从毛地黄中分离提取强心苷类药物课件

从毛地黄中分离提取

强心苷类药物

生物化工系张洪鹏从毛地黄中分离提取

强心苷类药物1一、强心苷简介(一)分布与应用强心苷(cardiacglycosides)是指生物界中一类对心脏有显著生理活性的甾体苷类。强心苷能加强心肌收缩性，减慢窦性频率。主要用于治疗慢性心功能不全，心房纤颤、心房扑动、阵发性心动过速等心脏疾病。强心苷还有兴奋延髓催吐化学感受区和影响中枢神经系统作用，可引起恶心、呕吐等胃肠反应，并能使动物产生眩晕、头痛等症。一、强心苷简介2强心苷在植物界分布比较广泛，主要存在于夹竹桃科、玄参科、百合科、萝摩科、十字花科、毛茛科、卫矛科、大蕺科、桑科等十几个科的一百多种植物中。强心苷在植物体中主要存于花、叶、种子、鳞茎、树皮和木质部等组织器官中。

强心苷在植物界分布比较广泛，主要存在于夹竹桃科、玄参科、百合3(二)强心苷结构与分类

强心苷的基本结构是由甾醇母核和连在C17位上的不饱和共轭内酯环构成苷元部分，然后通过甾醇母核C3位上的羟基和糖缩而合成。(二)强心苷结构与分类强心苷的基本结构是由甾醇母核和连4一般根据在生物体内是原生还是次生，可分为原生苷和次生苷。次生苷是含有两个以上糖的原生苷，经水解失去一部分糖而得到的苷称为次生苷或次级苷。一般根据在生物体内是原生还是次生，可分为原生苷和次生苷。次生51．甾核的立体结构构型及表示方法

甾体母核A、B、C、D四个环的稠合方式为A/B环有顺、反两种形式，但多为顺式；B/C环均为反式；C/D环多为顺式1．甾核的立体结构构型及表示方法甾体母核A、B、C、D四个6构向式为：A.B反式A.B顺式构向式为：A.B反式A.B顺式72.结构类型(1)苷元部分根据C17位侧链的不饱和内酯环不同分为：甲型：C17位侧链为五元环的△-内酯乙型：C17位侧链为六元环的△-

-内酯这两类大都是β-构型，个别为α-构型，α-型无强心作用。

2.结构类型(1)苷元部分8甲型强心苷元：C17位上连五元不饱和内酯环，即△αβ-γ-内酯----强心甾烯型。以强心甾（cardenolide）为母核命名。

甲型强心苷元：C17位上连五元不饱和内酯环，即△αβ-γ-内9乙型强心苷元

C17位上连六元不饱和内酯环，即△αβ，γδ----双烯-δ-内酯，称为海葱甾二烯或蟾蜍甾二烯。以海葱甾（scillanolide）或蟾蜍甾(bufanolide)为母核命名。

乙型强心苷元C17位上连六元不饱和内酯环，即△αβ，γ10(2)糖部分的结构构成强心苷的糖有20多种。根据它们C2位上有无羟基可以分成α-羟基糖（2-羟基糖）和α-去氧糖（2-去氧糖）两类。α-去氧糖常见于强心苷类，是区别于其它苷类成分的一个重要特征。(2)糖部分的结构11（1）α-羟基糖：除D-葡萄糖、L-鼠李糖外，还有6-去氧糖如L-夫糖（L-fucose）、D-鸡纳糖（D-quinovose）、D-弩箭子糖（D-antiarose）、D-6-去氧阿洛糖（D-6-deoxyallose）等；6-去氧糖甲醚如L-黄花夹竹桃糖（L-thevetose）、D-洋地黄糖（D-digitalose）等。

（2）α-去氧糖：有2，6-二去氧糖如D-洋地黄毒糖（D-digitoxose）等；2，6-二去氧糖甲醚如L-夹竹桃糖（L-oleandrose）、D-加拿大麻糖（D-cymarose）、D-迪吉糖（D-diginose）和D-沙门糖（D-sarmentose）等。（1）α-羟基糖：除D-葡萄糖、L-鼠李糖外，还有6-去氧糖12D-鸡纳糖D-弩箭子糖D-6-去氧阿洛糖L-夫糖D-洋地黄糖D-洋地黄毒糖D-加拿大麻糖L-黄花夹竹桃糖

D-鸡纳糖D-弩箭子糖D-6-去氧13（三）构成强心苷的糖对强心作用的影响构成强心苷的糖数目和种类不同，对强心苷活性影响不同。甲型强心苷元及其苷的毒性规律一般为：苷元>单糖苷>二糖苷>三糖苷单糖苷的毒性次序为：葡萄糖苷>甲氧基糖苷>6-去氧糖苷>2,6-去氧糖苷（三）构成强心苷的糖对强心作用的影响构成强心苷的糖数目和种类14乙型强心苷元及其苷的毒性规律一般为：苷元>单糖苷>二糖苷乙型强心苷元的毒性>相应的甲型强心苷元乙型强心苷元及其苷的毒性规律一般为：15（四）糖和苷元的连接方式强心苷中，多数是几种糖结合成低聚糖形式再与苷元的C3-OH结合成苷，少数为双糖苷或单糖苷。糖和苷的连接方式有三种：

Ⅰ型:苷元-(2,6-去氧糖)X-(D-葡萄糖)Y

Ⅱ型:苷元-(6-去氧糖)X-(D-葡萄糖)Y

Ⅲ型：苷元-（D-葡萄糖）Y一般初生苷其末端多为葡萄糖。（四）糖和苷元的连接方式强心苷中，多数是几种糖结合成低聚糖形16（五）结构举例（五）结构举例17从毛地黄中分离提取强心苷类药物课件18

大量的研究证明，强心苷的化学结构对其生理活性有较大影响。强心苷的强心作用取决于苷元部分，主要是甾体母核的立体结构、不饱和内酯环的种类及一些取代基的种类及其构型。糖部分本身不具有强心作用，但可影响强心苷的强心作用强度。强心苷的强心作用强弱常以对动物的毒性（致死量）来表示。(六)、强心苷的结构与活性的关系大量的研究证明，强心苷的化学结构对其生理活性有较大影191.甾体母核

甾体母核的立体结构与强心作用关系密切的是C/D环须顺式稠合。一旦这种稠合被破坏，将失去强心作用。若C14羟基为β构型时即表明C/D环顺式稠合，若为α构型或脱水形成脱水苷元，则强心作用消失。A/B环为顺式稠合的甲型强心苷元，必须具C3-β羟基，否则无活性。A/B环为反式稠合的甲型强心苷元，无论C3是β-羟基还是α-羟基均有活性。1.甾体母核202.不饱和内酯环

C17侧链上α、β-不饱和内酯环为β-构型时，有活性；为α构型时，无活性。3.取代基

强心苷元甾核中一些基团的改变亦将对生理活性产生影响。如C10位的角甲基转化为醛基或羟甲基时，其生理活性增强；C10位的角甲基转为羧基或无角甲基，则生理活性明显减弱。

2.不饱和内酯环214.糖部分

强心苷中的糖本身不具有强心作用，但它们的种类、数目对强心苷的毒性会产生一定的影响。一般来说，苷元连接糖形成单糖苷后，毒性增加。随着糖数的增多，分子量增大，苷元相对比例减少，又使毒性减弱。如毒毛旋花子苷元组成的三种苷的毒性比较，结果见下表。4.糖部分22洋地黄毒苷元与不同单糖结合的苷的毒性比较

