第十一章免疫学应用课件

第十二章免疫学的应用免疫学检测免疫预防免疫治疗第十二章免疫学的应用免疫学检测1第一节免疫学检测免疫学检测是以特异性抗原-抗体反应为基础的检测方法。具有很高的灵敏度和能快速提供检测结果等优点。第一节免疫学检测免疫学检测是以特异性抗原-抗体反应为基础的检2基本概念抗原（antigen）：指能在机体中引起特异性免疫应答反应，同时又能与免疫应答物（如抗体）产生特异性结合的物质。抗体（antibody)：是机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白。抗原决定簇：是指抗原表面决定抗原特异性的某些特定化学结构，抗原以此与相应抗体结合

基本概念3第十一章免疫学应用课件4药物分子的抗原性蛋白、多肽、激素类药物具有免疫原性及抗原特异性。小分子药物无免疫原性，但具抗原特异性，称为为半抗原。

药物分子的抗原性5

抗原抗体反应的特点特异性抗原抗体反应的可见性适当的比例和浓度可逆性抗原抗体反应的特点6应用1、利用已知抗原检测未知抗体（1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病：伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。（2）检测自身抗体——诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等2、利用已知抗体检测未知抗原（1）鉴定病原菌：诊断疾病（2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌（3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定（4）检测药物半抗原：确认运动员是否服用兴奋剂应用1、利用已知抗原检测未知抗体（1）检测病原微生物7抗原或抗体的检测方法

凝集反应沉淀反应免疫标记技术抗原或抗体的检测方法凝集反应8

（一）凝集反应（agglutination）

颗粒性抗原（红细胞、细菌等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。1、直接凝集(directagglutination)

玻片凝集、试管凝集细菌的鉴定和血型的检查一、传统免疫分析（一）凝集反应（agglutination）颗92、间接凝集（indirectagglutination）

可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应抗体混合出现的凝集现象。检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体2、间接凝集（indirectagglutination）10（二）沉淀反应（precipitation）

可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合，形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。

免疫比浊法（二）沉淀反应（precipitation）111、单向免疫扩散（singleimmunodiffusion）：可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的扩散，为一种半定量试验。

环的直径与抗原含量成正相关1、单向免疫扩散（singleimmunodiffusio122、双向免疫扩散（douleimmunodiffusion）：抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法。常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。一致部分一致不一致，有多种成分2、双向免疫扩散（douleimmunodiffusion133、免疫电泳（immunoelectrophoresis）常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。

1）简易免疫电泳先将抗原样品在琼脂中进行电泳分离，可将蛋白质抗原分子分成不同的区带，然后将抗血清加入琼脂板横槽中，使二者进行双向扩散，当比例合适时即形成特异性的沉淀线，

3、免疫电泳（immunoelectrophoresis）常142）对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis,CIEP)是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术2）对流免疫电泳(counterimmunoelectro153）火箭免疫电泳(rocketimmunoelectrophoresis)，抗原在电场下通过含有一定量抗体的琼脂凝胶，并于抗体发生反应，形成沉淀带。可定量分析。3）火箭免疫电泳(rocketimmunoelectro16

用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶免疫荧光检测法（IFA）放射免疫检测法（RIA）酶免疫检测法（EIA）

二、现代免疫分析-免疫标记技术用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提171．抗体制备。多克隆抗体单克隆抗体，2．标记物与标记方法。放射性同位素、酶、荧光分子、化学和生物发光系统。免疫分析基本环节1．抗体制备。免疫分析基本环节183．分析方式设计：

非竞争方式、竞争方式；

直接法、间接法；

标记抗原、标记抗体；

均相、非均相

4.信号检测。

与相应的标记物对应。主要为分光光度法、

荧光光度法、化学发光检测法。

3．分析方式设计：

非竞争方式、竞争方式；

直接法、间接法；19（一）、放射免疫分析(RadioimmunoassayRIA)

利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术。特点：

灵敏度高、特异性强、样品用量少、标记物容易制备以及放射性强度容易检测（一）、放射免疫分析(Radioi201.放射免疫分析必需的基本试剂：抗体：作为标记药物和非标记药物竞争结合的蛋白。标记药物：提供可检测的信号(响应值)（放射性、光吸收、荧光发射）。非标记药物：在标准曲线制备时是药物标准品，(在样品中则为被测药物)分离剂——分离结合与游离部分1.放射免疫分析必需的基本试剂：21结合相游离相2.基本原理：RIA是标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合。结合相游离相2.基本原理：RIA是标记抗原和未标记抗原对有限22标记药物(S*)+抗体(Ab)[标记药物-抗体]复合物(S*-Ab)F*P-B*

