现代分子诊断技术

第七章现代分子诊断技术酶联免疫吸附测定DNA诊断系统DNA指纹遗传性疾病的分子诊断技术

基因诊断基因蛋白质性状生化诊断基因诊断临床诊断传统的诊断程序先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理学特性确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，还是其他物质实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比较特异诊断成本高、速度慢、效率低如砂眼衣原体、朊病毒方法优点缺点显微镜镜检简单易行，可直接观察到寄生虫的形态速度慢，灵敏度低，对经验水平要求高费时费工，无法辨别形态相近的寄生虫体外培养、接种能检测到活的寄生虫，并可检测感染性和感染程度速度慢、花费高，寄生虫可能难以进行体外培养，且必须使用动物材料抗体检测简单、快速、能够实现自动化，可用于检测大量的样品无法区分活的寄生虫与处在潜伏状态的寄生虫。有时会有非特异反应发生DNA杂交及PCR快速灵敏，能够实现自动化，可以分辨不同种的寄生虫，不需要以前有寄生虫感染病史花费高，步骤多，无法区分活的和死的寄生虫，有时会有假阳性或假阴性

检测寄生虫感染的诊断方法的比较现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物质进行诊断检测一种有效的诊断方法应具备：1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分子产生阳性反应2、灵敏度(sensitivity)高3、操作简单(simplicity)基因诊断的特点特异性高检测目标是基因，为原始的致病因素灵敏度高待测标本往往微量，目的基因只需pg水平稳定性高基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需处于活性状态诊断范围广，适应性强确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态临床应用前景好基因诊断优点从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制显著提早产前诊断的时间无需对组织、器官或细胞进行选择快捷准确、安全基因诊断常用的技术核酸分子杂交PCR（聚合酶链式反应）限制性酶切分析SSCP（单链构象多态性分析）DNA测序DNA芯片技术DNASouthernblot,FISH,PCR,Sequencing,micoarray,restrictionanalysis,RFLP，SSCPRNANorthernblot,RT-PCR,micoarraysProteinWesternblot,Immuno-histochemistry,microarraySouthernblotNNTTNTTFISHPCR技术术DNA测序序指在在固固相相支支持持物物上上原位位合合成成寡寡核核苷苷酸酸或者者直直接接将将大量量探探针针以以显显微微打打印印的的方方式式有有序序地地固固化化于支支持持物物表表面面，，然然后后与与标标记记的的样样品品杂杂交交，，通通过过对对杂杂交交的的检检测测分分析析，，得得出出样样品品的的遗遗传传信信息息（（基基因因序序列列及及表表达达的的信信息息））由于于在在制制备备过过程程中中运运用用了了计算算机机芯芯片片的制制备备技技术术如如显显微微光光蚀蚀刻刻、、显显微微打打印印等等，，且且常常用用硅芯芯片片作为为固固相相支支持持物物，，所所以以称称为为DNA芯片片技技术术DNA芯片片技技术术的的概概念念DNA芯片片技技术术原原理理大规规模模集集成成的的固固相相杂杂交交基本本原原理理是是核核酸酸分分子子杂杂交交，，即即依依据据DNA双