临床生化方法学评价课件

临床生化方法学评价临床生化方法学评价1一、与方法学评价有关的几个名词1、真值：采用一组最可靠的参考方法测得的近似真实的数值。2、定值：标定的质控材料的已知值。一、与方法学评价有关的几个名词1、真值：23、准确度：指测定结果与真值接近的程度。测定的是不准确度，即重复测定的均值与真值之差，即系统误差，用偏差系数CB表示。CB=真值－X真值×100一般CB﹤5％3、准确度：CB=真值－X真值×100一般CB﹤5％34、精密度：指对同一样品重复分析的结果间的符合性。测定的是不精密度，代表随机误差，用标准差(SD)或变异系数(CV)表示。SD=∑(Xi－X)2N－1CV%＝SDX×100一般CV﹤5％4、精密度：SD=∑(Xi－X)2N－1CV%＝SDX×145、特异性：指只对待测物质起反应，不与其他结构类似的物质反应。如：血糖测定的四种方法：6、干扰：指标本中存在某些本身不与分析试剂反应的物质，但却可使待测物测定值偏高或偏低。但目前又提出：特异性用干扰试验评价。5、特异性：57、决定性方法：指经过彻底研究未发现任何不精密和不准确因素的方法，准确度最高，系统误差最小，测定结果为“确定值”，与“真值”最接近。只用于发展及评价参考方法和一级标准品。8、参考方法：指经过充分证实认为精密度与准确度稍低于决定性方法，其各种轻度干扰因素为已知的分析方法。用于鉴定常规方法与二级标准品，及为质控血清定值，评价商品试剂盒。7、决定性方法：69、常规方法：指性能指标符合临床或其它目的需要，有适当的分析范围，而且经济适用的分析方法。常规方法在做出评价后，经有关学术组织认可，可以作为推荐方法。9、常规方法：710、医学决定水平：又称医学决定性浓度，指在诊断及治疗工作中，对决定疾病诊断或治疗起关键性作用的某一被测成分的浓度。如：血糖：2.86.78.916.8mmol/L低血糖空腹DM糖耐量高血糖11、检出限：指能与适当的“空白”读数相区别的待测物的最小量。10、医学决定水平：812、误差：

定义：指测定值与真值或定值的不符合性。

分类：

(1)系统误差(SE)：

恒定系统误差(CE)：误差大小与被测物浓度无关。

比例系统误差(PE)：误差大小与被测物浓度有关。

(2)偶然误差/随机误差(RE)

允许误差

12、误差：9系统误差：

定义：指一系列测定结果与真值或靶值相比存在同一倾向的偏离。

特点：重复检验时，按一定规律重复出现，增加测定次数不可消除，但改进方法等可以校正。表示不准确度。

主要见于：方法误差仪器、试剂误差

系统误差：10偶然误差：

定义：指以偶然的和不可预料的方式出现的不易测定的偏差。

特点：误差的大小或正负相等，在均数两侧对称分布，增加测定次数可以减小，可以控制在一定范围内，但不可避免。表示不精密度。

主要见于：操作误差方法的线性范围不够宽实验条件随机改变

注：引起SE与RE的因素是相对的。允许误差：一般定义为X±1.96SD范围内，即95％可信限以内。偶然误差：11临床生化方法的选择1、选择要求：由国际临床化学协会(IFCC)提出①实用性：快速、微量费用低廉方法简便安全可靠②可靠性：精密度准确度与特异性检测能力临床生化方法的选择1、选择要求：由国际临床化学协会(IFCC12临床生化方法的选择2、选择步骤：

①查阅文献，选择适宜本实验室的方法②选定候选方法：考虑仪器、试剂、参考物、费用、效益等，确定候选方法。③初步实验：A.标准曲线及重复性实验B.质控血清或新鲜标本的重复试验C.与参考方法比较，分析待测物浓度不同的标本D.要有足够的试验证明仪器与试剂能符合要求临床生化方法的选择2、选择步骤：13评价实验

