细胞染色专题之一：台盼蓝

细胞染色专题之一：台盼蓝台盼蓝（TrypanBlue,也称Directblue14）：一种死细胞染色用色素化学名：3,3'-{[3,3'-Dimethyl（1,1'-biphenyl）-4,4'-diyl]bis（azo）}bis（5-amino-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfonicacid）,tetrasodiumsalt3,3’-{[3,3’-二甲基-（1,1’-二苯基）-4,4’-二基]双（偶氮）}-双（5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸），四钠盐分子式：C34H24N6Na4O14S4分子量：960.81CASNumber:72-57-1外观：黑褐色结晶粉末摩尔吸光度：＞69,000（在606nm附近）染色原理：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。这被称为染料排除测试（dyeexclusion），ErythrosinB（红色）、negrosine、eosinY、AO和EB也用于此目的。通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。溶于水，可以配制成10mg/ml的水溶液，水溶液呈深蓝色。台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时，细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可。应用于细胞凋亡：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。尽管在凋亡的早期到中期检测是很困难的，此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。储存条件：常温保存注意事项：台盼蓝对人体有毒台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。台盼蓝染色法对于悬浮细胞来说，还比较方便，对贴壁细胞来说，较为繁琐。因为要消化，有时，96孔板不一定能消化干净。而且，该法是测定细胞浓度的方法，与细胞悬液的体积有关，加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说，该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰。细胞染色专题之二：美蓝美蓝英文名：Methyleneblue，Swissblue中文名：亚甲基蓝、次甲基蓝、品蓝、美蓝、亚甲蓝、四甲基蓝、盐基湖蓝、碱性亚甲天蓝等。分子式：C16H18ClN3S分子量：319.85g/molCASNumber:61-73-4EINECSNumber:200-515-2熔点：100°C沸点：分解吸收峰：668nm和609nm。染色原理：美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。细胞染色专题之三：吖啶橙吖啶橙：N,N,N',N'-tetramethylacridine-3,6-diamine中文名：3,6-双（二甲基氨基）吖啶英文名:AcridineOrange（AO），Euchrysine，3,6-Acridinediamine，WaxolineOrangeA，AcridineOrangeBase，SolventOrange15，RhodulineOrange，RhodulineOrangeN，AcridineOrangeNO，RhodulineOrangeNO，BasicOrange分子式：C17H19N3分子量：265.35g/molCASnumber:10127-02-3外观：橙色、红棕色粉末染色原理：吖啶橙（AO）与双链DNA形成发绿色荧光的复合物。AO还可与单链DAN或RNA形成发红色荧光的复合物。一个AO分子嵌入双链DNA的三个碱基对并发出最大波长为526nm（激发502nm）的绿色荧光。一个AO分子与单链DNA或RNA的一个磷酸基相互作用形成聚集或堆叠的结构，此结构发出最大波长为650nm（激发460nm）的红色荧光。因此，AO用于被利用来检测双链DNA和单链DNA或RNA。它使得用氩激光激发器或流式细胞仪同时测定DNA和RNA成为可能。光谱数据：与DNA作用时和荧光素相似，激发最大波长502nm，发射最大525nm（绿光）。于RNA作用时，激发最大波长移动到460nm（蓝光），发射最大移动到650nm（红光）。染色程序：用PBS或合适缓冲液制备10-50UMAO溶液。a）将1/10细胞培养基体积的AO溶液加入细胞培养基中。b）37C下孵育细胞10-20分钟。用PBS或合适缓冲液洗涤细胞2次。用带有500nm激发和530nm发射滤光片的荧光显微镜观察细胞。由于AO可能具有致癌性，因此操作过程中须格外小心。可以用1/10浓度的AO缓冲液代替培养基。储存条件：避光，冷藏保存细胞染色专题之四：碘化丙啶碘化丙啶英文名：Propidiumiodide,Propidiumdiiodide;PI分子式：C27H34I2N4分子量：668.39外观：红棕色粉末应用：DNA染色染色原理：碘化丙啶(PI)是一种漠化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光化合物一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。光谱性质：PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。染色过程：用PBS或适当的缓冲液制备10〜50UM的PI溶液。a)将1/10培养基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。