基因工程PCR课件

第五章聚合酶链式反应（PCR）基因扩增（geneamplification)1.环境诱发扩增在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。2.基因的程序性扩增在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。3.基因组进化扩增生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。4.基因工程扩增载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。5.PCR扩增应用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。第五章聚合酶链式反应（PCR）基因扩增（geneamp5.1（1）1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。（2）1985年Cetus公司的科学家K.B.Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实PCR的发明Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。5.1（1）1971年Khorana提出体外人工复制DNA的（3）TaqDNA聚合酶1986年H.A.Erilish从嗜热水生菌分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替Klenow片段，PCR技术才进入实用阶段。1988年R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反应中，使PCR自动循环仪成为可能。（4）PCR仪1988年Cetus公司发明自动热循环仪。（3）TaqDNA聚合酶5.2PCR扩增原理

PCR?

是在模板DNA、引物和dNTPS存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。其扩增原理是以半保留复制的形式进行，在体外进行DNA的变性、退火和引物延伸三个阶段的循环反应。5.2PCR扩增原理基因工程PCR课件PolymeraseChainReaction(PCR)

根据已知的DNA核苷酸序列从两个5’-端合成两条16~24bp的引物PolymeraseChainReaction(PCR基因工程PCR课件

要进行PCR反应，必须对目的基因片段两侧的序列了解清楚，至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。就可通过PCR反应，直接从染色体DNA或cDNA上高效快速地扩增出目的基因片段。要进行PCR反应，必须对目的基因片段两侧的序5.3PCR技术特点pg、ng的DNA模板分子即可。（1）特异性强错配率约万分之一（2×104）。扩增产物的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。（2）敏感性高5.3PCR技术特点pg、ng的DNA模板分子即可。（（4）简便扩增产物直接作序列分析和分子克隆，不必按常规方法先克隆再做序列分析。（3）快速整个PCR过程约4hr完成。样品处理约1hr

，PCR2hr，产物凝胶电泳分析约1hr。（4）简便扩增产物直接作序列分析和分子克隆，不必按常规方法先Clark发现用TaqDNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出A碱基末端的双链DNA分子，根据这一发现设计了克隆PCR产物的T-载体。利用Taqpolymerase的特性Clark发现用TaqDNA聚合酶得到的PCR反应产利用restrictionenzyme利用restrictionenzyme（5）可扩增RNAorcDNA有些外显子分散在一段很长的DNA中，难于将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作为模板，可将外显子集中，用PCR一次完成对某些外显子的扩增并进行序列分析。RT-PCR：先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。（5）可扩增RNAorcDNA有些外显子分散在一段很长的

模板可以是cDNA的第一条链，也可以是总DNA。模板可以是cDNA的第一条链，也可以是总DNA。对大批量PCR产物分析不影响，但用于克隆的DNA，必须检测克隆产物的DNA序列。（6）对材料（模板）质量要求低微量、粗制及部分降解的DNA材料都可作为起始材料。（7）有一定程度单核苷酸错误掺入对大批量PCR产物分析不影响，但用于克隆的DNA，必须检测克

5.4

PCR反应体系1.TaqDNA聚合酶①热稳定性TaqDNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。②最适温度高最适温度：75~80℃

延伸速度：35~150nt/(s·酶分子)最长延伸长度：6.7kb③Taq酶的缺点具有5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切酶活性，但没有3’-5’外切酶活性，因此不能修正错误的碱基配对！合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。5.4PCR反应体系①热稳定性TaqDNA聚合其它耐热的DNA聚合酶①TthDNA聚合酶无3’

→5’DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。②VENTDNA聚合酶有3’→5’外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100℃高温。③PfuDNAPolymerase有3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端！④TaqPlusDNAPolymerase是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。Taq的PCR产物3’端往往带有一个A。其它耐热的DNA聚合酶①TthDNA聚合酶无3’→5①纯度PCR对模板要求不高，但不能存在蛋白酶、核酸酶、尿素、SDS、EDTA等试剂。②用量一般50μl反应体系中50ng即可，模板太多，会令扩增失败。2.模板(template)①纯度PCR对模板要求不高，但不能存在蛋白酶、核酸酶、3.引物（primer）终浓度0.5μmol/L4.dNTPs浓度一般反应体系中dNTP混合浓度为200μmol/L，浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率。3.引物（primer）终浓度0.5μmol/L4.dNTP5.Mg2+浓度

~2.0mmol/LTaqDNA聚合酶对金属离子的性质和浓度较敏感，特别是Mg2+

。在4种脱氧核苷酸dNTP的总浓度~0.2mmol/L时，浓度为2.0mmol/L的MgCl2能最大程度地激活TaqDNA聚合酶的活性，过高则对酶活性表现出一定的抑制作用。5.Mg2+浓度~2.0mmol/L