化合物名称LD50（猫，mg/kg）洋地黄毒苷元0.459洋地黄毒苷元-D-葡萄糖0.125洋地黄毒苷元-D-洋地黄糖0.200洋地黄毒苷元-L-鼠李糖0.278洋地黄毒苷元-加拿大麻糖0.288

由上表可知，单糖苷的毒性次序为：葡萄糖苷＞甲氧基糖苷＞6-去氧糖苷＞2，6-去氧糖苷。洋地黄毒苷元与不同单糖结合的苷的毒性比较化合物名称LD5023二.毛地黄

毛地黄Digitalispurpurea

科属：玄参科

形态：多年生草花，常作二年生栽培。花期6-8月，果熟期8-10月。二.毛地黄

毛地黄Digitalispurpurea24从毛地黄中分离提取强心苷类药物课件25毛花洋地黄中强心苷的种类毛花洋地黄中强心苷的种类26

由上图可知：在毛化洋地黄中存在：甲，乙，丙，丁，戊五种苷其中，乙型和丙型苷已得到较为广泛的应用如：1.毛花洋地黄苷丙通过去乙酰基的反应可得到去乙酰毛花洋地黄苷丙，商品名为西地兰（cedilanid）。2.地高辛是毛花洋地黄苷丙的次级苷。利用毛花洋地黄叶中存在的β-D-葡萄糖酶水解除去葡萄糖，再用乙醇提取即可得到。

由上图可知：在毛化洋地黄中存在：甲，乙，丙，丁，戊五种苷其27三、强心苷的物理性质1.性状：强心苷多为无色结晶或无定形粉末，中性物质，有旋光性，C17侧链为-构型的味苦，α-构型味不苦，但无效。对粘膜有刺激性。三、强心苷的物理性质1.性状：28强心苷的溶解性与所连糖的种类和数目有关，一般可溶于水、甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂；难溶于乙醚、苯、石油醚等非极性溶剂。弱亲脂性苷微溶于氯仿-乙醇(2:1)，亲脂性苷微溶于乙酸乙酯、含水氯仿、氯仿-乙醇（3:1）。

2.溶解性强心苷的溶解性与所连糖的种类和数目有关，一般可溶于水、甲醇、29

一般糖基多的原生苷比次生苷或苷元的亲水性强、亲脂性弱，可溶于水等高极性溶剂而难溶于低极性溶剂，多为无定形粉末。洋地黄毒苷是一个三糖苷，但3分子糖都是洋地黄毒糖，整个分子只有5个羟基，故在水溶液中溶解度小(1:100000000)，溶于氯仿（1:40）。洋地黄毒苷一般糖基多的原生苷比次生苷或苷元的亲水性强、亲脂性弱，可溶30但糖基和苷元上羟基数目的多少对溶解性也有一定的影响。如乌本苷是一个单糖苷，却有8个羟基，水溶性很大（1:75），难溶于氯仿。乌本苷但糖基和苷元上羟基数目的多少对溶解性也有一定的影响。如乌本苷313.紫外吸收光谱

甲型强心苷由于存在不饱和共轭内酯环，在216-218nm处有最大吸收，当16，17位存在双键时，则最大吸收波长在270nm处。乙型强心苷在300nm处有最大吸收。3.紫外吸收光谱321.脱水反应2.水解反应3.颜色反应四.强心苷类化合物的化学性质1.脱水反应四.强心苷类化合物的化学性质33(一)．脱水反应强心苷混合强酸（3%-5%HCl）加热水解时，苷元往往发生脱水反应。

（1）C14和C5-OH最易发生脱水反应生成缩水苷元。（2）

同时存在C14-OH和C16-OH，也易脱水，得到二缩水苷元。(一)．脱水反应强心苷混合强酸（3%-5%HCl）加热水解时34（3）如将C3-OH氧化为酮基，则更使C5叔羟基活化，在温热条件下即可脱水而形成烯酮。同样，C16被氧化为酮基，也能促使C14-叔羟基脱水而形成烯酮。（4）

若C4位有双键，可促使C3-OH与C4-H脱水，生成共轭双键。从毛地黄中分离提取强心苷类药物课件35海葱苷A脱水海葱苷元

羟基洋地黄毒苷

脱水羟基洋地黄毒苷元鼠李糖-O-葡萄糖

+3D-洋地黄毒糖+L-鼠李糖+D-葡萄糖

(D-洋地黄毒糖)3海葱苷A36（1）温和酸水解用稀酸0.02～0.05mol/L的盐酸或硫酸，在含水醇中经短时间加热回流，可使I型强心苷水解为苷元和糖。由于此水解条件温和，对苷元的影响较小，不致引起脱水反应，对不稳定的α-去氧糖亦不致分解。（二）水解反应（2）氯化氢-丙酮法（Mannich和Siewert法）将强心苷置于含1%氯化氢的丙酮溶液中，20℃放置两周。此法可得到原生苷元和糖衍生物。（1）温和酸水解用稀酸0.02～0.05mol/L的盐酸或37（3）强烈酸水解Ⅱ型和Ⅲ型强心苷与苷元直接相连的均为α-羟基糖，由于糖的2-羟基阻碍了苷键原子的质子化，使水解较为困难，用温和酸水解无法使其水解，必须增高酸的浓度（3%～5%），延长作用时间或同时加压，才能使α-羟基糖定量地水解下来，但常引起苷元结构的改变，失去一分子或数分子水形成脱水苷元。（3）强烈酸水解Ⅱ型和Ⅲ型强心苷与苷元直接相连的均为α-38强心苷的苷键不被碱水解。但强心苷分子中的酰基、内酯环会受碱的影响，发生水解或裂解、双键移位、苷元异构化等反应。又可分为：（1）酰基的水解（2）内酯环的水解3.碱水解反应3.碱水解反应39（1）酰基的水解

强心苷的苷元或糖上常有酰基存在，它们遇碱可水解脱去酰基。一般用碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙、氢氧化钡等。α-去氧糖上的酰基最易脱去，用碳酸氢钠、碳酸氢钾处理即可，而羟基糖或苷元上的酰基须用氢氧化钙、氢氧化钡处理才可。甲酰基较乙酰基易水解，提取分离时，若用氢氧化钙处理，即可水解。上述四种碱只水解酰基，不影响内酯环。氢氧化钠、氢氧化钾由于碱性太强，不仅使所有酰基水解，而且还会使内酯环开裂。（1）酰基的水解40（2）内酯环的水解

在水溶液中，氢氧化钠、氢氧化钾溶液可使内酯环开裂，加酸后可再环合；在醇溶液中，氢氧化钠、氢氧化钾溶液使内酯环开环后生成异构化苷，酸化亦不能再环合成原来的内酯环，为不可逆反应。（2）内酯环的水解41(三)．颜色反应

强心苷颜色反应很多，根据颜色反应发生在分子的不同部位可分为三类：

1.作用于甾体母核的反应：

(1).醋酐-浓硫酸反应(Liebermann-burchardrection)

(2).氯仿-浓硫酸反应（Salkowskireaction)