b)在37°C培养细胞10-20分钟。用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。用535nm激发波长，615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。由于PI可能具有致癌性，请小心操作。也可以用1/10浓度的PI缓冲液代替培养基。保存条件：4C避光保存对人体有刺激性，请注意适当防护细胞染色专题之五：罗丹明123罗丹明123：Rhodamine123分子式：C21H17C1N2O3分子量：381外观：橙红色、红棕色固体/粉末溶解性：可溶于DMSOCASNumber：62669-70-9染色原理：Rh123是一种细胞通透性的、阳离子的荧光探针，容易被有活性的线粒体摄取，没有细胞毒性。Rh123透过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集，发出黄绿色荧光，可用于对许多种细胞进行染色，包括植物细胞和细菌。由于细胞内ATP的量与Rh123的荧光强度之间有相关性，此化合物被应用于检测细胞内的ATP。Rh123还用于癌症研究。光谱性质：lex\lem(MeOH)=505nm\534nm.e(505nm,MeOH)=97,000.染色步骤：将0.4mgRh123溶解到1mlDMSO中制备成1mMRh123-DMSO溶液。用载玻片准备细胞。细胞数目应为5X10e4-5X10e5个/ml。孵育该载玻片，用PBS或Hank’s液洗涤细胞。用培养基稀释1mMRh123溶液以制备1-20uMRh123缓冲液。将Rh123缓冲液a)加入载玻片并在37°C下孵育30分钟至1小时。去除Rh123缓冲液并用培养基洗涤细胞。b)用带有荧光素滤光片的荧光显微镜观察细胞。加入细胞前将Rh123缓冲液放在37C下孵育。洗涤细胞后为了固定，加入10%福尔马林缓冲液并孵育15-20分钟，接着用PBS洗涤。储存条件：避光冷藏保存细胞染色专题之六：漠乙锭漠乙锭：Ethidiumbromide化学名：漠化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基啡啶英文名：2,7—DiaminoT0—ethyl—6—phenylphenanthridiniumbromide，DiaminoT0—ethyl—9—phenylphenanthridiniumbromide，DiaminoT-ethyl-6-phenylphenantridiniumbromide，Diamino—5—ethyl—6—phenylphenanthridiniumbromide，Homidiumbromide，EB，EtBr别名：胡漠胺;漠乙胺菲啶;漠乙菲啶分子式：C21H20BrN3分子量：394.31g/molCASnumber:1239-45-8熔点：260-262C(fromwiki)性质：从酒精中结晶的是具苦味的深红晶体，熔点238〜240°C；20°C时溶于20份水和750份氯仿。染色原理：EB不能穿过活细胞的细胞膜，然而可以通过死细胞破损的细胞膜而对细胞核DNA染色。EB含有一个可以嵌入的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，由于EB-DNA复合物的荧光产率远大于未结合染料的荧光产率，所以当电泳凝胶中含有游离EB时，也可检测出少量DNA。它是一种高灵敏的荧光试剂，也是一种重要的荧光染料，常用于检测DNA和RNA。EB与DNA结合后抑制DNA的复制和转录。光谱性质：EB-DNA复合物的激发波长和发射波长分别为518nm和605nm。染色过程：用PBS或合适的缓冲液制备10-50UMEB溶液。a)将1/10培养基体积的EB溶液加入细胞培养基中。b)37C下孵育细胞10-20分钟。用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。用带有515nm激发波长和600nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。由于EB可能有致癌性，操作时须十分小心。可以用1/10浓度的EB缓冲液代替培养基。储存条件：避光，冷冻保存细胞染色专题之七：曙红Y曙红：EosinY中文名：水溶伊红；四漠荧光黄；朝红；四漠荧光素钠；曙红钠盐；曙红，水溶性；黄光曙红英文名：EosineYellowish，Bromoeosine，TetrabromofluoresceinC.I.name：Acidred87分子式：C20H6O5Br4Na2分子量：691.9，性质：以AgNO3滴定Br-，I-，SCN-等时用作吸附指示剂。CASNumber:17372-87-1MDLnumber：MFCD00005040ColourIndexNumber:45380光谱性质：最大吸收524.8nm；最大激发490nm染色原理：EosinY为酸性染料，将胞质染成粉红色（嗜酸性），是组织和细胞化学常用染色试剂之一，常与苏木精（hematoxylin，为碱性染料，将核染成紫蓝色（嗜碱性））联合使用（HE染色法）。在免疫组织化学实验中，常作为衬染试剂以便于组织和细胞结构的观察。存储条件：室温避光保存细胞染色专题之八：苏木精苏木精Hematoxylin中文名：苏木色精，苏木色素，苏木精，苏木素，洋苏木素英文名：Hematoxyli7,11b-Dihydrobenzindeno[1,2-d]pyran-3,4,6a,9,10（6H）-pentol，NaturalBlack分子式：C16H14O6分子量：302.28性质：无色棱形晶体，遇光变红；熔点100-120°C；难溶于冷水和乙醚，易溶于热水和热乙醇，溶于碱、氨和硼砂的溶液。含有3分子结晶水，在100〜120°C溶于本身的结晶水中。在水溶液中，特别是在碱溶液中易被空气氧化成红棕色的氧化苏木精。