B*F*、B*分别是游离的和与抗体结合的标记药物浓度，它们可通过产生的信号(如放射性、光吸收、荧光发射)强度反映出来(用仪器检测)。第十一章免疫学应用课件23

非标记药物（S）

F +标记药物(S*)+抗体(Ab)[标记药物-抗体]复合物(S*-Ab)F*P-B-B* B*

[非标记药物-抗体复合物](S-Ab) B随着S的加入，它对S*同Ab的结合则起竞争抑制作用，表现为使B*减少、使F*增加，并且只要S加入一定量，便有对应的F*和B*信号强度值，因此可建立S量(浓度)与响应值(F*和B*的信号强度)之间的函数关系，作成剂量反应曲线。 非标记药物（S）24免疫分析中各种竞争结合抑制曲线示意图免疫分析中各种竞争结合抑制曲线示意图25第十一章免疫学应用课件263.标准曲线的绘制与样品测定步骤取标准抗原，用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5－8个系列浓度。加入定量标记抗原，其总放射性(T)应能满足准确测量的需要。加入定量的已稀释好的特异抗体，其抗体的量应满足灵敏度的要求。将标准抗原、标记抗原、特异抗体与缓冲液混匀后，在适当条件下温育，待反应平衡后测定总计数率(T)。3.标准曲线的绘制与样品测定步骤取标准抗原，用无放射活性的空27加入分离剂，使结合部分(B)与游离部分(F)分离。测定各管结合部分或游离部分的计数率。标准曲线通常以标准抗原(待测药物标准品)的浓度为横坐标，以结合率(B％)为纵坐标作图。纵坐标B％的计算：将与抗体结合的标记药物的放射性强度(B)与加入的标记药物总放射性强度(T)比较，即B％=(B／T)×100％；加入分离剂，使结合部分(B)与游离部分(F)分离。28第十一章免疫学应用课件29例：125I－RIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度

待测血清样品50μl→样品管中;含不同浓度地高辛标准品的血清50μl→标准曲线各管中;50μl空白人血清→零标准管.各管中依次加入保温液100μl→抗体溶液100μl→125I标记的地高辛(溶液)100μl摇匀→在室温(15～25℃)放置30min→γ-计数器测定各管的总计数T(即加人的协I总放射性剂量)→在电磁搅拌(或手摇)下，迅速向各管内加人1ml工作液(全部加完控制在5min内)，摇匀→离心10min(3000r/min)→倾去上清液→γ-计数器测定各管中沉淀的计数F(游离协I地高辛放射性强度)→计算出标准曲线各管和样品各管的结合率。例：125I－RIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度30

（二）酶免疫分析（enzymeimmunoassay）

标记物为酶，酶本身并不能直接产生信号，必须要有其他试剂如底物、辅酶等的参与才能完成酶反应，从而引起吸收光谱等的变化供测定。

常用的酶为：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、β-半乳糖苷酶。

（二）酶免疫分析（enzymeimmunoassay）31酶底物显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲321.均相酶免疫分析，EMIT法（enzymemultipledimmunoassaytechnique）

基本原理：酶标药物与未标记药物互相竞争有限量的抗体(Ab)，测定小分子抗原。酶标抗原(AgE)同抗体(Ab)结合后，所形成的酶标抗原一抗体结合物(AgE—Ab)可使酶的活性发生改变(增强或减弱)；可直接通过测定酶活性的变化，求出样品含量的方法。1.均相酶免疫分析，EMIT法（enzymemultip33第十一章免疫学应用课件342.酶联吸附免疫分析（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）属于非均相免疫分析的代表，普遍应用于各领域。基本原理：是将过量抗体（抗原）包被于载体上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。2.酶联吸附免疫分析（enzyme-linkedimmun353种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）3种必要的试剂：36第十一章免疫学应用课件371）双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检样品，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定如乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等1）双抗体夹心法38第十一章免疫学应用课件39获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相洗涤除去未结合的加402）间接法方法：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相上抗原结合的受检抗体应用：常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定2）间接法41第十一章免疫学应用课件42包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体123）竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）包被反应123）竞争法

方法：用已知抗体包被，加入43第十一章免疫学应用课件44ELISA试剂盒ELISA试剂盒45第十一章免疫学应用课件46（三）胶体金免疫快速检测法1.双抗体夹心法-大分子抗原（三）胶体金免疫快速检测法1.双抗体夹心法-大分子抗原47第十一章免疫学应用课件48第十一章免疫学应用课件49样本加到S区，进入B区和B区的金标抗体发生免疫反应，再层析到T线位置时，如果样本中含有待测抗原，则T线不显色或显色很淡，C线显色，这样得到的是阳性结果。当待测样本中不含抗原时，再层析到T线位置时，则T线显色，C线也显色，得到阴性结果

SBTCD2.竞争抑制法样本加到S区，进入B区和B区的金标抗体发生免疫反应，再层析到50

能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒的抗体或抗原，如抗HIV抗体的检测。（四）免疫印迹法