一、评价实验的内容与过程：1、评价前实验：包括候选方法最适条件的研究，如：试剂浓度、缓冲液种类、离子强度及PH、标本与试剂体积比，温度与时间，吸收曲线与波长，线性范围等。现采用特征曲线表面方法学(RSM)，利用二次回归正交设计的原理，减少了测定次数。2、初步评价实验：批内与天内重复性，回收实验、干扰试验。3、最后评价实验：天间重复性、方法比较试验，根据误差结果判断方法可否接受。4、评价后实验：临床相关研究，如确定参考值，特殊病人标本的测定。5、方法应用：QC等。评价实验

一、评价实验的内容与过程：1、评价前实验：包括候选14评价实验与分析误差类型的关系分析误差的类型评价实验

初步评价

最后评价偶然误差(RE)批内/天内重复性天间重复性恒定误差(CE)干扰与比较方法对比比例误差(PE)回收评价实验与分析误差类型的关系分析误差15三、评价实验重复性试验回收试验干扰试验方法比较试验检测能力测定三、评价实验重复性试验16（一）重复性试验1、定义：对同一材料分成数份试验样品，进行多次分析测定。2、目的：考察RE。3、形式与方法：

批内重复性实验天内重复性实验天间重复性实验病人标本的平行双份测定4、分析样品的选择：标准液：作批内重复性，简便稳定，代表最好的重复性。冻干质控血清：作天间重复性，稳定、方便。

病人标本：混合血清：5、分析物浓度的选择：医学决定水平。（一）重复性试验1、定义：17（二）回收试验1、定义：分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。2、目的：测定PE，衡量准确度。3、方法：分析样品：病人样品＋被分析物的纯品标准液基础样品：病人样品＋相同量的无分析物的溶剂两样品测定结果之差为回收量。再求回收率。（二）回收试验1、定义：分析方法正确测定加入常规分析样品中的18回收率计算，以测定血清钙为例：(1)样品制备：①基础样品：血清2ml＋蒸馏水0.1ml②分析样品：血清2ml＋4mmol/L钙标准液0.1ml③分析样品：血清2ml＋25mmol/L钙标准液0.1ml(2)计算公式及计算结果：加入浓度=标准液浓度×标准液量(ml)血清量(ml)+标准液量(ml)回收浓度=分析样品测得浓度－基础样品测得浓度

回收率(%)=

回收浓度加入浓度×100%回收率计算，以测定血清钙为例：(1)样品制备：加入浓度=标准19血清钙回收试验结果测得浓度(mmol/L)加入浓度(mmol/L)回收浓度(mmol/L)回收率(%)①1.70－－－－－－②1.880.190.1894.7③2.851.191.1596.6平均95.7血清钙回收试验结果测得浓度(mmol/L)加入浓度回收浓度回204、回收试验注意事项：①准确吸量②作高、中、低三个浓度（线性范围内）的回收实验，计算平均回收率。③分析样品终浓度最好达医学决定水平。④加入标准液的体积要在10％以内。⑤一般标准液浓度比欲增加的浓度至少高10倍。⑥最好重复测定几次。⑦病人样品数视具体情况而定。⑧最好同时用对比方法测回收。4、回收试验注意事项：21（三）干扰试验1、目的：衡量准确度。加入一定浓度的干扰物则形成CE，干扰物浓度不同则误差大小不同，但与被分析物的浓度无关。2、方法：分析样品：病人样品＋疑有干扰或非特异性反应的物质。基础样品：病人样品＋相同量的无干扰或非特异性反应物质的溶剂测定两样品，结果之差即干扰值。3、完整的干扰试验包括：初筛试验：确定有无干扰干扰程度的定量（三）干扰试验1、目的：衡量准确度。加入一定浓度的干扰物则形224、可疑干扰物的浓度：须达到临床有价值的范围，有可能应达到病理标本的最高浓度值。确定有干扰后，应求得最低可疑物浓度值。5、可疑干扰物：Bil溶血（Hb、血细胞组分）脂血防腐剂抗凝剂药物4、可疑干扰物的浓度：236、消除干扰的方法：①作空白（对照）试验：试剂空白标本空白②采用各种物理、化学的方法，分离除去干扰物③双波长或多波长检测6、消除干扰的方法：24（四）方法比较试验1、目的：考察SE(CE+PE），以考察候选方法是否可被接受的措施之一。2、方法：对一组病人的标本用候选方法和对比方法同时测定，最后观察二者之间的差异。3、比较方法的选择：在临床生化常规方法的评价时，最好选参考方法。（四）方法比较试验1、目的：考察SE(CE+PE），以考察候254、注意事项：

