；1倍体积75%乙醇；1倍体积50%乙醇；1倍体积25%乙醇；1倍体积水；5倍体积10mMEDTA,pH=8.0;3倍体积水。3.3.2纯化蛋白10倍柱体积的1×平衡缓冲液平衡柱体加入待纯化样品10mL多次重复流通；10倍体积的1×平衡缓冲液洗涤；6倍体积的1×washbuffer洗涤；washbuffer接最后一管，看能否把杂蛋白洗涤下来分别用Elutebuffer/washingbuffer为1/20、1/10、2/10、3/10、4/10的混合各3mL进行洗涤，用5mL离心管收集流出液。收集12管。6倍柱体积1×Elutebuffer洗涤，收集流出液10倍柱体积的1×平衡缓冲液平衡柱体平衡柱体。柱子加入1×平衡缓冲液短期保存。3.3.3测定蛋白含量并SDS检测样品取试管，加入1mlBradford液和1ml水，向其中加入10ul洗脱液，反应5min后，分光光度计测定蛋白含量。样品同时进行SDS检测纯度，考马斯亮蓝染色。3.3.4蛋白的透析及浓缩根据上述测定及检测结果，将蛋白样品按含量多少分为两组。将蛋白装入透析袋，置于PBS中。4℃静置12h,换透析液一次。如果蛋白的浓度太低，还需要进行蛋白浓缩。使用PEG20000浓缩蛋白样品。将透析袋埋于PEG20000粉末中，不时查看，待袋中液体减少到相应体积后，取出透析袋，将蛋白吸出，测定含量，按5%加入灭菌甘油，分装多管，存于-80℃。3.4抗体制备a）兔子送到后饲养3-7天，以适应环境b)抽取血液5-10mL，分离前血清2-5mL，-20℃冻存备用，作为免疫后动物血清的对照。c)初次免疫：1ml(800ug/ml)蛋白与等体积完全弗氏佐剂混合完全，形成“油包水”乳状液(将抗原和佐剂放在EP管里，然后用枪反复吹打，然后放在涡旋仪上反复涡旋；混合后放在超声破碎仪下超声；准备好两个玻璃注射器和一个鲁尔接头，将抗原和佐剂用枪在EP管内混合好，然后吸入一个注射器内，再用鲁尔接头将另一个注射器与它接上，把抗原和佐剂来回在两个注射器内推动，两分钟左右就可以完成乳化工作。将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂），背部脊柱两侧皮下4-6点注射，每点200-300uL。d)再次免疫：3周后，1ml蛋白(800ug/ml)与等体积不完全弗氏佐剂混合完全，形成“油包水”乳状液，背部皮下4-6点注射，每点200-300uL。混合方法同步骤上。7-10天后取血1-2ml分离血清，可测抗体效价。e)效价测定：使用免疫双扩散法，其原理是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。具体方法如下：（1）取干净的载玻片，平放于实验台(台面要水平)，将融化的琼脂（1%）趁热加在载玻片上(约加4mL)，使琼脂铺满整个玻片的表面，室温下冷却凝固。（2）将载玻片放在画好的打孔式样的样板上，在琼脂上照样板打孔，孔直径4mm，两孔间距5mm。打好孔后，把凝胶的左下角切掉一小块，作为标记。（3）将抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1孔加双蒸水，以作空白对照（注意：加样至孔满为止，不可外溢）。25℃条件下保温24-48h，观察抗原抗体产生的白色沉淀线。f)加强免疫，第三针：2周后，1mL蛋白(800ug/ml)不加佐剂，大腿肌肉注射。再次测定效价。g)取血:抗体效价合格后，即可从颈动脉放血。提前准备15cm培养皿，洗净灭菌烘干，如带有湿气会产生溶血，细菌污染会破坏抗体。血液凝固后析出的淡黄色液体，就为制备好的抗血清。