51第十一章免疫学应用课件52第二节免疫预防

特异性免疫获得的方式：自然免疫：主要指机体感染病原体后建立的特异性免疫，也包括胎儿和新生儿经胎盘或乳汁从母体获得的抗体。人工免疫：人为的使机体获得特异性免疫，即免疫预防。第二节免疫预防

特异性免疫获得的方式：53免疫预防(immunoprophylaxis)：根据特异性免疫原理，采用人工方法将抗原(疫苗、类毒素等)或抗体(免疫血清、丙种球蛋白等)制成各种制剂，接种于人体，使其获得特异性免疫能力，达到预防某些疾病。人工主动免疫人工被动免疫免疫预防(immunoprophylaxis)：根据特异性免54一、人工主动免疫（artificialactiveimmunization）：用疫苗接种机体，使之产生特异性免疫，从而预防感染的措施。一、人工主动免疫（artificialactiveimm55（一）传统疫苗1.死疫苗：用物理或化学方法将病原微生物灭活而制成的制剂。又称灭活疫苗。2.活疫苗

用人工变异或直接从自然界筛选出来的毒力高度减弱、或由基本无毒的活病原微生物制成的制剂。又称减毒活疫苗。3.类毒素：

将细菌毒素用甲醛减毒后制备的具有免疫原性的物质。（一）传统疫苗56活疫苗与死疫苗的比较特点制剂特点接种剂量及次数恢复倾向无毒或减毒的活微生物量较小，一般仅需要一次相对稳定性不稳定可以回复为毒株强毒死微生物量较大，需要多次接种较稳定不回复为毒株免疫效果较好，维持3-5年甚至更长较差，维持半年至一年活疫苗死疫苗诱导的免疫类型体液免疫和细胞免疫体液免疫为主活疫苗与死疫苗的比较特点制剂特点接种剂量及次数恢复倾向无毒57（二）新型疫苗

1.亚单位疫苗：去除病原体中与激发保护性免疫无关的甚至有害的成分，保留有效免疫原成分制作的疫苗。

2.合成疫苗：根据有效免疫原性肽段的氨基酸序列合成的免疫原性多肽。

3.重组抗原疫苗：利用DNA重组技术制备的只含保护性抗原的纯化疫苗。

4.DNA疫苗：用编码病原体有效免疫原基因的重组体直接接种，体内可表达保护性抗原，从而诱导机体产生特异性免疫。（二）新型疫苗58第十一章免疫学应用课件59二、人工被动免疫（artificialpassiveimmunization）：给人注射含特异性抗体的免疫血清以治疗或紧急预防感染的措施。

1、抗毒素：用细菌外毒素或类毒素免疫动物制备的血清，具有中和外毒素的作用。2、人免疫球蛋白制剂来源:①恢复期病人供血者血浆，②接种疫苗/类毒素的免疫者血浆。二、人工被动免疫（artificialpassiveim60第十一章免疫学应用课件61计划免疫：根据某些特定传染病的疫情监测和人群免疫状况分析，按照规定的免疫程序有计划的进行人群预防接种。计划免疫：根据某些特定传染病的疫情监测和人群免疫状况分析，按62第十一章免疫学应用课件63第三节免疫治疗

免疫治疗（immunotherapy）：利用免疫学原理，针对疾病的发生机制，人为的调整免疫功能，达到治疗目的所采取的措施。免疫调节：即用物理、化学或生物学手段调节机体免疫功能。（免疫增强与免疫抑制）免疫重建：将正常个体的造血干细胞或淋巴细胞转移给免疫缺陷个体，以恢复其免疫功能。第三节免疫治疗

免疫治疗（immunotherapy64一、抗原为基础的免疫治疗1.治疗性疫苗：指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱生特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化目的的产品。1890年，Koch用注射结核菌素和甘油悬液的方法来治疗结核病，开创了用疫苗治疗疾病的先例。1902年，Wright等就采用加热灭活的葡萄球菌治疗葡萄球菌性皮肤病。目前研究热点：针对肿瘤、HIV、乙肝、自身免疫疾病的治疗性疫苗。一、抗原为基础的免疫治疗1.治疗性疫苗：指在已感染病原微生物65肿瘤疫苗是用肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物或肿瘤抗原激活机体免疫系统产生特异性抗肿瘤细胞免疫效应。2010年4月29日，FDA批准了首个癌症治疗疫苗Provenge用于晚期前列腺癌的治疗。肿瘤疫苗肿瘤疫苗是用肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物或肿瘤抗原激活机体免疫系66肿瘤疫苗1.肿瘤细胞疫苗2.多肽疫苗3.表达肿瘤抗原的重组病毒和DNA疫苗:4.APC为基础的肿瘤疫苗或称为APC疫苗肿瘤疫苗1.肿瘤细胞疫苗671)肿瘤细胞疫苗传统的肿瘤细胞疫苗是通过照射灭活自体或同种异体肿瘤细胞或其粗提取物,抑制其增殖能力,保留其免疫原性.免疫原性弱,难以引起免疫反应。与免疫佐剂如弗氏完全佐剂、卡介苗和短小棒状杆菌属等混合以增强其免疫原性.1)肿瘤细胞疫苗68肿瘤基因工程疫苗:通过基因重组技术,将不同目的的基因如细胞因子、辅助刺激分子、MHC-I分子等导入肿瘤细胞而制备的疫苗。69TUMORCELLMHC-1