(3).三氯化锑或五氯化锑反应(三)．颜色反应

强心苷颜色反应很多，根据颜色反应发生在分422.作用于α,β不饱和内酯环的反应：

甲型强心苷在碱性醇溶液中，发生双键转移，生成活性亚甲基，故可与活性亚甲基试剂作用而显色。乙型强心苷无此类反应。

2.作用于α,β不饱和内酯环的反应：

43三.强心苷的检测识别和定性、定量分析方法三.强心苷的检测识别和定性、定量分析方法44(一).常用检测识别方法：显色反应强心苷的显色反应包括五元不饱和内酯环、α-去氧糖、甾体母核三部分。(一).常用检测识别方法：显色反应强心苷的显色反应包括五元451.五元不饱和内酯环的显色反应

间二硝基苯试剂反应（Raymond反应）1.五元不饱和内酯环的显色反应间二硝基苯试剂反应（Raym463,5二硝基苯甲酸试剂反应（Kedde反应）

取试样的甲醇或乙醇溶液于试管中，加入3,5二硝基苯甲酸试剂（A液：2%的3,5-二硝基苯甲酸甲醇或乙醇溶液；B液：2mol/L氢氧化钾溶液，用前等量混合）3～4滴，产生红色或紫红色。原理与间二硝基苯试剂反应类似，本试剂可作为强心苷纸色谱和薄层色谱的显色试剂，喷雾后显紫红色，几分钟后褪色。3,5二硝基苯甲酸试剂反应（Kedde反应）47取试样的甲醇或乙醇溶液于试管中，加入碱性苦味酸试剂（A液：1%苦味酸乙醇溶液；B液：5%氢氧化钠水溶液，用前等量混合）数滴，呈现橙色或橙红色，反应有时需要15分钟以后才能显色，原理也是活性亚甲基与苦味酸缩合显色。此缩合产物在485nm波长处有吸收峰，《药典》以此法测定强心苷类药物含量。碱性苦味酸试剂反应（Baljet反应）取试样的甲醇或乙醇溶液于试管中，加入碱性苦味酸试剂（A48亚硝酰铁氰化钠试剂反应（Legal反应）取试样1mg～2mg，溶于2～3滴吡啶中，加3%亚硝酰铁氰化钠试剂和2mol/L氢氧化钠各1滴，反应液呈深红色并渐渐消失。亚硝酰铁氰化钠试剂反应（Legal反应）492.作用于α-去氧糖的反应

Keller-Kiliani(K-K)反应（三氯化铁-冰醋酸反应）

取试样1mg溶于5ml冰醋酸中，加1滴20%三氯化铁溶液，沿试管壁缓缓加入5ml浓硫酸，观察界面和醋酸层的颜色变化。如有α-去氧糖存在，醋酸层渐呈蓝或蓝绿色。2.作用于α-去氧糖的反应Keller-Kiliani(50过碘酸-对硝基苯胺反应

过碘酸将α-去氧糖氧化成丙二醛，丙二醛与硝基苯胺试剂反应呈深黄色。过碘酸-对硝基苯胺反应51对二甲氨基苯甲醛反应将试样的醇溶液点在滤纸上，喷以对二甲氨基苯甲醛试剂（1%对二甲氨基苯甲醛的醇溶液4ml加浓盐酸1ml），并于90℃加热，分子中含有α-去氧糖的强心苷可显灰红色斑点。对二甲氨基苯甲醛反应将试样的醇溶液点在滤纸上，喷以对二52呫吨氢醇反应（xanthydrol反应）

取试样1～10μg加入呫吨氢醇试剂（呫吨氢醇10mg溶解于100ml冰醋酸中，加入1ml浓盐酸）1ml，置沸水浴中数分钟后呈红色。本反应非常灵敏，只要分子中有α-去氧糖都能呈色。可用于含α-去氧糖化合物的定性、定量分析。呫吨氢醇反应（xanthydrol反应）533.作用于甾体母核的反应Liebermann-Burchard反应

取试样溶于冰醋酸，加浓硫酸-醋酐（1∶20）混合液数滴，反应液呈黄→红→蓝→紫→绿等变化，最后褪色。本反应液的呈色变化过程随分子中双键数目与位置不同而有所差异。Tschugaeff反应取试样溶于冰醋酸，加无水氯化锌及乙酰氯后煮沸，或取试样溶于氯仿或二氯甲烷，加冰醋酸、乙酰氯和氯化锌煮沸，反应液呈紫→红→蓝→绿等变化，B环有不饱和双键的作用更快。3.作用于甾体母核的反应Liebermann-Burchar54Salkowski反应

将试样溶于氯仿，沿试管壁加入浓硫酸，静置，氯仿层呈血红色或青色，硫酸层有绿色荧光。Kahlenberg反应

将强心苷的醇溶液点在滤纸或薄层上，喷以20%三氯化锑氯仿溶液（不含乙醇和水），于100℃加热数分钟，在可见光或紫外光下可观察到不同颜色的斑点。Salkowski反应55三氯醋酸-氯胺T(chloraminesT反应)

将试样醇溶液点在滤纸（或薄板）上，喷以三氯醋酸-氯胺T试剂（25%三氯醋酸乙醇溶液4ml加3%氯胺T水溶液1ml混匀），待纸片干后，100℃加热数分钟，于紫外光下观察。洋地黄毒苷元衍生的苷类显黄色荧光；羟基洋地黄毒苷元衍生的苷类显亮蓝色荧光；异羟基洋地黄毒苷元衍生的苷类显灰蓝色荧光。该反应可初步区别洋地黄类的苷元。三氯醋酸-氯胺T(chloraminesT反应)56(二).

定性分析

1.化学定性

依据母核结构、苷元的不饱和内酯环、α-去氧糖3个方面的结构反应进行鉴别。方法见显色反应。2.色谱定性

由于强心苷类成分的结构类似，因而，色谱法对强心苷的分析有着特殊的价值。包括：纸色谱、薄层色谱等。

(二).

定性分析

1.化学定性57（1）纸色谱根据强心苷及其苷元的极性不同可选用不同的固定相。如强心苷的亲水性较强，宜选用水为固定相，移动相多选用水饱和的丁酮、乙醇-甲苯-水（4∶6∶1）、氯仿-甲醇-水（10∶2∶5）；如强心苷的亲水性较弱或检识苷元时，可选用甲酰胺为固定相，以甲酰胺饱和的甲苯或苯为移动相。（1）纸色谱根据强心苷及其苷元的极性不同可选用不同的固定相。58（2）薄层色谱吸附薄层色谱

由于强心苷分子中含有较多的极性基团，尤其是多糖苷，在氧化铝上吸附作用较强，分离效果较差，因此常采用硅胶作吸附剂，以氯仿-甲醇-冰醋酸（85∶13∶2）、二氯甲烷-甲醇-甲酰胺（80∶19∶1）、醋酸乙酯-甲醇-水（8∶5∶5）等溶剂系统作为移动相。这些展开剂中含少量甲酰胺或水可以减少拖尾现象。（2）薄层色谱吸附薄层色谱59分配色谱