少量分装于1.5mLEP管，每管1mL，其余分装于5-10mL管中，-20℃冻存备用。4结果与分析4.1蛋白的表达条件优化：经过多次失败的实验，我们最终观察到了在37℃条件下，改变IPTG的浓度（1mM、0.5mM、0.1mM）以及诱导时间（4h、8h、12h）的诱导表达效果。如图1,2,3：图137℃诱导剂浓度为0.1mM时不同诱导时间蛋白的表达量1：marker；2:、3、4：诱导剂浓度为0.1，诱导时间为4h的诱后、上清、沉淀的蛋白表达量；5、6、7：诱导剂浓度为0.1，诱导时间分别为8h的诱后、上清、沉淀的蛋白表达量；8、9、10：诱导剂浓度为0.1，诱导时间为12h的诱后、上清、沉淀的蛋白表达量图237℃诱导剂浓度为0.5mM时不同诱导时间蛋白的表达量1：marker；2：诱前；3、4、5：诱导剂浓度为0.5，诱导时间为4h的诱后、上清、沉淀的蛋白表达量；6、7、8：诱导剂浓度为0.5，诱导时间分别为8h的诱后、上清、沉淀的蛋白表达量；9、10、11：诱导剂浓度为0.5，诱导时间为12h的诱后、上清、沉淀的蛋白表达量图337℃诱导剂浓度为1.0mM时不同诱导时间蛋白的表达量1：marker；2:、3、4：诱导剂浓度为1.0，诱导时间为4h的诱后、上清、沉淀的蛋白表达量；5、6、7：诱导剂浓度为1.0，诱导时间分别为8h的诱后、上清、沉淀的蛋白表达量；8、9、10：诱导剂浓度为1.0，诱导时间为12h的诱后、上清、沉淀的蛋白表达分别对图1、2、3进行横向比较：图1与图3：可能由于点样时样品逸漏，导致每个孔样品量不一样，而跑出的结果很难比较各诱导时间之间蛋白表达量的多少，所以不拿来参考；图2：调节图片对比度后可得出诱导时间为8h与12h的比诱导时间为4h的蛋白的表达量较高；比较各组的上清和沉淀中蛋白表达量可知，重组蛋白主要在上清中表达，沉淀中也有少量表达，且随着诱导时间的增长，其更倾向于在沉淀中表达，同时各杂蛋白的表达量也增大。推测可能是因为当培养时间较长时，大量的重组蛋白表达后来不及被折叠成正确的形式，最终形成无活性的包涵体颗粒。为了更准确的确定最佳浓度和最佳诱导时间，我们将三种浓度三种诱导时间的诱导后菌液上清跑胶得图4，并用软件绘制的目的蛋白表达量的柱状图见图5。图437℃不同诱导时间及不同诱导浓度时上清表达量0：marker；1、2、3：诱导剂浓度为0.1时，诱导时间分别为4、8、12h的上清的表达量；4、5、6：诱导剂浓度为0.5时，诱导时间分别为4、8、12h的上清的表达量；7、8、9：诱导剂浓度为1.0时，诱导时间分别为4、8、12h的上清的表达量图537℃不同诱导时间及不同诱导浓度时上清表达量柱状图结合图4及图5可得出，第5个的表达量最高，即诱导浓度为0.5mM，诱导时间为8h是该蛋白的最佳诱导条件。故选择诱导浓度为0.5mM，诱导时间为8h的条件来进行大规模培养。4.2蛋白的大规模表达：图6菌株筛选图1：marker；2：菌1；3：菌2；4：菌3由上图可知，2号菌株的蛋白表达量最高，故选择2号菌株进行大规模培养。4.3蛋白纯化进行大规模培养后得到的蛋白纯化洗脱结果如图7、8，根据蛋白的O.D.值绘制的蛋白浓度与O.D.