MHC-II()B7蛋白酶体(低分子多肽LMP)转运蛋白(TAP)基因转染CMV表达MHC-I等的DNA表达CTLMHC-IMHC和B7等分子转基因的肿瘤疫苗

TUMORCELLMHC-1基因转染CMV表达MHC70TUMORCELL基因转染CMV表达细胞因子的DNA(IL-2,IL-4,INF-)表达lymphokin趋化淋巴细胞趋化因子细胞因子基因转染的肿瘤疫苗TUMORCELL基因转染CMV表达细胞因子的DNA(I712）多肽疫苗主要包括肿瘤特异性抗原、病毒相关抗原、癌基因或抑癌基因突变蛋白的多肽组成的疫苗。2）多肽疫苗主要包括肿瘤特异性抗原、病毒相关抗原、癌基因723）DNA疫苗Plasmidvaccine由能引起保护性免疫反应的肿瘤抗原基因片段及其载体建构而成的。将编码细胞因子、细菌毒素、蛋白佐剂的DNA与携带抗原基因的质粒DNA融合更有效。3）DNA疫苗Plasmid由能引起保护性免疫反应的肿瘤抗734）树突状细胞疫苗

（1)细胞性肿瘤抗原修饰的DC用肿瘤细胞裂解物冲击致敏DC制备DC疫苗（2)肿瘤抗原基因转染的DC疫苗通过转基因的方法将编码肿瘤抗原基因转染给DC,使其表达肿瘤抗原并对其加工,然后加佐剂回输到机体中诱导特异性抗肿瘤效应。（3)通过细胞融合制备DC疫苗

采用自体肿瘤细胞与DC进行融合制备杂交瘤。4）树突状细胞疫苗

（1)细胞性肿瘤抗原修饰的DC74第十一章免疫学应用课件752.抗原诱导耐受：

口服耐受：是通过消化系统摄入外源性抗原诱导外周免疫系统产生抗原特异性无反应状态,但机体对其他抗原仍可产生正常的免疫性应答。口服耐受治疗已进入临床实验阶段：类风湿关节炎—鸡II型胶原蛋白多发性硬化症—牛磷脂治疗葡萄膜炎—牛视网膜S2.抗原诱导耐受：76（一）多克隆抗体------免疫血清1、抗毒素血清：用于治疗和紧急预防外毒素所致的疾病，如白喉抗毒素、破伤风抗毒素。2、胎盘（丙种）球蛋白：用于被动预防传染病、治疗丙种球蛋白缺乏症。3、抗病毒免疫血清：预防病毒感染二、抗体为基础的免疫治疗（一）多克隆抗体------免疫血清1、抗毒素血清：用于治疗77（二）单克隆抗体（mAb）1、抗细胞表面分子的单克隆抗体：抗CD3、CD4、CD25单抗可用于治疗急性移植排斥反应；抗CD20的抗体治疗淋巴瘤2、抗细胞因子的单克隆抗体：抗IL-1、抗TNF单抗可减轻炎症反应，用于治疗类风湿性关节炎等慢性炎症性疾病。3、抗体导向药物治疗（靶向治疗）：用特异性单抗作为载体装载化学药物、毒素、同位素等细胞毒性物质，将其靶向性地携至肿瘤病灶局部，可特异性地杀伤肿瘤，减少副作用。（二）单克隆抗体（mAb）1、抗细胞表面分子的单克隆抗体：抗78第十一章免疫学应用课件79三、细胞因子及其拮抗剂为基础的免疫治疗1、细胞因子补充和添加疗法：重组的细胞因子作为免疫应答调变剂治疗肿瘤、感染、造血障碍等。如干扰素、IL-2、TNF、CSF、EPO等2、细胞因子阻断和拮抗疗法：治疗自身免疫性疾病、移植排斥、感染性休克等。如TNF单抗、HER-2单抗、IL-1R拮抗剂等。三、细胞因子及其拮抗剂为基础的免疫治疗1、细胞因子补充和添加80第十一章免疫学应用课件81细胞因子阻断和拮抗疗法细胞因子阻断和拮抗疗法82四、细胞为基础的免疫治疗细胞疫苗（肿瘤疫苗，树突装细胞疫苗）造血干细胞移植（白血病，免疫缺陷症）