链链碱碱基基互互补补配配对对、、变变性性和和复复性性的的原原理理以大量已已知序列列的寡核核苷酸、、cDNA或基因片片段作探探针，检检测样品品中哪些些核酸序序列与其其互补，，然后通通过定性性、定量量分析得得出待测测样品的的基因序序列及表表达的信信息DNA芯片技术术流程BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize””arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysis基因诊断断的原理理利用分子子生物学学和分子子遗传学学的技术术，从DNA或RNA水平检测测、分析析基因的的存在、、变异和和表达状状态，从从而对疾疾病做出出诊断的的方法策略检测已知知的能产产生某种种特定功功能蛋白白的基因因检测与某某种遗传传标志连连锁的的的致病基基因检测表型型克隆基基因基因治疗疗的机理理基因置换：：正常基因因取代致病病基因基因修正：：纠正致病病基因的突突变碱基序序列基因修饰：：目的基因因表达产物物补偿致病病基因的功功能基因抑制：：外源基因因干扰、抑抑制有害基基因的表达达基因封闭：：封闭特定定基因的表表达“自杀基因因”的应用用免疫基因的的治疗耐药基因的的治疗

美国医学家家W·F·安德森等人人对腺甘脱脱氨酶缺乏乏症（ADA缺乏症）的的基因治疗疗，是世界界上第一个个基因治疗疗成功的范范例1990年9月14日，安德森森对一例患患ADA缺乏症的4岁女孩谢德

谢德尔，1999分子诊断利用PCR技术或PCR与分子杂交交标记相结结合，可以以快速准确确地检测出出病原性物物质。分子诊断遗传性疾病的的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测第一节酶联免免疫吸附测定定抗体高度特异异地与抗原分分子结合通过抗原-抗体的特异识识别反应进行行检测酶联免疫吸附附测定(enzyme-linkedimmunosorbantassay,ELISA)一、酶联免疫疫吸附测定的的原理工作原理：主要是利用了了一抗与目标标分子的特异异性结合假定目标分子子是一种蛋白白质，那么要要得到可用于于检测的抗体体，则首先需需要纯化出这这种蛋白质，，然后用纯化化的蛋白质免免疫动物（一一般是兔子）），在免疫过过程中兔子的的血清就会产产生多克隆抗抗体二、检测过程程：①将待测样品结结合在固相支支持物（如96孔的微量滴定定板）上②加入可以与目目标分子特异异反应的抗体体，即一抗（（primaryantibody）,反应后冲洗，，将未结合上上的一抗洗去去③加入二抗（secondaryantibody），二抗通常常只特异地识识别一抗，而而不识别目标标分子（二抗抗上还连着一一种酶，如碱碱性磷酸酶、、过氧化物酶酶或脲酶等，，这些酶都能能够催化一种种化学反应将将无色底物转转变成有色物物质），一抗抗与二抗反应应完成后，再再次冲洗将未未与一抗结合合的二抗洗去去④加入无色底物物双抗体夹心法法检测大分子抗抗原间接法检测抗体竞争法测定小分子抗抗原或半抗原原，也可测定定抗体双夹心法测定大分子抗抗原特异性相同，，来源不同3、使使用用多多克克隆隆抗抗体体的的缺缺点点①同一一抗抗体体混混合合物物中中不不同同抗抗体体的的含含量量会会有有差差异异，，而而且且每每次次制制备备的的抗抗体体的的量量之之间间也也会会有有差差异异②无法法区区别别相相类类似似的的目目标标分分子子：：如如果果病病原原分分子子与与非非病病原原分分子子之之间间只只相相差差一一个个抗抗原原决决定定簇簇，，这这时时多多克克隆隆抗抗体体就就无无法法区区分分，，因因为为在在ELISA检测测中中都都会会发发生生颜颜色色变变化化单克克隆隆抗抗体体特特异异性性强强只结结合合抗抗原原上上某某一一单单一一位位置置4、酶酶联联免免疫疫吸吸附附测测定定的的局局限限性性仅凭凭ELISA结果果容容