5.5PCR反应条件

1.变性：94℃~95℃，1min，预变性5~10min。

2.引物的退火：

Tm=（G+C）×4+（A+T）×2。实际复性温度低于Tm值5℃，当引物中（G+C)含量低于50%时，复性温度低于55℃。提高退火温度，可提高引物与模板结合的特异性。时间30~60s。5.5PCR反应条件3.延伸温度和时间：一般72℃，1min。延伸时间过长，非特异扩增带出现，但最后一步可延长4~10min，使反应完全，产量高。4.循环数：25~40周期，次数少，产量不够；次数过多，反应停止，呈平台效应。3.延伸温度和时间：一般72℃，1min。延伸时间过长，非

5.6PCR引物设计原则a.长度15

~30bp，Tm55℃～75℃

。b.G+C占50%

~60%，避免单一碱基的连续排列，一般两端G+C含量近似。c.引物3’端必须与模板DNA互补。d.一对引物间连续互补碱基小于4个。e.引物本身应避免有回文序列。5.6PCR引物设计原则410=1.05×106(百万),420=1.1×1012(万亿)引物的长度一般引物设计为长15-30bp。即1.1×1012bp的基因组中有一次完全与20个核苷酸的序列相同的机会6~12bp为随机引物，在基因组中与随机引物完全相同的序列可能有多个，因而扩增时可以产生多个片段，因此多用于生物的分类学研究。410=1.05×106(百万),420=1.1×101引物的碱基序列3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。引物的碱基序列3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。5引物的碱基组成

①

提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力。②避免连续相同碱基排列或内部回文序列。引物的碱基组成①提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力③避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。③避免形成引物二聚体（dimer）

简并引物：根据蛋白质的氨基酸序列设计一组混合引物来合成相应的基因。例如：HisPheProPheMetLys5’-CAYTTYCCNTTYATGAAR-3’

其中：Y=嘧啶(UC)，R=嘌呤(AG)，N=任意碱基该序列具有2×2×4×2×2=64倍简并性，其中之一必是正确的。组苯丙脯甲硫赖简并引物：根据蛋白质的氨基酸序列设计一组混合引物来合成相

嵌套引物（nestedprimers)：设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。利用第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的起始材料，进行二次PCR扩增。这样能够使靶DNA序列得到有效的选择性扩增，增加扩增产物的特异性。引物设计现在多用专业软件如Primer5.0等嵌套引物（nestedprimers)：引物设计现在多5.7PCR技术的扩展技术关键：把线性DNA模板转变成环形分子，使引物的外侧序列“转变”

成内侧序列。（1）反向PCR

扩增两个引物外侧的未知序列（传统PCR只扩增两个引物之间的已知序列）。5.7PCR技术的扩展技术关键：（1）反向PCR基因工程PCR课件技术关键：两个引物的浓度相差100倍。低浓度的引物（限制引物）首先耗尽，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA，最后产物中99%是单链DNA。可用于Sanger法测序。

（2）不对称PCR用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。技术关键：两个引物的浓度相差100倍。（2）不对称PCR用技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。（3）反转录PCR（RT-PCR)扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖技术关键：（3）反转录PCR（RT-PCR)扩增RNA模板。基因工程PCR课件5.8PCR技术的应用（1）扩增某一段DNA基因组克隆：突变基因同野生型基因的比较。通常先构建突变体的基因文库，再应用杂交筛选等一系列烦琐的步骤，分离到所需的克隆。然后对突变基因测序并同野生型进行分析比较。利用PCR则可根据野生型基因的序列，设计一对合适的引物，从基因组(突变体)中直接扩增突变基因DNA产物，供测序使用。5.8PCR技术的应用（1）扩增某一段DNA基因组克隆：技术关键：利用引物的5’端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。（2）基因的体外诱变

在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。技术关键：（2）基因的体外诱变用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这条引物便成为新合成DNA子链的一个组成部分缬苏用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DN基因工程PCR课件克服单链引物法只能诱变5’的局限性

克服单链引物法只能诱变5’的局限性（3）基因组的比较研究比较不同物种之间的基因组特征和相似性。利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。类似于限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性DNA（RandomamplifiedpolymorphismDNA,RAPD）分析。（3）基因组的比较研究•

随机引物非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。•

基因组DNA如果在特定引物结合区域发生

DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。•PCR可以比较两种不同生物的基因组的差异。亲缘关系较近的两种生物比较远的生物产生更多的相同的条带。•随机引物非定点地扩增基因组DNA，然后用基因工程PCR课件基因工程PCR课件（4）DNAshufflingworks