免疫重建：将免疫功能正常个体的造血干细胞或淋巴干细胞，移植给免疫缺陷个体，使后者的造血能力、免疫功能全部或部分得到恢复。免疫效应细胞（细胞免疫缺陷症，抗肿瘤）四、细胞为基础的免疫治疗细胞疫苗（肿瘤疫苗，树突装细胞疫苗）83免疫效应细胞过继免疫细胞：取自体淋巴细胞体外激活、增殖后回输患者。LAK（lymphokineactivatedkillercells）细胞——淋巴因子活化的杀伤细胞。是将外周血淋巴细胞（主要为NK细胞和T淋巴细胞）在体外经过IL-2培养后诱导产生的一种新型的杀伤细胞，具有更强的杀瘤特性。TIL(tumorinfiltratinglymphocytes)细胞——肿瘤浸润淋巴细胞。是从实体瘤组织中分离得到的，经体外IL-2培养后获得比LAK细胞更强的杀伤活性。（50－100倍）免疫效应细胞过继免疫细胞：取自体淋巴细胞体外激活、增殖后回输84五、免疫增强剂和免疫抑制剂免疫增强剂：免疫因子：转移因子：增强免疫力；免疫核糖核酸：增强体液及细胞免疫；胸腺肽：增强免疫力；化学合成药物：左旋咪唑；西咪替丁

五、免疫增强剂和免疫抑制剂免疫增强剂：85左旋咪唑：刺激吞噬细胞的吞噬功能；促进T细胞产生IL2等细胞因子，增强NK细胞的活性等。西咪替丁：组胺拮抗剂，可与组胺2受体结合，竞争性地抑制组胺的作用，可以阻止组胺对Ts细胞的活化作用，从而增强机体的兔疫功能。左旋咪唑：刺激吞噬细胞的吞噬功能；促进T细胞产生IL2等细胞86微生物制剂卡介苗短小棒状杆菌中药制剂香菇、灵芝等的真菌多糖成分药用植物及其有效成分

微生物制剂87

卡介苗：很强的非特异免疫刺激作用。卡介苗可活化巨噬细胞；促进IL1、IL2、1L4、TNF等多种细胞因子的产生；增强NK细胞和K细胞的活性。有效成分是其细胞壁胞壁酰二肽。短小棒状杆菌：活化巨噬细胞，促进IL1、IL2等细胞因子的产生。卡介苗：很强的非特异免疫刺激作用。卡介苗可活化巨噬细胞；88

（二）免疫抑制剂

化学制剂

1、烷化剂：环磷酰胺

2、抗代谢药：硫唑嘌呤。

激素：肾上腺皮质激素，抗炎。真菌代谢产物

1、环孢素A:抑制Th

2、FK-506(他克莫司)：大环内脂类药物,抑制IL-2。中药及其有效成分雷公藤多甙（二）免疫抑制剂化学制剂89第十二章免疫学的应用免疫学检测免疫预防免疫治疗第十二章免疫学的应用免疫学检测90第一节免疫学检测免疫学检测是以特异性抗原-抗体反应为基础的检测方法。具有很高的灵敏度和能快速提供检测结果等优点。第一节免疫学检测免疫学检测是以特异性抗原-抗体反应为基础的检91基本概念抗原（antigen）：指能在机体中引起特异性免疫应答反应，同时又能与免疫应答物（如抗体）产生特异性结合的物质。抗体（antibody)：是机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白。抗原决定簇：是指抗原表面决定抗原特异性的某些特定化学结构，抗原以此与相应抗体结合

基本概念92第十一章免疫学应用课件93药物分子的抗原性蛋白、多肽、激素类药物具有免疫原性及抗原特异性。小分子药物无免疫原性，但具抗原特异性，称为为半抗原。

药物分子的抗原性94

抗原抗体反应的特点特异性抗原抗体反应的可见性适当的比例和浓度可逆性抗原抗体反应的特点95应用1、利用已知抗原检测未知抗体（1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病：伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。（2）检测自身抗体——诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等2、利用已知抗体检测未知抗原（1）鉴定病原菌：诊断疾病（2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌（3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定（4）检测药物半抗原：确认运动员是否服用兴奋剂应用1、利用已知抗原检测未知抗体（1）检测病原微生物96抗原或抗体的检测方法

凝集反应沉淀反应免疫标记技术抗原或抗体的检测方法凝集反应97

（一）凝集反应（agglutination）

颗粒性抗原（红细胞、细菌等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。1、直接凝集(directagglutination)

玻片凝集、试管凝集细菌的鉴定和血型的检查一、传统免疫分析（一）凝集反应（agglutination）颗982、间接凝集（indirectagglutination）