值对应关系的标准曲线如图9，测得的各管蛋白的浓度如表1、2，根据表1、2绘制各管蛋白的浓度图见图10表1第一管重组蛋白洗脱顺序及蛋白浓度表图7第一管重组蛋白亲和纯化洗脱图表1第一管重组蛋白洗脱顺序及蛋白浓度表泳道123456789101112131415样品Markerwash1/201/102/102/103/103/104/104/104/104/10Elute平衡柱基浓度（mg/ml）1.0143-0.19330.59140.23860.34100.42000.40950.59520.26000.42100.4667---图8第二管重组蛋白亲和纯化洗脱图表2第二管重组蛋白洗脱顺序及蛋白浓度表表2第二管重组蛋白洗脱顺序及蛋白浓度表泳道1234567891011样品Markerwash1/201/102/102/103/103/104/104/10Elute浓度1.0145-0.24530.28930.55070.50130.52400.56670.48670.26800.9640图9蛋白浓度标准曲线图10根据表1、2绘制的各管蛋白浓度图从图7来看，第8、9、10三管即洗脱液比例为3/10和4/10时）的蛋白的洗脱量最大，从图8来看，第4、5、6三管（即洗脱液比例为1/10和2/10时）的蛋白洗脱量最大。根据表1、2绘制的折线图可知，6、7、8三管洗脱下的蛋白量较高，可能为目的蛋白，但根据表1绘制的折线图在第11、12管时又出现一高峰，推测可能为杂蛋白被洗脱下来。而表2中则没有该峰。从图7、8与表1、2对比来看，有些泳道的目的蛋白条带颜色深度与测得的浓度不是很匹配，如图7中的第10泳道，图8中的第7、8、9泳道，但此结果是经过多次实验后的结果，基本可以排除制样时未混匀及点样时样品溢出的误差；推测可能是所得到的蛋白质中含有大量的杂蛋白，也可隐约看到图片上方有些许阴影，推测可能为杂蛋白。总之我们所纯化后的蛋白检测结果不太好，我们便放弃选择上述纯化后的蛋白，而是选择老师提供的Prx5蛋白做抗原打兔子。5总结本次实验，虽然我们的实验结果不太好，最后只能用老师提供的材料进行下一步的实验，但在实验过程中我们学到了很多。通过本实验，我们对蛋白质的提取、亲和纯化及SDS电泳的原理有了一定的了解，并几乎每个人都操作了实验的每一步（因为实验重复次数太多），巩固并增加了我们的理论知识，也锻炼了我们的实验动手操作能力，更提高了我们的实验素质及与他人协作的能力。另外，从第二步开始，我们几乎每次实验都不成功，可能与为了锻炼每个同学的实验操作能力，每次都换人做实验，大家都不太熟练有关；但之后我们又更加细致认真的做实验，尽量要实验操作能力较强的同学来操作重要实验，但实验结果依然不太好，而且实验仪器（譬如纯化用的柱子）也出了一点问题，大家的信心大减，后续的实验也比较失败。实验失败的原因有很多种，我们所能分析和弥补的有限，这样不断的分析失败原因并不断的重复只会让自己心态更不好，实验失败的概率也更大。所以宁可花多一点时间来设计实验，安排好每个人每个时间段的任务，最后争取一次成功。总之，虽然我们的实验并不成功，但我们因此学到的也更多，希望在后续的实验中能汲取教训，争取一次成功。参考文献[1]WangYC,LoCF,ChangPS,etal.ExperimentalinfectionofwhiteaspotbaculovirusinsomeculturedandwilddecapodsinTaiWan[J].Aquaculture.1998.164:221-31.[2]VanHultenMCW,WitteveldtJ,VlakJM,etal.WhiteSpotSyndromeVirusEnvelopeProteinVP28IsInvolvedintheSystemicInfectionofShrimp[J].Virology.2001.285:228-233.[3]HYPERLINK"/pubmed?term=vanHultenMC[Author]&cauthor=true&caut