易易造造成成误误诊诊，，ELISA检测测只只能能作作为为一一种种初初步步的的检检测测手手段段，，要要进进一一步步确确诊诊还还必必须须进进行行western检测测要提高ELISA检测的准准确度,就必须提提高一抗抗的特异异性在使用抗抗体时，，要求其其抗原的的编码其其目标识识别位点点的基因要表表达，而且目标标位点不能够以以任何方方式被覆覆盖或阻阻断，否则都将将影响抗抗体与抗抗原的结结合第二节DNA诊断系统统DNA诊断的理理论基础础：任何一个个决定生生物学特特性的DNA序列都应应该是独独特的，，都可以以作为专专一性的的诊断标标记一、核酸酸杂交1、工作原原理：◆两条DNA链之间可可以通过过碱基配配对而形形成氢键键2、3个关键要要素：★探针DNA★目的DNA★信号检测测主要依据据：碱碱基互补补、变性性和复性性DNA与DNA杂交：A=T、G≡C;DNA与RNA杂交:A=U、G≡C;变性：在一定温温度下，，使核酸酸双链解解开为两两条单链链；复性：随温度逐逐渐恢复复，变性性的两条条单链重重新形成成互补双双链碱基互补补核酸分分子杂杂交（（固相相杂交交）操操作程程序制备待待测核核酸样样品分离、、变性性、转转移、、固化化DNA片段杂交加入标标记核核酸探探针检测杂杂交信信号标记核核酸探探针预杂交制备核酸探探针漂洗去除未未参与杂交交的标记探探针3、杂交探针针必须是高度度特异性的的DNA片段种级探针：：区分两个个或多个物物种亚种级探针针：区分物物种内特定定的株系DNARNA化学合成或或克隆的完完整基因基因的一个个片段利用核酸双双链的碱基互补、、变性和复复性的原理，可以以用已知碱基基序列的单单链核酸片片段作为探针，与待测样样本中的单单链核酸互互补配对，，以判断有有无互补的的同源核酸酸序列的存存在核酸探针是指带有标标记的某一一特定DNA或RNA片断，能与与待测样本本中单链核核酸分子互互补配对结结合，进而而检测同源源序列探针标记物物有放射性核素素或非放射性核核素（生物素、、地高辛、、荧光素等等）两大类类分离杂交探探针的方法法：提取某一病病原微生物物株系的染染色体DNA限制性内切切酶进行酶酶解得到的酶解解片段克隆隆进一质粒粒载体，构构建质粒文文库文库中重组组质粒的插插入片段即即可用来分分别同病原原性微生物物和非病原原性微生物物的核DNA进行行杂杂交交、、筛筛选选核酸酸杂杂交交的的灵灵敏敏度度和和可可靠靠性性极极高高用探探针针直直接接同同粪粪便便样样品品、、尿尿样样、、血血样样、、喉喉洗洗液液和和组组织织样样品品中中的的目目标标DNA进行行杂杂交交，，且且无无需需预预先先纯纯化化DNA若样样品品中中的的目目标标分分子子非非常常少少，，则则需需通通过过PCR将目目的的序序列列扩扩增增，，再再进进行行杂杂交交检检测测从理理论论上上讲讲，，用用DNA杂交来诊断疾疾病可用于对对所有的致病病微生物的检检测4、非同位素标标记探针32P的缺点：⑴半衰期短，仅仅13天⑵操作起来比较较危险⑶必须要有特殊殊的实验室设设备进行操作作⑷放射性垃圾的的处理繁琐非放射性杂交交检测系统：：通过酶促反应应将某种底物物转变成生色色物质或化学学发光物质而而达到放大信信号的目的采用将生物素素（biotin）标记的核苷苷酸掺入DNA的方法制备探探针生物素标记的的DNA在室温下至少少可保存一年年检测发光和颜颜色变化可在在几小时内完完成BBBBAPBBAP生物素加入链霉素抗抗生物蛋白加入生物素标标记的碱性磷磷酸酶探针目的DNA加入不不同的的生色色或化化学发发光底底物荧光标标记的的引物物直接接进行行PCR检测DNA引物1引物2荧光染染料PCR层析荧光检检测游离引引物分子夹夹心探探针检检测发出荧荧光分子夹夹心探探针(没有荧荧光)荧光团团猝灭剂剂目的DNA与目的的DNA杂交TaqMan探针技技术原理：：利用Taq酶的3′5′外切核核酸酶酶活性性，切切断探探针，，产生生荧光光信号号，由由于探探针与与模