可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应抗体混合出现的凝集现象。检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体2、间接凝集（indirectagglutination）99（二）沉淀反应（precipitation）

可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合，形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。

免疫比浊法（二）沉淀反应（precipitation）1001、单向免疫扩散（singleimmunodiffusion）：可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的扩散，为一种半定量试验。

环的直径与抗原含量成正相关1、单向免疫扩散（singleimmunodiffusio1012、双向免疫扩散（douleimmunodiffusion）：抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法。常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。一致部分一致不一致，有多种成分2、双向免疫扩散（douleimmunodiffusion1023、免疫电泳（immunoelectrophoresis）常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。

1）简易免疫电泳先将抗原样品在琼脂中进行电泳分离，可将蛋白质抗原分子分成不同的区带，然后将抗血清加入琼脂板横槽中，使二者进行双向扩散，当比例合适时即形成特异性的沉淀线，

3、免疫电泳（immunoelectrophoresis）常1032）对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis,CIEP)是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术2）对流免疫电泳(counterimmunoelectro1043）火箭免疫电泳(rocketimmunoelectrophoresis)，抗原在电场下通过含有一定量抗体的琼脂凝胶，并于抗体发生反应，形成沉淀带。可定量分析。3）火箭免疫电泳(rocketimmunoelectro105

用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶免疫荧光检测法（IFA）放射免疫检测法（RIA）酶免疫检测法（EIA）

二、现代免疫分析-免疫标记技术用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提1061．抗体制备。多克隆抗体单克隆抗体，2．标记物与标记方法。放射性同位素、酶、荧光分子、化学和生物发光系统。免疫分析基本环节1．抗体制备。免疫分析基本环节1073．分析方式设计：

非竞争方式、竞争方式；

直接法、间接法；

标记抗原、标记抗体；

均相、非均相

4.信号检测。

与相应的标记物对应。主要为分光光度法、

荧光光度法、化学发光检测法。

3．分析方式设计：

非竞争方式、竞争方式；

直接法、间接法；108（一）、放射免疫分析(RadioimmunoassayRIA)

利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术。特点：

灵敏度高、特异性强、样品用量少、标记物容易制备以及放射性强度容易检测（一）、放射免疫分析(Radioi1091.放射免疫分析必需的基本试剂：抗体：作为标记药物和非标记药物竞争结合的蛋白。标记药物：提供可检测的信号(响应值)（放射性、光吸收、荧光发射）。非标记药物：在标准曲线制备时是药物标准品，(在样品中则为被测药物)分离剂——分离结合与游离部分1.放射免疫分析必需的基本试剂：110结合相游离相2.基本原理：RIA是标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合。结合相游离相2.基本原理：RIA是标记抗原和未标记抗原对有限111标记药物(S*)+抗体(Ab)[标记药物-抗体]复合物(S*-Ab)F*P-B*

B*F*、B*分别是游离的和与抗体结合的标记药物浓度，它们可通过产生的信号(如放射性、光吸收、荧光发射)强度反映出来(用仪器检测)。第十一章免疫学应用课件112

非标记药物（S）

F +标记药物(S*)+抗体(Ab)[标记药物-抗体]复合物(S*-Ab)F*P-B-B* B*

[非标记药物-抗体复合物](S-Ab) B随着S的加入，它对S*同Ab的结合则起竞争抑制作用，表现为使B*减少、使F*增加，并且只要S加入一定量，便有对应的F*和B*信号强度值，因此可建立S量(浓度)与响应值(F*和B*的信号强度)之间的函数关系，作成剂量反应曲线。 非标记药物（S）113免疫分析中各种竞争结合抑制曲线示意图免疫分析中各种竞争结合抑制曲线示意图114第十一章免疫学应用课件1153.标准曲线的绘制与样品测定步骤取标准抗原，用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5－8个系列浓度。加入定量标记抗原，其总放射性(T)应能满足准确测量的需要。加入定量的已稀释好的特异抗体，其抗体的量应满足灵敏度的要求。将标准抗原、标记抗原、特异抗体与缓冲液混匀后，在适当条件下温育，待反应平衡后测定总计数率(T)。3.标准曲线的绘制与样品测定步骤取标准抗原，用无放射活性的空116加入分离剂，使结合部分(B)与游离部分(F)分离。测定各管结合部分或游离部分的计数率。标准曲线通常以标准抗原(待测药物标准品)的浓度为横坐标，以结合率(B％)为纵坐标作图。纵坐标B％的计算：将与抗体结合的标记药物的放射性强度(B)与加入的标记药物总放射性强度(T)比较，即B％=(B／T)×100％；加入分离剂，使结合部分(B)与游离部分(F)分离。117第十一章免疫学应用课件118例：125I－RIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度