①试验样品数：多于40②重要分析：每个样品最好各测2次，分两批进行，要在一天内，最好4h内。两批操作中，样品顺序重排，空白、标准重做。③实验的时间间隔：每天2～5个样品，约测20天。④统计处理：配对t检验相关与回归分析：y=a+bx(a:CE,b:PE,r:两法相关性是否密切)4、注意事项：26以GOD-POD法为例，探讨其方法学评价过程1、试剂配方的选择：

①GOD浓度：

选用180mg/dlGlu溶液作底物溶液。GOD浓度：0.5，1，1.5，2，3，4，20u/ml

A0.30.20.110203040min(1.5,2,3,4u/ml)1u/ml0.5u/ml选2u/mlGOD，10min达终点（6min达终点）以GOD-POD法为例，探讨其方法学评价过程1、试剂配方的选27②POD浓度：底物浓度：180mg/dlGlu溶液400mg/dlGlu溶液POD浓度：0.025，0.15，0.3，1mg/dl0.15，0.3，1mg/dl0.025mg/dlA0.30.20.1102030405060min选A更高的0.3mg/dl浓度②POD浓度：0.15，0.3，1mg/dl0.025mg/28③4-AA浓度：底物同上，4-AA为3，5，8mg/dl。

4-AA浓度15’A20’A40’A60’A30.330.3280.3280.32850.3270.3270.3270.32780.3250.3250.3250.325反应结果一致，故选用5mg/dl③4-AA浓度：4-AA浓度15’A20’A40’A60’A29④酚浓度：

底物浓度同上，酚浓度为15，25，50，75，100mg/dl。

酚浓度15’A20’A40’A60’A150.3100.3100.3100.310250.3200.3200.3200.32050～1000.3250.3250.3250.325选用50mg/dl④酚浓度：底物浓度同上，酚浓度为15，25，50，75，1302、干扰物质对血糖的影响干扰物血清中干扰物浓度(mg/dl)血糖(mg/dl)血清092.6血清＋草酸钾80092.6血清＋肝素4092.0血清＋NaF80092.6血清＋H2O0100.6血清＋Hb100100.0血清＋Bil507100.0血清＋UA10101.7血清＋VitC1095.4血清＋水杨酸钠10101.1一般认为加入干扰物后血糖测定结果不超过原测定值的±5mg/dl可认为无干扰2、干扰物质对血糖的影响干扰物血清中干扰物浓度(mg/dl)313、实验条件的选择①保温时间及呈色后的稳定性:(37℃)A0.30.20.1204060minGlu180mg/dlGlu90mg/dl3、实验条件的选择①保温时间及呈色后的稳定性:(37℃)A32②PH的影响：

PH＝7.0±0.1最好③温度的影响：图形同上④标本的采集及处理：

取血后应在20～30min内分离血清，含糖量可在6h内不变。②PH的影响：PH＝7.0±0.1最好③温度的影响：图334、评价实验：①准确性：

Ⅰ.与参考方法HK法比较：本法(X)20份结果：x=126.9mg/dlHK法(y)20份结果：x=126.8mg/dly=8.5+0.931xr=0.998

Ⅱ.回收试验：结果见下表，回收率在96～105％，均值为99％。4、评价实验：①准确性：34原血浆值(mg/dl)加入量(mg/dl)实测值(mg/dl)回收率(%)71.41515.81053029.8994544986060.1100.29086.896135133.299180176.598原血浆值加入量实测值(mg/dl)回收率(%)71.415135②精密度试验：用标准液试验用血清试验③线性范围：糖浓度在45～450mg/dl呈线性②精密度试验：用标准液试验③线性范围：36④与其他方法比较：