板板特异异性结结合，，荧光光的强强弱就就代表表了模模板的的数量量3′5′5′3′QR上游引物物下游引物物5′3′3′5′QRTaqMan探针的荧荧光信号号产生机机制疟疾的分分子诊断断：检测是否否存在疟疟原虫抽取血样样进行镜镜检免疫诊断断:ELISA检测疟原原虫蛋白白或抗体体无法区分分是以前前感染还还是现在在感染DNA杂交诊断断例一：DNA的杂交探探针是一一段疟原原虫的高高度重复复的DNA序列具体的分分离过程程：构建一个个疟原虫虫的核基基因文库库用标记的的疟原虫虫核DNA作探针去去筛选核核基因文文库选出那些些杂交信信号最强强的克隆隆用这些选选出来的的片段作作探针，，与疟原原虫及其其同属中中不导致致疟疾的的种的核核基因作作杂交，，以检查查该片段段作为DNA探针的可可靠性锥虫的检检测锥虫在人人体中可可侵入肝肝、脾、、淋巴结结、中枢枢神经系系统，在在其中大大量繁殖殖并杀死死寄主细细胞显微镜检检新鲜血血液取新鲜血血液感染染未携带带锥虫的的寄生虫虫,30-40天后杀死昆虫虫,镜检昆虫的肠肠道免疫检测:假阳性高例二：PCR检测针对锥虫特有的一一段188bp的DNA序列设计引物物，特异地从从锥虫基因组组中扩增得到到188bp的条带二、细菌性传传染病及病毒毒性疾病的分分子诊断技术术抗生素的不合合理使用DNA杂交PCR检测噬菌体介导DNA杂交设计16SrRNA为探针16SrRNA在细菌中拷贝贝数极高，高高度的保守性性特异性不是很很好必须结合PCR技术PCR检测nestedPCR针对目的病原原菌的不同保保守区段设计计多对引物每每对引物都都能特异的扩扩增出一段目目的片段，病病原菌存在的的可能性大大大增加模板使用外引物，，进行第一次次PCR扩增使用内引物，，进行第二次次PCR扩增第一次PCR扩增产物第二次PCR扩增产物巢式PCR原理示意图PCR技术也会产生生假阳性新扩增的目的的DNA特异性不强退火温度过低低模板中杂质的的污染假阴性存在Taq酶的抑制剂模板量过少模板DNA纯度不够原位PCR(insituPCR,ISPCR)在细胞或细胞胞切片上对待待测的低拷贝贝数基因进行行扩增，并通通过原位杂交交进行检测不仅能检测出出病原微生物物的存在，且且能够在组织织细胞中定位位原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）将标记探针与与细胞或组织织切片中的核核酸进行杂交交，进而检测测特异的DNA或RNA序列细胞原位杂交交组织切片原位位杂交DNA-DNARNA-DNA三类杂交RNA-RNA该法优点：不需提取核酸酸，故可完整保持持组织或细胞胞的形态，因因而更能准确确地反映组织织细胞的功能能状态有噬菌体介导细细菌检测将荧光素酶基基因引入到噬噬菌体的基因因组，然后用用转基因噬菌菌体去侵染待待测样品噬菌体侵染该该宿主菌，大大量合成包括括荧光素酶在在内的由噬菌菌体基因编码码的蛋白，向向体系中加入入荧光素和ATP，就会有荧光光产生结核菌的检测测抗药性菌株的的检测荧光素酶荧光素＋ATP荧光利用宿主细胞胞转录、翻译译噬菌体基因荧光素酶基因因宿主细菌噬菌体介导的的细菌检测第三节DNA指纹每个人体细胞胞内都含有23对染色体，每每条染色体中中部含有一个个DNA分子，DNA分子中的核苷苷酸序列包含含着遗传信息息，在DNA分子中存在三三种类型：单单拷贝序列、、中等程度重重复序列、高高度重复序每个重复序列列在300个核苷酸长度度之内，由于于高度重复，，序列经过超超离心后以卫卫星带出现在在主要DNA带的附近，所所以也称卫星星DNA，其中的重复复序列单元则则称为“小卫卫星DNA”“小卫星”具具有高度的可可变性，但在在“小卫星DNA“中有一小段序序列则在所有有个体中都一一样，称为““核心序列””。如果把核核心序列串联联起来作为分分子探针与不不同个体的DNA进行分子杂杂交，就会会出现各自自特有的杂杂交图谱。。