待测血清样品50μl→样品管中;含不同浓度地高辛标准品的血清50μl→标准曲线各管中;50μl空白人血清→零标准管.各管中依次加入保温液100μl→抗体溶液100μl→125I标记的地高辛(溶液)100μl摇匀→在室温(15～25℃)放置30min→γ-计数器测定各管的总计数T(即加人的协I总放射性剂量)→在电磁搅拌(或手摇)下，迅速向各管内加人1ml工作液(全部加完控制在5min内)，摇匀→离心10min(3000r/min)→倾去上清液→γ-计数器测定各管中沉淀的计数F(游离协I地高辛放射性强度)→计算出标准曲线各管和样品各管的结合率。例：125I－RIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度119

（二）酶免疫分析（enzymeimmunoassay）

标记物为酶，酶本身并不能直接产生信号，必须要有其他试剂如底物、辅酶等的参与才能完成酶反应，从而引起吸收光谱等的变化供测定。

常用的酶为：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、β-半乳糖苷酶。

（二）酶免疫分析（enzymeimmunoassay）120酶底物显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲1211.均相酶免疫分析，EMIT法（enzymemultipledimmunoassaytechnique）

基本原理：酶标药物与未标记药物互相竞争有限量的抗体(Ab)，测定小分子抗原。酶标抗原(AgE)同抗体(Ab)结合后，所形成的酶标抗原一抗体结合物(AgE—Ab)可使酶的活性发生改变(增强或减弱)；可直接通过测定酶活性的变化，求出样品含量的方法。1.均相酶免疫分析，EMIT法（enzymemultip122第十一章免疫学应用课件1232.酶联吸附免疫分析（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）属于非均相免疫分析的代表，普遍应用于各领域。基本原理：是将过量抗体（抗原）包被于载体上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。2.酶联吸附免疫分析（enzyme-linkedimmun1243种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）3种必要的试剂：125第十一章免疫学应用课件1261）双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检样品，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定如乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等1）双抗体夹心法127第十一章免疫学应用课件128获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相洗涤除去未结合的加1292）间接法方法：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相上抗原结合的受检抗体应用：常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定2）间接法130第十一章免疫学应用课件131包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体123）竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）包被反应123）竞争法

方法：用已知抗体包被，加入132第十一章免疫学应用课件133ELISA试剂盒ELISA试剂盒134第十一章免疫学应用课件135（三）胶体金免疫快速检测法1.双抗体夹心法-大分子抗原（三）胶体金免疫快速检测法1.双抗体夹心法-大分子抗原136第十一章免疫学应用课件137第十一章免疫学应用课件138样本加到S区，进入B区和B区的金标抗体发生免疫反应，再层析到T线位置时，如果样本中含有待测抗原，则T线不显色或显色很淡，C线显色，这样得到的是阳性结果。当待测样本中不含抗原时，再层析到T线位置时，则T线显色，C线也显色，得到阴性结果

SBTCD2.竞争抑制法样本加到S区，进入B区和B区的金标抗体发生免疫反应，再层析到139

能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒的抗体或抗原，如抗HIV抗体的检测。（四）免疫印迹法

140第十一章免疫学应用课件141第二节免疫预防

特异性免疫获得的方式：自然免疫：主要指机体感染病原体后建立的特异性免疫，也包括胎儿和新生儿经胎盘或乳汁从母体获得的抗体。人工免疫：人为的使机体获得特异性免疫，即免疫预防。第二节免疫预防

特异性免疫获得的方式：142免疫预防(immunoprophylaxis)：根据特异性免疫原理，采用人工方法将抗原(疫苗、类毒素等)或抗体(免疫血清、丙种球蛋白等)制成各种制剂，接种于人体，使其获得特异性免疫能力，达到预防某些疾病。人工主动免疫人工被动免疫免疫预防(immunoprophylaxis)：根据特异性免143一、人工主动免疫（artificialactiveimmunization）：用疫苗接种机体，使之产生特异性免疫，从而预防感染的措施。一、人工主动免疫（artificialactiveimm144（一）传统疫苗1.死疫苗：用物理或化学方法将病原微生物灭活而制成的制剂。又称灭活疫苗。2.活疫苗

用人工变异或直接从自然界筛选出来的毒力高度减弱、或由基本无毒的活病原微生物制成的制剂。又称减毒活疫苗。3.类毒素：

将细菌毒素用甲醛减毒后制备的具有免疫原性的物质。（一）传统疫苗145活疫苗与死疫苗的比较特点制剂特点接种剂量及次数恢复倾向无毒或减毒的活微生物量较小，一般仅需要一次相对稳定性不稳定可以回复为毒株强毒死微生物量较大，需要多次接种较稳定不回复为毒株免疫效果较好，维持3-5年甚至更长较差，维持半年至一年活疫苗死疫苗诱导的免疫类型体液免疫和细胞免疫体液免疫为主活疫苗与死疫苗的比较特点制剂特点接种剂量及次数恢复倾向无毒146（二）新型疫苗