一般选用硅藻土、纤维素为支持剂，甲酰胺、二甲基甲酰胺或乙二醇作固定相。氯仿-丙酮（4∶1）、氯仿-正丁醇（19∶1）等溶剂系统作移动相。分配色谱60（3）纸色谱和薄层色谱常用的显色剂适用于甲型强心苷的显色剂1%苦味酸水溶液与10%氢氧化钠水溶液（95∶5）混合，喷后于100℃烘数分钟，显呈橙红色；2%3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液与2mol/L氢氧化钾溶液等体积混合，喷后显红色，数分钟后渐褪色。适用于各类强心苷的显色剂2%三氯化锑的氯仿溶液，喷后于100℃烘数分钟，各种强心苷及苷元显不同颜色；25%三氯醋酸乙醇溶液与3%氯胺T(4∶1)混合，喷后于100℃加热数分钟，在紫外灯下显蓝（紫）、黄（褐）色荧光。（3）纸色谱和薄层色谱常用的显色剂适用于甲型强心苷的显色剂61(三).定量分析方法利用强心苷中α，β－不饱和五元内酯易与某些芳香硝基化合物（如间-二硝基苯）形成有色加成物，采用紫外-可见分光光度法测定生药中总强心苷的含量。单体强心苷可用薄层扫描法、高效液相色谱法或柱前衍生化气相色谱法测定。(三).定量分析方法利用强心苷中α，β－不饱和五元内62*反相薄层层析法对洋地黄叶中强心苷定量分析（文献1）将洋地黄叶冷冻干燥，粉碎成500µm一下得粉末，250mg叶末中添加内标物β-脱水去乙酰基毛花洋地黄苷A，用50％甲醇提取。提取物中加3ml甲醇及50ml乙酸乙酯过滤后，上SwpPak（二氧化硅）柱。先用氯仿-丙酮-乙酸（70：30：0.05）分离2级糖苷，在以氯仿-甲醇-水-乙酸（90：10：0.8：0.05）分离原糖苷。分别以Sep-Pak(C18)纯化，TLC出现斑点，再用KC18F板（20cm）层析，分离原糖苷的展开溶剂位乙腈-甲醇-0.5MNaCl(1:1:1)，分离2级糖苷用乙腈-甲醇-0.5MNaCl(12:7:9），使用岛津TLC扫描仪，以反射吸收法在225nm处检测。*反相薄层层析法对洋地黄叶中强心苷定量分析（文献1）将洋地黄63

结果，100mg叶末中的含量依次为：毛花洋地黄苷A56.7±2.4μg，毛花洋地黄苷B16.1±1.2μg,毛花洋地黄苷C322.7±40.8μg,去毛花洋地黄苷C27.0±3.9μg,α-乙酰洋底黄毒苷20.5±2.9μg，α-乙酰基异羟基洋底黄毒苷17.9±2.7μg。结果，100mg叶末中的含量依次为：毛花洋地黄苷A56.64四、强心苷的提取分离强心苷含量很低，多与糖类、皂苷、色素、鞣质等共存，这些成分的存在可影响强心苷在溶剂中的溶解度。同时，强心苷的原生苷和次生苷共存，且很多结构相似的苷同存，故提取分离较难。因酸碱可使强心苷发生水解、脱水和异构化，故提取分离时应注意控制酸碱性。四、强心苷的提取分离强心苷含量很低，多与糖类、皂苷、色素、鞣65(一)、提取方法由于强心苷易受酸、碱、酶的作用，发生水解、脱水及异构化等反应。在提取分离时要注意这些因素的影响和应用。在研究或生产中，若以提取分离原生苷为目的时，须防止酶水解。常用70%～80%的乙醇为提取溶剂。当原料中含脂类杂质较多时，须用石油醚或汽油脱脂后再提取。原生苷:抑制酶的活性(冷冻干燥、快速提取、快速干燥)MeOH、70%EtOH提取。次生苷:利用酶的活性,EtOH、EtOAc提取。(一)、提取方法由于强心苷易受酸、碱、酶的作用，发生水解、脱66(二)、分离纯化方法分离强心苷可以采用重结晶法、溶剂萃取法、逆流分溶法和色谱分离法。在大多数情况下需要采用多种方法配合使用，反复分离才能得到单体。(二)、分离纯化方法分离强心苷可以采用重结晶法、溶剂萃取法、67(三)分离提取工艺部分1.从毛地黄中提取分离粗总苷(主要含毛花洋地黄苷甲、乙、丙)；2.毛花洋地黄总苷（混合苷）中苷甲、乙、丙以及苷元部分的分离提取；3.西地兰、地高辛的分离提取；(三)分离提取工艺部分1.从毛地黄中提取分离粗总苷(主要含毛681.从毛地黄中提取分离粗总苷工艺流程1.从毛地黄中提取分离粗总苷工艺流程69从毛地黄中分离提取强心苷类药物课件702.(1)毛花洋地黄总苷（混合苷）中苷甲、乙、丙的分离提取；毛花洋地黄叶中主要含强心苷类化合物，达三十余种，其中主要由五种强心苷元组成.大多为次生苷.毛花洋地黄苷甲、乙、丙、丁、戊为原生苷.从粗总苷中分离原生苷即：毛花洋地黄苷甲、乙、丙的工艺流程如下图所示.2.(1)毛花洋地黄总苷（混合苷）中苷甲、乙、丙的分离提取；71毛花洋地黄总苷（混合苷）中苷甲，乙，丙的分离粗总苷按粗总苷-甲醇-氯仿-蒸馏水（1:100:500:500）的比例进行第一次分离,现将总苷溶于甲醇，过滤，在向滤液中加入氯仿和水稀甲醇层氯仿层母液粗结晶（主要含苷丙和乙）氯仿层稀甲醇层减压浓缩至小体积，冷却，抽滤析出的结晶常压回收氯仿氯仿残渣（主要含苷甲和乙）按上述第一次分离配比进行第二次分离常压回收氯仿残渣（主含苷乙）减压浓缩母液结晶（主含苷丙）毛花洋地黄总苷（混合苷）中苷甲，乙，丙的分离粗总苷按粗总苷-72﹡原生苷、次生苷分离时的注意事项由于苷结构特点及性质,提取原生苷时一般需要注意以下方面：1.提取过程中避免接触酸或碱；2.设法抑制或破坏酶的活性。抑制或破坏酶的活性的方法：1.新鲜植物药材迅速干燥或加入硫酸铵水溶液研磨促使酶变性；2.提取时用沸水、甲醇、60％以上浓度的乙醇；3.加入碳酸钙拌匀后沸水提取。﹡原生苷、次生苷分离时的注意事项由于苷结构特点及性质,提取原73(2)苷元部分的分离提取(2)苷元部分的分离提取743.(1)去乙酰毛花洋地黄苷丙(西地兰)的制取制取过程分为提取总苷、分离苷丙(见总苷分离部分)和水解去乙酰基三个阶段。水解去乙酰基毛花洋地黄苷丙去乙酰基的反应（即洋地黄毒糖上的酯键水解）较易进行。常采用氢氧化钙或碳酸钾，按苷丙-甲醇-氢氧化钙-水（1g∶33ml∶70mg∶33ml）的配比，先将苷丙溶于甲醇中，氢氧化钙溶于水中，分别滤清，再混合均匀，静置过夜。使水溶液呈弱碱性。水解完毕，用1%的盐酸调至中性。滤过，滤液减压浓缩至约20%的体积，放置过夜，滤过得到粗结晶，用甲醇重结晶即得西地兰纯品（mp．265～268℃）。3.(1)去乙酰毛花洋地黄苷丙(西地兰)的制取制取过程分为提75去乙酰基毛花洋地黄苷丙(西地兰)的工艺流程去乙酰基毛花洋地黄苷丙(西地兰)的工艺流程764.地高辛(异羟基洋地黄毒苷)的制取地高辛是毛花洋地黄苷丙的次级苷，为白色结晶或结晶性粉末。熔点235～245℃（分解），[α]+9.5°～＋12°(吡啶)，无臭，味苦。溶于稀乙醇、吡啶或氯仿与乙醇混合液中。几不溶于水、乙醚、丙酮、醋酸乙酯、氯仿，在80%乙醇中的溶解度比羟基洋地黄毒苷大。利用毛花洋地黄叶中存在的β-D-葡萄糖酶水解除去葡萄糖，再用乙醇提取。4.地高辛(异羟基洋地黄毒苷)的制取地高辛是毛花洋地黄苷丙的77地高辛制取的工艺流程地高辛制取的工艺流程78参考文献1.反相薄层层析法对洋地黄叶中强心苷定量分析.国外医学中医中药分册.1996年第18卷第2期34页2.汪洋,李孟全.HPLC法测定糖芥不同部位强心苷的含量研究.中医药学刊.第23卷第5期2005年5月3.刘瑞源,钟平,戴开金.大孔吸附树脂提取中草药有效成分的研究进展.4.袁黎明,傅若农,张天佑.高速逆流色谱在植物有效成分分离中的应用.药物分析杂志.第18(1)期60页1998年5.尹茶,吴玉田.高效毛细管电泳技术及其在中药分析中的应用.药物分析杂志.第19(3)期210页1999年.6.姜艳艳,刘斌,石任兵.高效液相色谱&质谱联用技术在天然产物分离鉴定中的应用.药品评价.2005年第2卷第1期.参考文献1.反相薄层层析法对洋地黄叶中强心苷定量分析.国外医797.宋敏,李苗,胡晓燕.高效液相色谱法测定地高辛原料药中各杂质及主药含量.药物分析杂志.第24(3)期333页2004年.8.黄花夹竹桃叶中的二羟黄酮苷,黄酮醇苷及其对HIV-1逆转录酶,HIV-1整合酶的抑制活性.国外医学中医中药分册.2003年第25卷第4期237页.9.桑志红,杨松成.液相色谱-质谱联用技术及其在药物分析中的应用.解放军药学学报.1999年4月第15卷2期28页.10.许玲玲,安睿,王新宏.液质联用技术在中药分析中的应用.中成药.2006年2月第28卷第2期239页.11.颜继忠,褚建军,童胜强.中药分离中高速逆流色谱溶剂体系的选择.中国现代应用药学杂志.2003年10月第20卷第5期374页.7.宋敏,李苗,胡晓燕.高效液相色谱法测定地高辛原料药中各杂8012.刘斌北京中医药大学中药学院；《中国中医药报》2176期13.《中国药典》（2005年版）14.《生物学》中国药科大学15.赵华明谢如刚中国大百科16.《生物与药学》生命经维17.云南药用植物数据库18.《夹竹桃，樟树灭螺活性成分的初步提取》刘颖芳,彭宇,刘凤想湖北大学生命科学学院；湖北大学学报19.《HPLC法测定糖芥不同部位强心苷的含量研》究汪洋,李孟全：牡丹江医学院分析测试实验；《中医药学刊》20.北京中医药大学的教学课件