它们与人人的指纹一一样具有专专一性和特特异性，因因此称作““DNA指纹”通过对人类类基因组的的解析，发发现人与人人之间99．99％的碱基序序列都相同同，而剩下下的0.01%的碱基特征征序列则来来自于双亲亲，据此可可用于“亲亲子鉴定””所罗罗门门的的审审判判：：大家家都都听听说说过过所所罗罗门门的的审审判判这这样样一一件件故故事事：：两位位妇妇人人都都声声称称自自己己是是孩孩子子的的母母亲亲，，于于是是所罗罗门门就就命命令令一一名名侍侍卫卫把把那那个个孩孩子子带带来来，，要要用用剑剑将将其其辟成成两两半半分分给给他他们们两两，，结果果假假母母亲亲同同意意所所罗罗门的的判判决决，，而而孩孩子子真真正的的母母亲亲却却恳恳求求侍侍卫卫饶了了孩孩子子的的性性命命，，她她解释释说说：：““把把孩孩子子给给了了假母母亲亲，，总总比比让让孩孩子子惨死死好好。。””当当然然，，真真假假母母亲亲也也就就水水落落石石出出了了。滴骨骨验验亲亲法法：：以生生者者的的血血滴滴在在尸尸骨骨上上，，观观察察血血能能否否浸浸入入骨骨内内，，浸浸入入的的则则被被认认为为两两者者有有血血缘缘关关系系，，在在各各种种古古籍籍中中有有多多种种记记录录。。三国国时时代代（（公公园园220—280年）谢谢承著著《会稽先先贤传传》中的《以弟血血滴兄兄骨》可能是是记录录此法法的最最早的的史料料：陈陈业的的哥哥哥因海海难不不幸殒殒命，，当时时一同同遇难难的有有五六六十人人，并并且尸尸体都都已严严重腐腐败而而无法法辨认认死者者的身身份。。陈业业就用用刀刺刺破自自己的的手臂臂将血血分别别滴在在尸骨骨上，，发现现其血血液只只能浸浸入一一具尸尸骨，，其余余皆不不能。。陈业业就这这样确确认其其兄的的尸骨骨。合血法法：等到了了明代代，更更是采采用了了“合合血法法”来来识别别亲权权。明明末清清初的的检验验书籍籍中都都有相相同的的记载载：““亲子子兄弟弟或自自幼分分离，，欲相相认识识。难难辨真真伪。。命各各刺出出血，，滴一一器内内，真真则共共凝为为一，，否则则不凝凝也。。”方法：：DNA指纹是是指对对待测测样品品中的的DNA进行分分析所所得到到的具具有特特征性性的DNA分子杂杂交图图谱DNA酶解电电泳泳转转膜杂杂交最常用用的DNA探针是是微卫卫星序序列受害者血样犯罪嫌疑人衣物上血样犯罪嫌疑人血样第四节节遗遗传性性疾病病的分分子诊诊断技技术直接诊诊断点突变变间接诊诊断多态性性连锁锁分析析美国前前副总总统汉汉弗莱莱<Humphrey)在1967年发现现膀胱胱内有有一肿肿物，，病理理切片片未发发现癌癌细胞胞良性“慢性增生生性囊肿肿”，未进进行手术术治疗。。九年后，，他被诊诊断为患患有“膀胧癌”，两年后后死于该该病。1994年，研究究者用灵灵敏的PCR技术对上上述汉弗弗莱1967年的病理理切片进进行了P53抑癌基因因检查，，发现那那时的组组织细胞胞虽然在在形态上上还没有有表现出出恶性变变化，但但其P53基因的第第227个密码子已经发生生了一个个核苷酸酸的突变变。就是是这个基基因的微微小变化化，使其其抑癌功功能受损损，导致致九年后后细胞癌癌变的发发生。这这说明，，在典型型症状出出现之前前的很长长时间，，细胞癌癌变的信信息已经经在基因因上表现现出来了了P53抑癌基因因遗传性疾疾病的分分子诊断断技术PCR－酶解鉴鉴定PCR／OLA鉴定PCR-ELISA检测PCR-DGGE鉴定扩增阻滞滞突变系系统（amplificationrefractorymutationsystem,ARMS）连接酶链链反应（（LCR）镰刀形细胞胞贫血症(sickle-cellanemia)典型的单基基因遗传性性疾病血红蛋白的的β链（β珠蛋白）的的第六个氨氨基酸Glu发生突变成成Val血红蛋白-链上谷氨酸变成缬氨酸英国女王维维多利亚。。她带有血友病基因因，并将其传传给了她的的儿女。血血友病是一一种遗传性性凝血障碍碍疾病，患患者可能因因很小的伤伤口而出血血不止导致致死亡。血血友病在女女性一般表表现为隐性性遗传，较较少发病，，但会传给给后代；在在男性则表表现为显性性遗传，显显示出病症症。维多利利亚女王在在科堡主持持的一次欧欧洲王室成成员集会，，与会者有有17人是她的后后裔，其中中有她的孙孙女亚历山山德拉（21），她同俄俄国沙皇尼尼古拉二世世结婚，导导致他们的的儿子患有有血友病。。