C.I.name：NaturalblackC.I.number:75290CASnumber:517-28-2EINECSnumber:208-237-3BeilsteinRegistryNumber:91400EG/ECNumber：2082373MDLnumber：MFCD00078111染色原理：苏木精是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸一酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。用途：一种天然媒介染料。用于蚕丝、毛皮和皮革的染色以及棉布的印花，用不同的媒染剂可得到蓝色或黑色。与重铭盐、铁盐、亚铁盐、铝盐和锡盐等一起可制成各种色淀。在分析化学中用于比色分析、显微镜分析，并用作pH值指示剂，变色范围5.0〜6.0,由黄色变紫色。作为天然色素，多用于食品工业、日化工业、皮革及织物染色等，病理实验中可作为细胞组织切片的染色剂.苏木水提物最早被发现有抗癌作用，随后的研究证明了其抗癌活性物质就是苏木精细胞染色专题之九：孔雀绿孔雀绿(MalachiteGreen)中文名：孔雀绿，孔雀石绿，碱性绿，盐基品绿英文名：Malachitegreen，anilinegreen,basicgreen4,diamondgreenB,victoriagreenB，4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methyl]-N,N-dimethyl-aniline)分子式：C23H25ClN2(chloride)分子量：364.911g/mol(chloride)性质：孔雀绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀菌剂，可致癌。孔雀石绿一般有二种。第一种是天然的矿石，为水合碱式碳酸铜[Cu(OH)2CO3或2CUOCO2H2O]，呈翠绿或草绿色的块石，含71.9%CuO、19.9%CO2、比重3.9-4.03、能溶于酸类。主要用于铜的提炼和供作颜料，但并不用于水产养殖业。第二种是孑L雀石绿染料(MalachiteGreenDyestuff)，又有AnillneGreen、ChinaGreen、VictorlaGreen等多个名称，是人工合成的有机化合物。它的生产是由1分子(mol)的苯甲醛Benzaldehyde和2分子的二甲苯胺Dimethylaniline在浓盐酸混和下，加热缩合成隐色素碱Leucobase，在酸性下加过氧化铅使其氧化，并在(酸？碱？)性液中沉淀出色素碱，它是属于三苯基甲烷型的绿色染料TryphenylMethaneDyestuffs。绿色闪光结晶，溶于水、酒精显蓝绿色；遇硫酸呈黄色，稀释后呈暗橙色；水溶液加氢氧化钠形成微带绿光的白色沉淀。PH值在0.13〜2.0变色为黄〜浅蓝〜绿，PH值在11.5〜13.2变色为蓝绿〜无色。CASnumber:569-64-2光谱性质：最大吸收616.5nm染色原理：孔雀石绿可用作生物染色剂，把细胞或细胞组织染成蓝绿色，方便在显微镜下研究。孔雀石绿也用作丝绸、皮革和纸张的染料。虽然称作孔雀石绿，但其实它不含有孔雀石的成份，只是两者颜色相似而已。用于芽孢染色的步骤：取一干净载片按无菌法取巨大芽孢杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加法7.6%的孔雀绿饱和水溶液，染色10分钟后，用水冲洗，再用0.5%蕃红花红液染色彩1分钟，水洗，风干后镜检。芽孢被染成绿色，营养体呈红色。细胞染色专题之十：DAPIDAPI中文名：4,6-联脒-2-苯基吲噪⑵英文名：4',6-diamidino-2-phenylindole，2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine，DAPIdihydrochloride分子式：C16H15N5分子量：277.324CASnumber:28718-90-3光谱性质：与双链DNA结合时最大吸收/最大发射为358nm/461nm；与RNA结合时，最大发射移动到400nm左右。染色原理：DAPI为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100%)，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。a、正常的烟草细胞核：核形完整，染色质均匀。b、染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。c、染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质。d、细胞核破裂形成碎片，核解体。染色步骤：在细胞移植前，将DAPI以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS缓冲液漂洗至少6次以洗掉未结合的DAPI，在用酶消化后离心收集细胞，加入DMEM培养基制成细胞悬液以备用。存储条件：-20°C避光保存(?4°C?)注意事项：1、DAPI强烈致癌，操作时要戴上手套。2、贮存液用70%酒精配制，浓度100Pg/ml,可用黑纸包住，长期冻存。使用液按1:1000用PBS稀释，最终浓度100ng/ml。3、DAPI是非常优秀的DNA染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。细胞染色专题之十一：结晶紫结晶紫（crystalviolet）中文名：（结）晶紫，氯化甲基玫瑰苯胺，结晶紫，龙胆紫，甲基青莲，碱性紫，甲紫，其溶液俗称“紫药水”英文名：crystalviolet，Methylviolet2B，Methylviolet，methylrosanilinechloride，GentianViolet，BasicViolet，分子式：C24H28N3Cl分子量