12.刘斌北京中医药大学中药学院；《中国中医药报》2181从毛地黄中分离提取

强心苷类药物

生物化工系张洪鹏从毛地黄中分离提取

强心苷类药物82一、强心苷简介(一)分布与应用强心苷(cardiacglycosides)是指生物界中一类对心脏有显著生理活性的甾体苷类。强心苷能加强心肌收缩性，减慢窦性频率。主要用于治疗慢性心功能不全，心房纤颤、心房扑动、阵发性心动过速等心脏疾病。强心苷还有兴奋延髓催吐化学感受区和影响中枢神经系统作用，可引起恶心、呕吐等胃肠反应，并能使动物产生眩晕、头痛等症。一、强心苷简介83强心苷在植物界分布比较广泛，主要存在于夹竹桃科、玄参科、百合科、萝摩科、十字花科、毛茛科、卫矛科、大蕺科、桑科等十几个科的一百多种植物中。强心苷在植物体中主要存于花、叶、种子、鳞茎、树皮和木质部等组织器官中。

强心苷在植物界分布比较广泛，主要存在于夹竹桃科、玄参科、百合84(二)强心苷结构与分类

强心苷的基本结构是由甾醇母核和连在C17位上的不饱和共轭内酯环构成苷元部分，然后通过甾醇母核C3位上的羟基和糖缩而合成。(二)强心苷结构与分类强心苷的基本结构是由甾醇母核和连85一般根据在生物体内是原生还是次生，可分为原生苷和次生苷。次生苷是含有两个以上糖的原生苷，经水解失去一部分糖而得到的苷称为次生苷或次级苷。一般根据在生物体内是原生还是次生，可分为原生苷和次生苷。次生861．甾核的立体结构构型及表示方法

甾体母核A、B、C、D四个环的稠合方式为A/B环有顺、反两种形式，但多为顺式；B/C环均为反式；C/D环多为顺式1．甾核的立体结构构型及表示方法甾体母核A、B、C、D四个87构向式为：A.B反式A.B顺式构向式为：A.B反式A.B顺式882.结构类型(1)苷元部分根据C17位侧链的不饱和内酯环不同分为：甲型：C17位侧链为五元环的△-内酯乙型：C17位侧链为六元环的△-

-内酯这两类大都是β-构型，个别为α-构型，α-型无强心作用。

2.结构类型(1)苷元部分89甲型强心苷元：C17位上连五元不饱和内酯环，即△αβ-γ-内酯----强心甾烯型。以强心甾（cardenolide）为母核命名。

甲型强心苷元：C17位上连五元不饱和内酯环，即△αβ-γ-内90乙型强心苷元

C17位上连六元不饱和内酯环，即△αβ，γδ----双烯-δ-内酯，称为海葱甾二烯或蟾蜍甾二烯。以海葱甾（scillanolide）或蟾蜍甾(bufanolide)为母核命名。

乙型强心苷元C17位上连六元不饱和内酯环，即△αβ，γ91(2)糖部分的结构构成强心苷的糖有20多种。根据它们C2位上有无羟基可以分成α-羟基糖（2-羟基糖）和α-去氧糖（2-去氧糖）两类。α-去氧糖常见于强心苷类，是区别于其它苷类成分的一个重要特征。(2)糖部分的结构92（1）α-羟基糖：除D-葡萄糖、L-鼠李糖外，还有6-去氧糖如L-夫糖（L-fucose）、D-鸡纳糖（D-quinovose）、D-弩箭子糖（D-antiarose）、D-6-去氧阿洛糖（D-6-deoxyallose）等；6-去氧糖甲醚如L-黄花夹竹桃糖（L-thevetose）、D-洋地黄糖（D-digitalose）等。

（2）α-去氧糖：有2，6-二去氧糖如D-洋地黄毒糖（D-digitoxose）等；2，6-二去氧糖甲醚如L-夹竹桃糖（L-oleandrose）、D-加拿大麻糖（D-cymarose）、D-迪吉糖（D-diginose）和D-沙门糖（D-sarmentose）等。（1）α-羟基糖：除D-葡萄糖、L-鼠李糖外，还有6-去氧糖93D-鸡纳糖D-弩箭子糖D-6-去氧阿洛糖L-夫糖D-洋地黄糖D-洋地黄毒糖D-加拿大麻糖L-黄花夹竹桃糖