Similarmutantsgeneratedbyerror-pronePCR,randomandsite-directedmutagenesis

Generatingchimeraswithcrossoversoflargeblocksofsequences1、TemplatePCR2、DNAseIdigest3、PCRwithoutprimers4、PCRwithprimers5、Cloneintovector（4）DNAshufflingworksSimilar你打算扩增下图所示的两段序列之间的DNA，请从所列出的的引物中选出合适的一对。

5’-GACCTGTGGAAGC-------CATACGGGATTG-3’3’-CTGGACACCTTCG-------GTATGCCCTAAC-5’

引物1：（1）5’-GACCTGTGGAAGC（2）5’-CTGGACACCTTCG

（3）5’-CGAAGGTGTCCAG（4）5’-GCTTCCACAGGTC

引物2：（1）5’-CATACGGGATTG（2）5’-GTATGCCCTAAC

（3）5’-GTTAGGGCATAC（4）5’-CAATCCCGTATG你打算扩增下图所示的两段序列之间的DNA，第五章聚合酶链式反应（PCR）基因扩增（geneamplification)1.环境诱发扩增在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。2.基因的程序性扩增在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。3.基因组进化扩增生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。4.基因工程扩增载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。5.PCR扩增应用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。第五章聚合酶链式反应（PCR）基因扩增（geneamp5.1（1）1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。（2）1985年Cetus公司的科学家K.B.Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实PCR的发明Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。5.1（1）1971年Khorana提出体外人工复制DNA的（3）TaqDNA聚合酶1986年H.A.Erilish从嗜热水生菌分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替Klenow片段，PCR技术才进入实用阶段。1988年R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反应中，使PCR自动循环仪成为可能。（4）PCR仪1988年Cetus公司发明自动热循环仪。（3）TaqDNA聚合酶5.2PCR扩增原理

PCR?

是在模板DNA、引物和dNTPS存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。其扩增原理是以半保留复制的形式进行，在体外进行DNA的变性、退火和引物延伸三个阶段的循环反应。5.2PCR扩增原理基因工程PCR课件PolymeraseChainReaction(PCR)

根据已知的DNA核苷酸序列从两个5’-端合成两条16~24bp的引物PolymeraseChainReaction(PCR基因工程PCR课件

要进行PCR反应，必须对目的基因片段两侧的序列了解清楚，至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。就可通过PCR反应，直接从染色体DNA或cDNA上高效快速地扩增出目的基因片段。要进行PCR反应，必须对目的基因片段两侧的序5.3PCR技术特点pg、ng的DNA模板分子即可。（1）特异性强错配率约万分之一（2×104）。扩增产物的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。（2）敏感性高5.3PCR技术特点pg、ng的DNA模板分子即可。（（4）简便扩增产物直接作序列分析和分子克隆，不必按常规方法先克隆再做序列分析。（3）快速整个PCR过程约4hr完成。样品处理约1hr

，PCR2hr，产物凝胶电泳分析约1hr。（4）简便扩增产物直接作序列分析和分子克隆，不必按常规方法先Clark发现用TaqDNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出A碱基末端的双链DNA分子，根据这一发现设计了克隆PCR产物的T-载体。利用Taqpolymerase的特性Clark发现用TaqDNA聚合酶得到的PCR反应产利用restrictionenzyme利用restrictionenzyme（5）可扩增RNAorcDNA有些外显子分散在一段很长的DNA中，难于将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作为模板，可将外显子集中，用PCR一次完成对某些外显子的扩增并进行序列分析。RT-PCR：先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。（5）可扩增RNAorcDNA有些外显子分散在一段很长的

模板可以是cDNA的第一条链，也可以是总DNA。模板可以是cDNA的第一条链，也可以是总DNA。对大批量PCR产物分析不影响，但用于克隆的DNA，必须检测克隆产物的DNA序列。（6）对材料（模板）质量要求低微量、粗制及部分降解的DNA材料都可作为起始材料。（7）有一定程度单核苷酸错误掺入对大批量PCR产物分析不影响，但用于克隆的DNA，必须检测克

5.4

PCR反应体系1.TaqDNA聚合酶①热稳定性TaqDNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。②最适温度高最适温度：75~80℃

延伸速度：35~150nt/(s·酶分子)最长延伸长度：6.7kb③Taq酶的缺点具有5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切酶活性，但没有3’-5’外切酶活性，因此不能修正错误的碱基配对！合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。5.4PCR反应体系①热稳定性TaqDNA聚合其它耐热的DNA聚合酶①TthDNA聚合酶无3’

