第十六章色谱分析法概论课件

第十六章

色谱分析法概论第十六章

色谱分析法概论1概述

色谱法是一种重要的分离、分析技术。

一、色谱法（起源）

1906年，俄国植物学家茨维特（Tswett）首次研究了植物叶的色素成分。（如图）分析过程为离线的，即不能连续进行。人们将这种方法称为色谱法，随着色谱法的发展，可对大量无色物质进行分离，但仍沿用了色谱法这一名词。概述

色谱法是一种重要的分离、分析技术。

一、色谱法（起源）2

现代色谱法的分离、分析过程是在线的，即连续进行。现代色谱法3二、色谱法特点①分离效率高②选择性好③集分离、分析于一体④灵敏度高（可测10-11—10-13g）⑤分析速度快⑥易与其它仪器联用，应用范围广二、色谱法特点4第一节色谱法的分类和发展一、色谱法的分类1.按两相（固定相与流动相）状态分类气相色谱法

色谱法液相色谱法超临界色谱法

第一节色谱法的分类和发展一、色谱法的分类52.按分离原理分类

吸附色谱分配色谱色谱法离子交换色谱凝胶色谱（扩散）、亲和色谱、络合色谱、热色谱等2.按分离原理分类63.按固定相形式分类填充柱色谱柱色谱色谱法毛细管色谱纸层色谱薄层色谱3.按固定相形式分类7二、色谱法的发展㈠色谱法的历史㈡色谱法的现状和发展趋势1.新型固定相和检测器的研制2.色谱新方法的研究3.色谱联用技术4.色谱专家系统二、色谱法的发展8第二节色谱过程和基本原理一、色谱过程及色谱图第二节色谱过程和基本原理一、色谱过程及色谱图9二、色谱流出曲线和有关概念㈠色谱流出曲线1.色谱流出曲线

当试样流经色谱柱后，各组分随流动相的移动而在两相间反复进行吸附、解吸、或分配、萃取过程，最后依次得到各组分，将各组分浓度经检测器转换成电信号而记录下来，得到一条信号随时间变化的曲线，称为色谱流出曲线。二、色谱流出曲线和有关概念102.基线

操作条件稳定后，仅有流动相通过时，检测器响应讯号随时间变化的曲线。3.色谱峰（P339)4.色谱峰区域宽度

它是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，可反映出色谱柱的分离效能2.基线11度量色谱峰区域宽度常用三种方法：①标准偏差σ

即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。②半峰宽W1/2

即峰高一半处对应的峰宽W1/2=2.354σ③峰底宽Wb

即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距Wb=4σ度量色谱峰区域宽度常用三种方法：①标准偏差σ12㈡保留值

保留值是试样各组分在色谱柱中保留行为的量度，可反映出组分与固定相间作用力大小。1.死时间t0

不被固定相吸附或溶解的组分，即非滞留组分（如空气、甲烷）从进样开始到出现其色谱峰最大值所需的时间。它也是气体流经色谱柱中空隙所需时间。㈡保留值132.保留时间tR

某组分从进样到出现色谱峰最大值的时间。它取决于色谱过程的热力学因素，是定性依据。3.调整保留时间tR′

扣除死时间后的保留时间。它反映了组分与固定相作用所消耗的时间，是各组分产生差速迁移的物化基础。2.保留时间tR144.死体积V0

指在t0这段时间内通过色谱柱的载气体积。即色谱柱内载气所占的体积。

V0=t0·Fc(

Fc，ml/min为流动相流速)5.保留体积VR

指从进样到出现某组分色谱峰最大值时所通过的载气体积。VR=tR·Fc4.死体积V0156.调整保留体积VR′

指扣除死体积后的保留体积。

VR′=VR-V0=tR′·

Fc7.

相对保留值r2，1

指在相同操作条件下，某组分2的调整保留值与另一组分1的调整保留值之比。即6.调整保留体积VR′16

相对保留值仅与柱温、固定相性质有关。可用来表示色谱柱的选择性。*r2，1↑，两组分越易实现分离。*r2，1=1时，两组分色谱峰重叠。相对保留值仅与柱温、固定相性质有178.保留指数I

在GC中，把组分的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为，也就是以正构烷烃系列作为组分相对保留值的标准，用两个保留时间紧邻待侧组分的基准物质来标定组分，这个相对值称为保留指数。8.保留指数I18㈢色谱峰高和峰面积1.峰高h