D-鸡纳糖D-弩箭子糖D-6-去氧94（三）构成强心苷的糖对强心作用的影响构成强心苷的糖数目和种类不同，对强心苷活性影响不同。甲型强心苷元及其苷的毒性规律一般为：苷元>单糖苷>二糖苷>三糖苷单糖苷的毒性次序为：葡萄糖苷>甲氧基糖苷>6-去氧糖苷>2,6-去氧糖苷（三）构成强心苷的糖对强心作用的影响构成强心苷的糖数目和种类95乙型强心苷元及其苷的毒性规律一般为：苷元>单糖苷>二糖苷乙型强心苷元的毒性>相应的甲型强心苷元乙型强心苷元及其苷的毒性规律一般为：96（四）糖和苷元的连接方式强心苷中，多数是几种糖结合成低聚糖形式再与苷元的C3-OH结合成苷，少数为双糖苷或单糖苷。糖和苷的连接方式有三种：

Ⅰ型:苷元-(2,6-去氧糖)X-(D-葡萄糖)Y

Ⅱ型:苷元-(6-去氧糖)X-(D-葡萄糖)Y

Ⅲ型：苷元-（D-葡萄糖）Y一般初生苷其末端多为葡萄糖。（四）糖和苷元的连接方式强心苷中，多数是几种糖结合成低聚糖形97（五）结构举例（五）结构举例98从毛地黄中分离提取强心苷类药物课件99

大量的研究证明，强心苷的化学结构对其生理活性有较大影响。强心苷的强心作用取决于苷元部分，主要是甾体母核的立体结构、不饱和内酯环的种类及一些取代基的种类及其构型。糖部分本身不具有强心作用，但可影响强心苷的强心作用强度。强心苷的强心作用强弱常以对动物的毒性（致死量）来表示。(六)、强心苷的结构与活性的关系大量的研究证明，强心苷的化学结构对其生理活性有较大影1001.甾体母核

甾体母核的立体结构与强心作用关系密切的是C/D环须顺式稠合。一旦这种稠合被破坏，将失去强心作用。若C14羟基为β构型时即表明C/D环顺式稠合，若为α构型或脱水形成脱水苷元，则强心作用消失。A/B环为顺式稠合的甲型强心苷元，必须具C3-β羟基，否则无活性。A/B环为反式稠合的甲型强心苷元，无论C3是β-羟基还是α-羟基均有活性。1.甾体母核1012.不饱和内酯环

C17侧链上α、β-不饱和内酯环为β-构型时，有活性；为α构型时，无活性。3.取代基

强心苷元甾核中一些基团的改变亦将对生理活性产生影响。如C10位的角甲基转化为醛基或羟甲基时，其生理活性增强；C10位的角甲基转为羧基或无角甲基，则生理活性明显减弱。

2.不饱和内酯环1024.糖部分

强心苷中的糖本身不具有强心作用，但它们的种类、数目对强心苷的毒性会产生一定的影响。一般来说，苷元连接糖形成单糖苷后，毒性增加。随着糖数的增多，分子量增大，苷元相对比例减少，又使毒性减弱。如毒毛旋花子苷元组成的三种苷的毒性比较，结果见下表。4.糖部分103洋地黄毒苷元与不同单糖结合的苷的毒性比较

化合物名称LD50（猫，mg/kg）洋地黄毒苷元0.459洋地黄毒苷元-D-葡萄糖0.125洋地黄毒苷元-D-洋地黄糖0.200洋地黄毒苷元-L-鼠李糖0.278洋地黄毒苷元-加拿大麻糖0.288

由上表可知，单糖苷的毒性次序为：葡萄糖苷＞甲氧基糖苷＞6-去氧糖苷＞2，6-去氧糖苷。洋地黄毒苷元与不同单糖结合的苷的毒性比较化合物名称LD50104二.毛地黄

毛地黄Digitalispurpurea

科属：玄参科

形态：多年生草花，常作二年生栽培。花期6-8月，果熟期8-10月。二.毛地黄

毛地黄Digitalispurpurea105从毛地黄中分离提取强心苷类药物课件106毛花洋地黄中强心苷的种类毛花洋地黄中强心苷的种类107

由上图可知：在毛化洋地黄中存在：甲，乙，丙，丁，戊五种苷其中，乙型和丙型苷已得到较为广泛的应用如：1.毛花洋地黄苷丙通过去乙酰基的反应可得到去乙酰毛花洋地黄苷丙，商品名为西地兰（cedilanid）。2.地高辛是毛花洋地黄苷丙的次级苷。利用毛花洋地黄叶中存在的β-D-葡萄糖酶水解除去葡萄糖，再用乙醇提取即可得到。

由上图可知：在毛化洋地黄中存在：甲，乙，丙，丁，戊五种苷其108三、强心苷的物理性质1.性状：强心苷多为无色结晶或无定形粉末，中性物质，有旋光性，C17侧链为-构型的味苦，α-构型味不苦，但无效。对粘膜有刺激性。三、强心苷的物理性质1.性状：109强心苷的溶解性与所连糖的种类和数目有关，一般可溶于水、甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂；难溶于乙醚、苯、石油醚等非极性溶剂。弱亲脂性苷微溶于氯仿-乙醇(2:1)，亲脂性苷微溶于乙酸乙酯、含水氯仿、氯仿-乙醇（3:1）。

2.溶解性强心苷的溶解性与所连糖的种类和数目有关，一般可溶于水、甲醇、110

一般糖基多的原生苷比次生苷或苷元的亲水性强、亲脂性弱，可溶于水等高极性溶剂而难溶于低极性溶剂，多为无定形粉末。洋地黄毒苷是一个三糖苷，但3分子糖都是洋地黄毒糖，整个分子只有5个羟基，故在水溶液中溶解度小(1:100000000)，溶于氯仿（1:40）。洋地黄毒苷一般糖基多的原生苷比次生苷或苷元的亲水性强、亲脂性弱，可溶111但糖基和苷元上羟基数目的多少对溶解性也有一定的影响。如乌本苷是一个单糖苷，却有8个羟基，水溶性很大（1:75），难溶于氯仿。乌本苷但糖基和苷元上羟基数目的多少对溶解性也有一定的影响。如乌本苷1123.紫外吸收光谱

甲型强心苷由于存在不饱和共轭内酯环，在216-218nm处有最大吸收，当16，17位存在双键时，则最大吸收波长在270nm处。乙型强心苷在300nm处有最大吸收。3.紫外吸收光谱1131.脱水反应2.水解反应3.颜色反应四.强心苷类化合物的化学性质1.脱水反应四.强心苷类化合物的化学性质114(一)．脱水反应强心苷混合强酸（3%-5%HCl）加热水解时，苷元往往发生脱水反应。

（1）C14和C5-OH最易发生脱水反应生成缩水苷元。（2）

同时存在C14-OH和C16-OH，也易脱水，得到二缩水苷元。(一)．脱水反应强心苷混合强酸（3%-5%HCl）加热水解时115（3）如将C3-OH氧化为酮基，则更使C5叔羟基活化，在温热条件下即可脱水而形成烯酮。同样，C16被氧化为酮基，也能促使C14-叔羟基脱水而形成烯酮。（4）