血友病基因一、PCR－酶解鉴定定正常基因为为CCTGAGG镰刀形贫血血病患者的的基因为CCTGTGG限制性内切切酶CvnI的识别序列列为CCTNAGG方法:在CvnI位点的两点点设计两个个引物;包含CvnI位点区域的的DNA片段通过PCR扩增出来;扩增的DNA用CvnI酶处理，酶酶解产物用用凝胶电泳泳分开，经经溴化乙锭锭染色后就就可在紫外外灯下检查查DNA带型。38225620118188条带大小(bp)正常纯合子杂合子突变纯合子CvuI处理CvuICvuICvuI256bp201bp181bp88bpCvuICvuI256bp382bp88bp正常情况镰刀形细胞胞贫血症PCR扩增引物1引物2PCR产物（长726bp）二、PCR/OLA鉴定OLA(oligo-nucleotideligationassay),寡聚核苷酸酸连接分析析假定一个正正常的基因因在一个特特定的位置置发生了突突变，比如如说150位的T突变为G根据150位两边的序序列，人工工合成两段段短的核苷苷酸链，使使这两段寡寡聚核苷酸酸链与基因因的一条链链互补探针X：寡聚核苷苷酸链的3’端最后一个个核苷酸正正好与正常常基因的150位的的核苷苷酸配对探针Y：另一段寡寡聚核苷酸酸链的5’端第一个核核苷酸与151位的核苷酸酸配对正常基因探针X3’端最后一个核苷酸就不会与目的基因150位的核苷酸配对由于3’最后一个核苷酸不配对而使两个探针无法实现连接目的基因突变两探针与目的基因的完美配对两个探针就可连接起来加入DNA连接酶B150151DBD150151BXY150151DBD双链目的DNA或PCR产物热变性单链目的DNA或PCR产物加探针退火火完全配对模板有突变变,不完全配对对连接酶连接酶加入链霉抗抗生物素蛋蛋白加入链霉抗抗生物素蛋蛋白BDB加入碱性磷磷酸酶加入无色底底物加入碱性磷磷酸酶加入无色底底物BDAP变色无色底物有色底物B保持无色无色底物PCR/OLA分析程序示示意图例：特异性性互补寡核核苷酸法检检测镰状红红细胞贫血血症（1）提取DNA，热处理成成为单链DNA；（2）以单链DNA为模板，仅仅对可能发发生突变的的核苷酸区区域设计引引物进行PCR扩增后转移移到滤膜上上，热变性性成单链；；（3）分别用两两种特异性性互补寡核核苷酸分子子探针（ASO）杂交。三、PCR-ELISA检测在PCR反应体系中中加入生物物素标记的的dUTP和其他3种dNTP3’端经DIG标记特异性性探针包被有抗生生物素抗体体的酶标板板抗碱性磷酸酸酶（AP）－－DIG抗体体如果果加加入入的的DIG标记记的的探探针针可可与与扩扩增增片片段段结结合合，，则则酶酶标标板板上上有有颜颜色色反反应应发发生生，，否否则则不不会会有有颜颜色色的的变变化化四、PCR-DGGE法原理变性梯度凝胶胶电泳（DGGE）是一种根据据DNA片段的熔解性性质而使之分分离的凝胶系系统Tm值主要取决于于DNA分子中GC含量的多少DGGE将凝胶设置在在双重变性条条件下：温度度50~60℃℃，变性剂0~100%当一双链DNA片段通过一变变性剂浓度呈呈梯度增加的的凝胶时，此此片段迁移至至某一点变性性剂浓度恰好好相当于此段段DNA的低熔点区的的Tm值，此区便开开始熔解，而而高熔点区仍仍为双链原理同样长度但序序列不同的DNA片段会在胶中中不同位置处处达到各自最最低解链区域域的解链温度度，部分解链链的DNA片段在胶中的的迁移速率急急剧降低，形形成相互分开开的条带图谱谱不同DNA片段的序列差差