是组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。2.峰面积A

色谱曲线与基线间包围的面积。㈢色谱峰高和峰面积19㈣分离度（分辨率）R柱效能和选择性对分离的影响柱效选择性差差

差好

好好㈣分离度（分辨率）R柱效能和选择性对分离的影响柱效20

因此，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中的分离情况，需引入一个综合指标—分离度R分离度：相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰底宽度平均值之比。即因此，单独用柱效或选择性不能真实反21

理论证明，若相邻两色谱峰对称且满足正态分布，当R<1两峰部分重叠R=1.0分离程度可达98%

R=1.5分离程度可达99.7%通常，R=1.5作为相邻两峰完全分离的标志。理论证明，若相邻两色谱峰对称且满足22色谱从流出曲线中，可得到重要信息：⑴根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少数目；⑵根据色谱峰的保留值，可以定性分析；⑶根据色谱峰的面积和峰高，可以定量分析⑷色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；⑸色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。色谱从流出曲线中，可得到重要信息：23三、分配系数与色谱分离㈠分配系数和容量因子1.分配系数K

式中cs、cm分别为组分在固定相和流动相中的浓度。

K与温度、压力有关；也与组分性质、流动相、固定相性质有关。条件一定时，K一定。三、分配系数与色谱分离㈠分配系数和容量因子式242.容量因子k（分配比、保留因子）式中mS、mm分别为组分在固定相和流动相中物质的质量。容量因子不仅与温度和压力有关，而且还与固定相和流动相的体积比有关。2.容量因子k（分配比、保留因子）式中mS、m253.分配系数和容量因子的关系3.分配系数和容量因子的关系26㈡分配系数和容量因子与保留时间的关系意义：在色谱图上找出tR、t0，则可计算出k，即可以直接从色谱图上求得分配比（容量因子）k。反之，分配系数不同的组分具有不同的保留值，因而在色谱图上有不同位置的色谱峰。㈡分配系数和容量因子与保留时间的关系意义：在色谱图上27见P343见P34328㈢色谱分离的前提

由上式可见，若使ΔtR≠0,必须KA≠KB,即分配系数不等是分离的前提。㈢色谱分离的前提29第三节基本类型色谱方法及其分离机制一、分配色谱（见P345页）1.正相分配色谱：流动相极性＜固定相极性2.反相分配色谱：流动相极性＞固定相极性洗脱顺序由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。二、吸附色谱法第三节基本类型色谱方法及其分离机制一、分配色谱（见P3430第四节色谱法基本原理一、塔板理论（半经验理论）（P351）

该理论是1952年马丁（Martin）等人提出

从热力学角度讨论了流出曲线形状与分离效果关系。第四节色谱法基本原理一、塔板理论（半经验理论）（P35131

塔板理论将色谱柱假想为一个精馏塔。即色谱柱（柱长L）是由一系列连续的、相等的水平塔板组成，每一块塔板高度为H，在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随流动相按一个一个塔板的方向向前移动。塔板理论将色谱柱假想为一个精馏塔。32塔板理论的基本假设为：1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。2）样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积4）在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。

塔板理论的基本假设为：33

虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。

34n与色谱参数之间的关系（经验公式）为：

由此可以看出，组分保留时间越长、峰宽度越小，则n越多，色谱柱效能越高。n与色谱参数之间的关系（经验公式）为：由此可以看出，35塔板理论贡献：①分配系数不同，最终可分离。②平衡次数n（>50），曲线接近正态分布曲线。③给出了n与Wb的关系式（由此关系式可得出流出曲线与分离效果关系）n，柱效。若两组分K相同，则无论n多大，都无法分离。塔板理论贡献：①分配系数不同，最终可分离。36塔板理论不足：①无法解释峰扩展原因。（为使n↑，则Wb应↓，如何使Wb↓

？）②无法解释影响塔板高度的因素（L一定，n∝1/H,如何使H↓？）

塔板理论不足：①无法解释峰扩展原因。37二、速率理论1956年荷兰学者VanDeemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论--速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。二、速率理论1956年荷兰学者VanDeem38速率理论的简化方程式:

H=A+B/u+Cu㈠影响塔板高度(柱效)的动力学因素⒈涡流扩散：A=2λdp由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。dp为填料直径，λ为填充不规则因子，填充越不均匀λ越大。

HPLC常用填料粒度一般为3~10μm，最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小难于填充均匀（λ大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，λ越小。总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效。毛细管无填料，A＝0。

速率理论的简化方程式:39⒉纵向扩散：B=2γDm由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。

u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm很小，通常仅为气相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。

γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散，而引入的柱参数，用以对Dm进行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛细管柱的γ＝1。

⒉纵向扩散：B=2γDm40⒊传质阻力由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。

㈡流动相线速度对塔板高度的影响见P353页⒊传质阻力41第十六章色谱分析法概论课件42

从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：

①进样时间要短。

②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。

④适当的流速。以H对u作图，则有一最佳线速度uopt，在此线速度时，H最小。一般在液相色谱中，uopt很小(大约0.03～0.1mm/s)在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。

⑤较小的检测器死体积。

从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱43第十六章

色谱分析法概论第十六章

色谱分析法概论44概述

色谱法是一种重要的分离、分析技术。

一、色谱法（起源）

1906年，俄国植物学家茨维特（Tswett）首次研究了植物叶的色素成分。（如图）分析过程为离线的，即不能连续进行。人们将这种方法称为色谱法，随着色谱法的发展，可对大量无色物质进行分离，但仍沿用了色谱法这一名词。概述

色谱法是一种重要的分离、分析技术。

一、色谱法（起源）45

现代色谱法的分离、分析过程是在线的，即连续进行。现代色谱法46二、色谱法特点①分离效率高②选择性好③集分离、分析于一体④灵敏度高（可测10-11—10-13g）⑤分析速度快⑥易与其它仪器联用，应用范围广二、色谱法特点47第一节色谱法的分类和发展一、色谱法的分类1.按两相（固定相与流动相）状态分类气相色谱法

色谱法液相色谱法超临界色谱法

第一节色谱法的分类和发展一、色谱法的分类482.按分离原理分类

吸附色谱分配色谱色谱法离子交换色谱凝胶色谱（扩散）、亲和色谱、络合色谱、热色谱等2.按分离原理分类493.按固定相形式分类填充柱色谱柱色谱色谱法毛细管色谱纸层色谱薄层色谱3.按固定相形式分类50二、色谱法的发展㈠色谱法的历史㈡色谱法的现状和发展趋势1.新型固定相和检测器的研制2.色谱新方法的研究3.色谱联用技术4.色谱专家系统二、色谱法的发展51第二节色谱过程和基本原理一、色谱过程及色谱图第二节色谱过程和基本原理一、色谱过程及色谱图52二、色谱流出曲线和有关概念㈠色谱流出曲线1.色谱流出曲线

当试样流经色谱柱后，各组分随流动相的移动而在两相间反复进行吸附、解吸、或分配、萃取过程，最后依次得到各组分，将各组分浓度经检测器转换成电信号而记录下来，得到一条信号随时间变化的曲线，称为色谱流出曲线。二、色谱流出曲线和有关概念532.基线

操作条件稳定后，仅有流动相通过时，检测器响应讯号随时间变化的曲线。3.色谱峰（P339)4.色谱峰区域宽度

它是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，可反映出色谱柱的分离效能2.基线54度量色谱峰区域宽度常用三种方法：①标准偏差σ

即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。②半峰宽W1/2

即峰高一半处对应的峰宽W1/2=2.354σ③峰底宽Wb

即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距Wb=4σ度量色谱峰区域宽度常用三种方法：①标准偏差σ55㈡保留值

保留值是试样各组分在色谱柱中保留行为的量度，可反映出组分与固定相间作用力大小。1.死时间t0

不被固定相吸附或溶解的组分，即非滞留组分（如空气、甲烷）从进样开始到出现其色谱峰最大值所需的时间。它也是气体流经色谱柱中空隙所需时间。㈡保留值562.保留时间tR

某组分从进样到出现色谱峰最大值的时间。它取决于色谱过程的热力学因素，是定性依据。3.调整保留时间tR′

扣除死时间后的保留时间。它反映了组分与固定相作用所消耗的时间，是各组分产生差速迁移的物化基础。2.保留时间tR574.死体积V0

指在t0这段时间内通过色谱柱的载气体积。即色谱柱内载气所占的体积。

V0=t0·Fc(

Fc，ml/min为流动相流速)5.保留体积VR

指从进样到出现某组分色谱峰最大值时所通过的载气体积。VR=tR·Fc4.死体积V0586.调整保留体积VR′

指扣除死体积后的保留体积。

VR′=VR-V0=tR′·

Fc7.