若C4位有双键，可促使C3-OH与C4-H脱水，生成共轭双键。从毛地黄中分离提取强心苷类药物课件116海葱苷A脱水海葱苷元

羟基洋地黄毒苷

脱水羟基洋地黄毒苷元鼠李糖-O-葡萄糖

+3D-洋地黄毒糖+L-鼠李糖+D-葡萄糖

(D-洋地黄毒糖)3海葱苷A117（1）温和酸水解用稀酸0.02～0.05mol/L的盐酸或硫酸，在含水醇中经短时间加热回流，可使I型强心苷水解为苷元和糖。由于此水解条件温和，对苷元的影响较小，不致引起脱水反应，对不稳定的α-去氧糖亦不致分解。（二）水解反应（2）氯化氢-丙酮法（Mannich和Siewert法）将强心苷置于含1%氯化氢的丙酮溶液中，20℃放置两周。此法可得到原生苷元和糖衍生物。（1）温和酸水解用稀酸0.02～0.05mol/L的盐酸或118（3）强烈酸水解Ⅱ型和Ⅲ型强心苷与苷元直接相连的均为α-羟基糖，由于糖的2-羟基阻碍了苷键原子的质子化，使水解较为困难，用温和酸水解无法使其水解，必须增高酸的浓度（3%～5%），延长作用时间或同时加压，才能使α-羟基糖定量地水解下来，但常引起苷元结构的改变，失去一分子或数分子水形成脱水苷元。（3）强烈酸水解Ⅱ型和Ⅲ型强心苷与苷元直接相连的均为α-119强心苷的苷键不被碱水解。但强心苷分子中的酰基、内酯环会受碱的影响，发生水解或裂解、双键移位、苷元异构化等反应。又可分为：（1）酰基的水解（2）内酯环的水解3.碱水解反应3.碱水解反应120（1）酰基的水解

强心苷的苷元或糖上常有酰基存在，它们遇碱可水解脱去酰基。一般用碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙、氢氧化钡等。α-去氧糖上的酰基最易脱去，用碳酸氢钠、碳酸氢钾处理即可，而羟基糖或苷元上的酰基须用氢氧化钙、氢氧化钡处理才可。甲酰基较乙酰基易水解，提取分离时，若用氢氧化钙处理，即可水解。上述四种碱只水解酰基，不影响内酯环。氢氧化钠、氢氧化钾由于碱性太强，不仅使所有酰基水解，而且还会使内酯环开裂。（1）酰基的水解121（2）内酯环的水解

在水溶液中，氢氧化钠、氢氧化钾溶液可使内酯环开裂，加酸后可再环合；在醇溶液中，氢氧化钠、氢氧化钾溶液使内酯环开环后生成异构化苷，酸化亦不能再环合成原来的内酯环，为不可逆反应。（2）内酯环的水解122(三)．颜色反应

强心苷颜色反应很多，根据颜色反应发生在分子的不同部位可分为三类：

1.作用于甾体母核的反应：

(1).醋酐-浓硫酸反应(Liebermann-burchardrection)

(2).氯仿-浓硫酸反应（Salkowskireaction)

(3).三氯化锑或五氯化锑反应(三)．颜色反应

强心苷颜色反应很多，根据颜色反应发生在分1232.作用于α,β不饱和内酯环的反应：

甲型强心苷在碱性醇溶液中，发生双键转移，生成活性亚甲基，故可与活性亚甲基试剂作用而显色。乙型强心苷无此类反应。

2.作用于α,β不饱和内酯环的反应：

124三.强心苷的检测识别和定性、定量分析方法三.强心苷的检测识别和定性、定量分析方法125(一).常用检测识别方法：显色反应强心苷的显色反应包括五元不饱和内酯环、α-去氧糖、甾体母核三部分。(一).常用检测识别方法：显色反应强心苷的显色反应包括五元1261.五元不饱和内酯环的显色反应

间二硝基苯试剂反应（Raymond反应）1.五元不饱和内酯环的显色反应间二硝基苯试剂反应（Raym1273,5二硝基苯甲酸试剂反应（Kedde反应）

取试样的甲醇或乙醇溶液于试管中，加入3,5二硝基苯甲酸试剂（A液：2%的3,5-二硝基苯甲酸甲醇或乙醇溶液；B液：2mol/L氢氧化钾溶液，用前等量混合）3～4滴，产生红色或紫红色。原理与间二硝基苯试剂反应类似，本试剂可作为强心苷纸色谱和薄层色谱的显色试剂，喷雾后显紫红色，几分钟后褪色。3,5二硝基苯甲酸试剂反应（Kedde反应）128取试样的甲醇或乙醇溶液于试管中，加入碱性苦味酸试剂（A液：1%苦味酸乙醇溶液；B液：5%氢氧化钠水溶液，用前等量混合）数滴，呈现橙色或橙红色，反应有时需要15分钟以后才能显色，原理也是活性亚甲基与苦味酸缩合显色。此缩合产物在485nm波长处有吸收峰，《药典》以此法测定强心苷类药物含量。碱性苦味酸试剂反应（Baljet反应）取试样的甲醇或乙醇溶液于试管中，加入碱性苦味酸试剂（A129亚硝酰铁氰化钠试剂反应（Legal反应）取试样1mg～2mg，溶于2～3滴吡啶中，加3%亚硝酰铁氰化钠试剂和2mol/L氢氧化钠各1滴，反应液呈深红色并渐渐消失。亚硝酰铁氰化钠试剂反应（Legal反应）1302.作用于α-去氧糖的反应

Keller-Kiliani(K-K)反应（三氯化铁-冰醋酸反应）

取试样1mg溶于5ml冰醋酸中，加1滴20%三氯化铁溶液，沿试管壁缓缓加入5ml浓硫酸，观察界面和醋酸层的颜色变化。如有α-去氧糖存在，醋酸层渐呈蓝或蓝绿色。2.作用于α-去氧糖的反应Keller-Kiliani(131过碘酸-对硝基苯胺反应

过碘酸将α-去氧糖氧化成丙二醛，丙二醛与硝基苯胺试剂反应呈深黄色。过碘酸-对硝基苯胺反应132对二甲氨基苯甲醛反应将试样的醇溶液点在滤纸上，喷以对二甲氨基苯甲醛试剂（1%对二甲氨基苯甲醛的醇溶液4ml加浓盐酸1ml），并于90℃加热，分子中含有α-去氧糖的强心苷可显灰红色斑点。对二甲氨基苯甲醛反应将试样的醇溶液点在滤纸上，喷以对二133呫吨氢醇反应（xanthydrol反应）

取试样1～10μg加入呫吨氢醇试剂（呫吨氢醇10mg溶解于100ml冰醋酸中，加入1ml浓盐酸）1ml，置沸水浴中数分钟后呈红色。本反应非常灵敏，只要分子中有α-去氧糖都能呈色。可用于含α-去氧糖化合物的定性、定量分析。呫吨氢醇反应（xanthydrol反应）1343.作用于甾体母核的反应Liebermann-Burchard反应