1.亚单位疫苗：去除病原体中与激发保护性免疫无关的甚至有害的成分，保留有效免疫原成分制作的疫苗。

2.合成疫苗：根据有效免疫原性肽段的氨基酸序列合成的免疫原性多肽。

3.重组抗原疫苗：利用DNA重组技术制备的只含保护性抗原的纯化疫苗。

4.DNA疫苗：用编码病原体有效免疫原基因的重组体直接接种，体内可表达保护性抗原，从而诱导机体产生特异性免疫。（二）新型疫苗147第十一章免疫学应用课件148二、人工被动免疫（artificialpassiveimmunization）：给人注射含特异性抗体的免疫血清以治疗或紧急预防感染的措施。

1、抗毒素：用细菌外毒素或类毒素免疫动物制备的血清，具有中和外毒素的作用。2、人免疫球蛋白制剂来源:①恢复期病人供血者血浆，②接种疫苗/类毒素的免疫者血浆。二、人工被动免疫（artificialpassiveim149第十一章免疫学应用课件150计划免疫：根据某些特定传染病的疫情监测和人群免疫状况分析，按照规定的免疫程序有计划的进行人群预防接种。计划免疫：根据某些特定传染病的疫情监测和人群免疫状况分析，按151第十一章免疫学应用课件152第三节免疫治疗

免疫治疗（immunotherapy）：利用免疫学原理，针对疾病的发生机制，人为的调整免疫功能，达到治疗目的所采取的措施。免疫调节：即用物理、化学或生物学手段调节机体免疫功能。（免疫增强与免疫抑制）免疫重建：将正常个体的造血干细胞或淋巴细胞转移给免疫缺陷个体，以恢复其免疫功能。第三节免疫治疗

免疫治疗（immunotherapy153一、抗原为基础的免疫治疗1.治疗性疫苗：指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱生特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化目的的产品。1890年，Koch用注射结核菌素和甘油悬液的方法来治疗结核病，开创了用疫苗治疗疾病的先例。1902年，Wright等就采用加热灭活的葡萄球菌治疗葡萄球菌性皮肤病。目前研究热点：针对肿瘤、HIV、乙肝、自身免疫疾病的治疗性疫苗。一、抗原为基础的免疫治疗1.治疗性疫苗：指在已感染病原微生物154肿瘤疫苗是用肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物或肿瘤抗原激活机体免疫系统产生特异性抗肿瘤细胞免疫效应。2010年4月29日，FDA批准了首个癌症治疗疫苗Provenge用于晚期前列腺癌的治疗。肿瘤疫苗肿瘤疫苗是用肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物或肿瘤抗原激活机体免疫系155肿瘤疫苗1.肿瘤细胞疫苗2.多肽疫苗3.表达肿瘤抗原的重组病毒和DNA疫苗:4.APC为基础的肿瘤疫苗或称为APC疫苗肿瘤疫苗1.肿瘤细胞疫苗1561)肿瘤细胞疫苗传统的肿瘤细胞疫苗是通过照射灭活自体或同种异体肿瘤细胞或其粗提取物,抑制其增殖能力,保留其免疫原性.免疫原性弱,难以引起免疫反应。与免疫佐剂如弗氏完全佐剂、卡介苗和短小棒状杆菌属等混合以增强其免疫原性.1)肿瘤细胞疫苗157肿瘤基因工程疫苗:通过基因重组技术,将不同目的的基因如细胞因子、辅助刺激分子、MHC-I分子等导入肿瘤细胞而制备的疫苗。158TUMORCELLMHC-1

MHC-II()B7蛋白酶体(低分子多肽LMP)转运蛋白(TAP)基因转染CMV表达MHC-I等的DNA表达CTLMHC-IMHC和B7等分子转基因的肿瘤疫苗

TUMORCELLMHC-1基因转染CMV表达MHC159TUMORCELL基因转染CMV表达细胞因子的DNA(IL-2,IL-4,INF-)表达lymphokin趋化淋巴细胞趋化因子细胞因子基因转染的肿瘤疫苗TUMORCELL基因转染CMV表达细胞因子的DNA(I1602）多肽疫苗主要包括肿瘤特异性抗原、病毒相关抗原、癌基因或抑癌基因突变蛋白的多肽组成的疫苗。2）多肽疫苗主要包括肿瘤特异性抗原、病毒相关抗原、癌基因1613）DNA疫苗Plasmidvaccine由能引起保护性免疫反应的肿瘤抗原基因片段及其载体建构而成的。将编码细胞因子、细菌毒素、蛋白佐剂的DNA与携带抗原基因的质粒DNA融合更有效。3）DNA疫苗Plasmid由能引起保护性免疫反应的肿瘤抗1624）树突状细胞疫苗

（1)细胞性肿瘤