相对保留值r2，1

指在相同操作条件下，某组分2的调整保留值与另一组分1的调整保留值之比。即6.调整保留体积VR′59

相对保留值仅与柱温、固定相性质有关。可用来表示色谱柱的选择性。*r2，1↑，两组分越易实现分离。*r2，1=1时，两组分色谱峰重叠。相对保留值仅与柱温、固定相性质有608.保留指数I

在GC中，把组分的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为，也就是以正构烷烃系列作为组分相对保留值的标准，用两个保留时间紧邻待侧组分的基准物质来标定组分，这个相对值称为保留指数。8.保留指数I61㈢色谱峰高和峰面积1.峰高h

是组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。2.峰面积A

色谱曲线与基线间包围的面积。㈢色谱峰高和峰面积62㈣分离度（分辨率）R柱效能和选择性对分离的影响柱效选择性差差

差好

好好㈣分离度（分辨率）R柱效能和选择性对分离的影响柱效63

因此，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中的分离情况，需引入一个综合指标—分离度R分离度：相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰底宽度平均值之比。即因此，单独用柱效或选择性不能真实反64

理论证明，若相邻两色谱峰对称且满足正态分布，当R<1两峰部分重叠R=1.0分离程度可达98%

R=1.5分离程度可达99.7%通常，R=1.5作为相邻两峰完全分离的标志。理论证明，若相邻两色谱峰对称且满足65色谱从流出曲线中，可得到重要信息：⑴根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少数目；⑵根据色谱峰的保留值，可以定性分析；⑶根据色谱峰的面积和峰高，可以定量分析⑷色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；⑸色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。色谱从流出曲线中，可得到重要信息：66三、分配系数与色谱分离㈠分配系数和容量因子1.分配系数K

式中cs、cm分别为组分在固定相和流动相中的浓度。

K与温度、压力有关；也与组分性质、流动相、固定相性质有关。条件一定时，K一定。三、分配系数与色谱分离㈠分配系数和容量因子式672.容量因子k（分配比、保留因子）式中mS、mm分别为组分在固定相和流动相中物质的质量。容量因子不仅与温度和压力有关，而且还与固定相和流动相的体积比有关。2.容量因子k（分配比、保留因子）式中mS、m683.分配系数和容量因子的关系3.分配系数和容量因子的关系69㈡分配系数和容量因子与保留时间的关系意义：在色谱图上找出tR、t0，则可计算出k，即可以直接从色谱图上求得分配比（容量因子）k。反之，分配系数不同的组分具有不同的保留值，因而在色谱图上有不同位置的色谱峰。㈡分配系数和容量因子与保留时间的关系意义：在色谱图上70见P343见P34371㈢色谱分离的前提

由上式可见，若使ΔtR≠0,必须KA≠KB,即分配系数不等是分离的前提。㈢色谱分离的前提72第三节基本类型色谱方法及其分离机制一、分配色谱（见P345页）1.正相分配色谱：流动相极性＜固定相极性2.反相分配色谱：流动相极性＞固定相极性洗脱顺序由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。二、吸附色谱法第三节基本类型色谱方法及其分离机制一、分配色谱（见P3473第四节色谱法基本原理一、塔板理论（半经验理论）（P351）

该理论是1952年马丁（Martin）等人提出

从热力学角度讨论了流出曲线形状与分离效果关系。第四节色谱法基本原理一、塔板理论（半经验理论）（P35174

塔板理论将色谱柱假想为一个精馏塔。即色谱柱（柱长L）是由一系列连续的、相等的水平塔板组成，每一块塔板高度为H，在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随流动相按一个一个塔板的方向向前移动。塔板理论将色谱柱假想为一个精馏塔。75塔板理论的基本假设为：1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。2）样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积4）在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。

塔板理论的基本假设为：76

虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。

77n与色谱参数之间的关系（经验公式）为：

由此可以看出，组分保留时间越长、峰宽度越小，则n越多，色谱柱效能越高。n与色谱参数之间的关系（经验公式）为：由此可以看出，78塔板理论贡献：①分配系数不同，最终可分离。②平衡次数n（>50），曲线接近正态分布曲线。③给出了n与Wb的关系式（由此关系式可得出流出曲线与分离效果关系）n，柱效。若两组分K相同，则无论n多大，都无法分离。塔板理论贡献：①分配系数不同，最终可分离。79塔板理论不足：①无法解释峰扩展原因。（为使n↑，则Wb应↓，如何使Wb↓

？）②无法解释影响塔板高度的因素（L一定，n∝1/H,如何使H↓？）

塔板理论不足：①无法解释峰扩展原因。80二、速率理论1956年荷兰学者VanDeemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论--速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。二、速率理论1