取试样溶于冰醋酸，加浓硫酸-醋酐（1∶20）混合液数滴，反应液呈黄→红→蓝→紫→绿等变化，最后褪色。本反应液的呈色变化过程随分子中双键数目与位置不同而有所差异。Tschugaeff反应取试样溶于冰醋酸，加无水氯化锌及乙酰氯后煮沸，或取试样溶于氯仿或二氯甲烷，加冰醋酸、乙酰氯和氯化锌煮沸，反应液呈紫→红→蓝→绿等变化，B环有不饱和双键的作用更快。3.作用于甾体母核的反应Liebermann-Burchar135Salkowski反应

将试样溶于氯仿，沿试管壁加入浓硫酸，静置，氯仿层呈血红色或青色，硫酸层有绿色荧光。Kahlenberg反应

将强心苷的醇溶液点在滤纸或薄层上，喷以20%三氯化锑氯仿溶液（不含乙醇和水），于100℃加热数分钟，在可见光或紫外光下可观察到不同颜色的斑点。Salkowski反应136三氯醋酸-氯胺T(chloraminesT反应)

将试样醇溶液点在滤纸（或薄板）上，喷以三氯醋酸-氯胺T试剂（25%三氯醋酸乙醇溶液4ml加3%氯胺T水溶液1ml混匀），待纸片干后，100℃加热数分钟，于紫外光下观察。洋地黄毒苷元衍生的苷类显黄色荧光；羟基洋地黄毒苷元衍生的苷类显亮蓝色荧光；异羟基洋地黄毒苷元衍生的苷类显灰蓝色荧光。该反应可初步区别洋地黄类的苷元。三氯醋酸-氯胺T(chloraminesT反应)137(二).

定性分析

1.化学定性

依据母核结构、苷元的不饱和内酯环、α-去氧糖3个方面的结构反应进行鉴别。方法见显色反应。2.色谱定性

由于强心苷类成分的结构类似，因而，色谱法对强心苷的分析有着特殊的价值。包括：纸色谱、薄层色谱等。

(二).

定性分析

1.化学定性138（1）纸色谱根据强心苷及其苷元的极性不同可选用不同的固定相。如强心苷的亲水性较强，宜选用水为固定相，移动相多选用水饱和的丁酮、乙醇-甲苯-水（4∶6∶1）、氯仿-甲醇-水（10∶2∶5）；如强心苷的亲水性较弱或检识苷元时，可选用甲酰胺为固定相，以甲酰胺饱和的甲苯或苯为移动相。（1）纸色谱根据强心苷及其苷元的极性不同可选用不同的固定相。139（2）薄层色谱吸附薄层色谱

由于强心苷分子中含有较多的极性基团，尤其是多糖苷，在氧化铝上吸附作用较强，分离效果较差，因此常采用硅胶作吸附剂，以氯仿-甲醇-冰醋酸（85∶13∶2）、二氯甲烷-甲醇-甲酰胺（80∶19∶1）、醋酸乙酯-甲醇-水（8∶5∶5）等溶剂系统作为移动相。这些展开剂中含少量甲酰胺或水可以减少拖尾现象。（2）薄层色谱吸附薄层色谱140分配色谱

一般选用硅藻土、纤维素为支持剂，甲酰胺、二甲基甲酰胺或乙二醇作固定相。氯仿-丙酮（4∶1）、氯仿-正丁醇（19∶1）等溶剂系统作移动相。分配色谱141（3）纸色谱和薄层色谱常用的显色剂适用于甲型强心苷的显色剂1%苦味酸水溶液与10%氢氧化钠水溶液（95∶5）混合，喷后于100℃烘数分钟，显呈橙红色；2%3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液与2mol/L氢氧化钾溶液等体积混合，喷后显红色，数分钟后渐褪色。适用于各类强心苷的显色剂2%三氯化锑的氯仿溶液，喷后于100℃烘数分钟，各种强心苷及苷元显不同颜色；25%三氯醋酸乙醇溶液与3%氯胺T(4∶1)混合，喷后于100℃加热数分钟，在紫外灯下显蓝（紫）、黄（褐）色荧光。（3）纸色谱和薄层色谱常用的显色剂适用于甲型强心苷的显色剂142(三).定量分析方法利用强心苷中α，β－不饱和五元内酯易与某些芳香硝基化合物（如间-二硝基苯）形成有色加成物，采用紫外-可见分光光度法测定生药中总强心苷的含量。单体强心苷可用薄层扫描法、高效液相色谱法或柱前衍生化气相色谱法测定。(三).定量分析方法利用强心苷中α，β－不饱和五元内143*反相薄层层析法对洋地黄叶中强心苷定量分析（文献1）将洋地黄叶冷冻干燥，粉碎成500µm一下得粉末，250mg叶末中添加内标物β-脱水去乙酰基毛花洋地黄苷A，用50％甲醇提取。提取物中加3ml甲醇及50ml乙酸乙酯过滤后，上SwpPak（二氧化硅）柱。先用氯仿-丙酮-乙酸（70：30：0.05）分离2级糖苷，在以氯仿-甲醇-水-乙酸（90：10：0.8：0.05）分离原糖苷。分别以Sep-Pak(C18)纯化，TLC出现斑点，再用KC18F板（20cm）层析，分离原糖苷的展开溶剂位乙腈-甲醇-0.5MNaCl(1:1:1)，分离2级糖苷用乙腈-甲醇-0.5MNaCl(12:7:9），使用岛津TLC扫描仪，以反射吸收法在225nm处检测。*反相薄层层析法对洋地黄叶中强心苷定量分析（文献1）将洋地黄144

结果，100mg叶末中的含量依次为：毛花洋地黄苷A56.7±2.4μg，毛花洋地黄苷B16.1±1.2μg,毛花洋地黄苷C322.7±40.8μg,去毛花洋地黄苷C27.0±3.9μg,α-乙酰洋底黄毒苷20.5±2.9μg，α-乙酰基异羟基洋底黄毒苷17.9±2.7μg。结果，100mg叶末中的含量依次为：毛花洋地黄苷A56.145四、强心苷的提取分离强心苷含量很低，多与糖类、皂苷、色素、鞣质等共存，这些成分的存在可影响强心苷在溶剂中的溶解度。同时，强心苷的原生苷和次生苷共存，且很多结构相似的苷同存，故提取分离较难。因酸碱可使强心苷发生水解、脱水和异构化，故提取分离时应注意控制酸碱性。四、强心苷的提取分离强心苷含量很低，多与糖类、皂苷、色素、鞣146(一)、提取方法由于强心苷易受酸、碱、酶的作用，发生水解、脱水及异构化等反应。在提取分离时要注意这些因素的影响和应用。在研究或生产中，若以提取分离原生苷为目的时，须防止酶水解。常用70%～80%的乙醇为提取溶剂。当原料中含脂类杂质较多时，须用石油醚或汽油脱脂后再提取。原生苷:抑制酶的活性(冷冻干燥、快速提取、快速干燥)MeOH、70%EtOH提取。次生苷:利用酶的活性,EtOH、EtOAc提取。(一)、提取方法由于强心苷易受酸、碱、酶的作用，发生水解、脱147(二)、分离纯化方法分离强心苷可以采用重结晶法、溶剂萃取法、逆流分溶法和色谱分离法。在大多数情况下需要采用多种方法配合使用，反复分离才能得到单体。(二)、分离纯化方法分离强心苷可以采用重结晶法、溶剂萃取法、148(三)分离提取工艺部分1.从毛地黄