→5’DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。②VENTDNA聚合酶有3’→5’外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100℃高温。③PfuDNAPolymerase有3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端！④TaqPlusDNAPolymerase是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。Taq的PCR产物3’端往往带有一个A。其它耐热的DNA聚合酶①TthDNA聚合酶无3’→5①纯度PCR对模板要求不高，但不能存在蛋白酶、核酸酶、尿素、SDS、EDTA等试剂。②用量一般50μl反应体系中50ng即可，模板太多，会令扩增失败。2.模板(template)①纯度PCR对模板要求不高，但不能存在蛋白酶、核酸酶、3.引物（primer）终浓度0.5μmol/L4.dNTPs浓度一般反应体系中dNTP混合浓度为200μmol/L，浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率。3.引物（primer）终浓度0.5μmol/L4.dNTP5.Mg2+浓度

~2.0mmol/LTaqDNA聚合酶对金属离子的性质和浓度较敏感，特别是Mg2+

。在4种脱氧核苷酸dNTP的总浓度~0.2mmol/L时，浓度为2.0mmol/L的MgCl2能最大程度地激活TaqDNA聚合酶的活性，过高则对酶活性表现出一定的抑制作用。5.Mg2+浓度~2.0mmol/L

5.5PCR反应条件

1.变性：94℃~95℃，1min，预变性5~10min。

2.引物的退火：

Tm=（G+C）×4+（A+T）×2。实际复性温度低于Tm值5℃，当引物中（G+C)含量低于50%时，复性温度低于55℃。提高退火温度，可提高引物与模板结合的特异性。时间30~60s。5.5PCR反应条件3.延伸温度和时间：一般72℃，1min。延伸时间过长，非特异扩增带出现，但最后一步可延长4~10min，使反应完全，产量高。4.循环数：25~40周期，次数少，产量不够；次数过多，反应停止，呈平台效应。3.延伸温度和时间：一般72℃，1min。延伸时间过长，非

5.6PCR引物设计原则a.长度15

~30bp，Tm55℃～75℃

。b.G+C占50%

~60%，避免单一碱基的连续排列，一般两端G+C含量近似。c.引物3’端必须与模板DNA互补。d.一对引物间连续互补碱基小于4个。e.引物本身应避免有回文序列。5.6PCR引物设计原则410=1.05×106(百万),420=1.1×1012(万亿)引物的长度一般引物设计为长15-30bp。即1.1×1012bp的基因组中有一次完全与20个核苷酸的序列相同的机会6~12bp为随机引物，在基因组中与随机引物完全相同的序列可能有多个，因而扩增时可以产生多个片段，因此多用于生物的分类学研究。410=1.05×106(百万),420=1.1×101引物的碱基序列3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。引物的碱基序列3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。5引物的碱基组成

①

提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力。②避免连续相同碱基排列或内部回文序列。引物的碱基组成①提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力③避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。③避免形成引物二聚体（dimer）

简并引物：根据蛋白质的氨基酸序列设计一组混合引物来合成相应的基因。例如：HisPheProPheMetLys5’-CAYTTYCCNTTYATGAAR-3’

其中：Y=嘧啶(UC)，R=嘌呤(AG)，N=任意碱基该序列具有2×2×4×2×2=64倍简并性，其中之一必是正确的。组苯丙脯甲硫赖简并引物：根据蛋白质的氨基酸序列设计一组混合引物来合成相

嵌套引物（nestedprimers)：设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。利用第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的起始材料，进行二次PCR扩增。这样能够使靶DNA序列得到有效的选择性扩增，增加扩增产物的特异性。引物设计现在多用专业软件如Primer5.0等嵌套引物（nestedprimers)：引物设计现在多5.7PCR技术的扩展技术关键：把线性DNA模板转变成环形分子，使引物的外侧序列“转变”

成内侧序列。（1）反向PCR

扩增两个引物外侧的未知序列（传统PCR只扩增两个引物之间的已知序列）。5.7PCR技术的扩展技术关键：（1）反向PCR基因工程PCR课件技术关键：两个引物的浓度相差100倍。低浓度的引物（限制引物）首先耗尽，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA，最后产物中99%是单链DNA。可用于Sanger法测序。

（2）不对称PCR用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。技术关键：两个引物的浓度相差100倍。（2）不对称PCR用技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。（3）反转录PCR（RT-PCR)扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖技术关键：（3）反转录PCR（RT-PCR)扩增RNA模板。基因工程PCR课件5.8PCR技术的应用（1）扩增某一段DNA基因组克隆：突变基因同野生型基因的比较。通常先构建突变体的基因文库，再应用杂交筛选等一系列烦琐的步骤，分离到所需的克隆。然后对突变基因测序并同野生型进行分析比较。利用PCR则可根据野生型基因的序列，设计一对合适的引物，从基因组(突变体)中直接扩增突变基因DNA产物，供测序使用。5.8PCR技术的应用（1）扩增某一段DNA基因组克隆：技术关键：利用引物的5’端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。（2）基因的体外诱变

在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。技术关键：（2）基因的体