异发生在最最高的解链区区域时，这些些片段就不能能被区分，则则人为地加入入一个高熔点点区——GC夹，即在一侧侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，使相应应的感兴趣的的序列处于低低熔点区而便便于分析突变型野生型杂合型五、扩增阻滞滞突变系统等位基因特异异性扩增原理Taq缺乏3’→5’’外切酶活性，，如果引物的的3’端不能与模板板DNA严格互补配对对，模板DNA就不能有效的的扩增5’TACATTAGGTT3’3’TAATCCAA5’PCR反应继续5’TACCTTAGGTT3’AATCCAA5’PCR反应终止3’T5’TACATTAGGTT3’AATCCAA5’PCR反应终止3’G5’TACCTTAGGTT3’3’GAATCCAA5’PCR反应继续野生型序列突变序列野生型引物突变引物ARMS原理示意图野生型DNAATT3’引物3发红光CGT3’引物3无法扩增没有荧光AARMS检测突变体举举例纯合突变体DNACGG3’引物3发绿光ATG3’引物3无法扩增没有有荧光BARMS检测突变体举举例杂合突变体DNAAGT3’引物3G发黄光CARMS检测突变体举举例TC引物1引物2GT六、连连接酶酶链反反应基本原原理利用DNA连接酶酶特异异地将将双链链DNA片段连连接，，经变变性-退火-连接三三步骤骤反复复循环环，从从而使使靶基基因序序列大大量扩扩增设计两两对分分别互互补的的引物物，引引物与与之互互补的的模板板DNA结合并并留下下一缺缺口，，如果果与靶靶序列列杂交交的相相邻的的寡核核苷酸酸引物物与靶靶序列列完全全互补补，DNA连接酶酶即可可连接接封闭闭这一一缺口口，则则LCR反应的的三步步骤(变性-退火-连接)就能反反复进进行，，若连连接处处的靶靶序列列有点点突变变，引引物不不能与与靶序序列精精确结结合，，缺口口附近近核苷苷酸的的空间间结构构发生生变化化，连连接反反应不不能进进行，，也就就不能能形成成连接接产物物第五节节基基因工工程疫疫苗一、疫疫苗的的简介介二、基基因工工程疫疫苗1、亚单单位疫疫苗2、肽基基疫苗苗3、DNA疫苗一、疫疫苗的的简介介DrEdwardJener（1796）：用一种种奶牛牛痘感感染人人类，，感染染后不不再被被天花花感染染LouisPasteur（19世纪末末）：：研制成成功狂狂犬疫疫苗VonBehring＆KitasatoShibasaburo：开发研研制白白喉/破伤风风疫苗苗医学上上最有有潜力力的防防御物物质灭活的的和减减毒的的致病病物质质不能丧丧失引引起免免疫反反应的的能力力麻疹、、白喉喉、百百日咳咳、破破伤风风、天天花、、脊髓髓灰质质炎传统疫疫苗的的局限限性①有些些致病病物无无法在在培养养基上上生长长；②动物物和人人类的的病毒毒需要要在动动物细细胞中中培养养；③培养养的动动物和和人类类病毒毒其生生长速速度和和产量量一般般都很很低；；④需要要对实实验室室以及及参加加实验验的操操作人人员采采取特特殊的的保护护措施施；⑤疫苗苗中的的致病病物质质在疫疫苗生生产过过程中中又可可能没没有完完全杀杀死或或充分分减毒毒；⑥减毒毒菌株株有可可能发发生突突变；；⑦有些些疾病病（如如艾滋滋病））用传传统的的疫苗苗防治治收效效甚微微；⑧绝大大多数数的现现行疫疫苗的的有效效期短短。衡量疫疫苗能能否投投入使使用的的标准准——安全性性删除致致病基基因，，保留留抗原原性。。——有效性性尽可能能调动动机体体细胞胞免疫疫和体体液免免疫。。免疫系系统的的工作作机制制：体液免免疫、、细胞胞免疫疫抗原抗原肽肽细胞表表面复复合物物活化的的B细胞（（浆细细胞））淋巴因因子活化的的T细胞抗体杀灭抗抗原分分子抗原显显示细细胞（（如树树状细细胞）吞噬，，分解解MHC蛋白质质识别、、激活活杀伤T细胞激活释释放激活分泌体液免免疫细胞免免疫二、基基因工工程疫疫苗指用基基因工工程的的方法法，