同时测20份结果。试验方法均值(mg/dl)r回归方程本法126.9试剂盒该法127.10.999Y=1+0.994x试剂盒O-T法125.50.998Y=3+0.966x本室O-T法126.70.998Y=4.87+0.96x④与其他方法比较：同时测20份结果。试验方法均值r回归方程37临床生化方法学评价临床生化方法学评价38一、与方法学评价有关的几个名词1、真值：采用一组最可靠的参考方法测得的近似真实的数值。2、定值：标定的质控材料的已知值。一、与方法学评价有关的几个名词1、真值：393、准确度：指测定结果与真值接近的程度。测定的是不准确度，即重复测定的均值与真值之差，即系统误差，用偏差系数CB表示。CB=真值－X真值×100一般CB﹤5％3、准确度：CB=真值－X真值×100一般CB﹤5％404、精密度：指对同一样品重复分析的结果间的符合性。测定的是不精密度，代表随机误差，用标准差(SD)或变异系数(CV)表示。SD=∑(Xi－X)2N－1CV%＝SDX×100一般CV﹤5％4、精密度：SD=∑(Xi－X)2N－1CV%＝SDX×1415、特异性：指只对待测物质起反应，不与其他结构类似的物质反应。如：血糖测定的四种方法：6、干扰：指标本中存在某些本身不与分析试剂反应的物质，但却可使待测物测定值偏高或偏低。但目前又提出：特异性用干扰试验评价。5、特异性：427、决定性方法：指经过彻底研究未发现任何不精密和不准确因素的方法，准确度最高，系统误差最小，测定结果为“确定值”，与“真值”最接近。只用于发展及评价参考方法和一级标准品。8、参考方法：指经过充分证实认为精密度与准确度稍低于决定性方法，其各种轻度干扰因素为已知的分析方法。用于鉴定常规方法与二级标准品，及为质控血清定值，评价商品试剂盒。7、决定性方法：439、常规方法：指性能指标符合临床或其它目的需要，有适当的分析范围，而且经济适用的分析方法。常规方法在做出评价后，经有关学术组织认可，可以作为推荐方法。9、常规方法：4410、医学决定水平：又称医学决定性浓度，指在诊断及治疗工作中，对决定疾病诊断或治疗起关键性作用的某一被测成分的浓度。如：血糖：2.86.78.916.8mmol/L低血糖空腹DM糖耐量高血糖11、检出限：指能与适当的“空白”读数相区别的待测物的最小量。10、医学决定水平：4512、误差：

定义：指测定值与真值或定值的不符合性。

分类：

(1)系统误差(SE)：

恒定系统误差(CE)：误差大小与被测物浓度无关。

比例系统误差(PE)：误差大小与被测物浓度有关。

(2)偶然误差/随机误差(RE)

允许误差

12、误差：46系统误差：

定义：指一系列测定结果与真值或靶值相比存在同一倾向的偏离。

特点：重复检验时，按一定规律重复出现，增加测定次数不可消除，但改进方法等可以校正。表示不准确度。

主要见于：方法误差仪器、试剂误差

系统误差：47偶然误差：

定义：指以偶然的和不可预料的方式出现的不易测定的偏差。

特点：误差的大小或正负相等，在均数两侧对称分布，增加测定次数可以减小，可以控制在一定范围内，但不可避免。表示不精密度。

主要见于：操作误差方法的线性范围不够宽实验条件随机改变

注：引起SE与RE的因素是相对的。允许误差：一般定义为X±1.96SD范围内，即95％可信限以内。偶然误差：48临床生化方法的选择1、选择要求：由国际临床化学协会(IFCC)提出①实用性：快速、微量费用低廉方法简便安全可靠②可靠性：精密度准确度与特异性检测能力临床生化方法的选择1、选择要求：由国际临床化学协会(IFCC49临床生化方法的选择2、选择步骤：

①查阅文献，选择适宜本实验室的方法②选定候选方法：考虑仪器、试剂、参考物、费用、效益等，确定候选方法。③初步实验：A.标准曲线及重复性实验B.质控血清或新鲜标本的重复试验C.与参考方法比较，分析待测物浓度不同的标本D.要有足够的试验证明仪器与试剂能符合要求临床生化方法的选择2、选择步骤：50评价实验

一、评价实验的内容与过程：1、评价前实验：包括候选方法最适条件的研究，如：试剂浓度、缓冲液种类、离子强度及PH、标本与试剂体积比，温度与时间，吸收曲线与波长，线性范围等。现采用特征曲线表面方法学(RSM)，利用二次回归正交设计的原理，减少了测定次数。2、初步评价实验：批内与天内重复性，回收实验、干扰试验。3、最后评价实验：天间重复性、方法比较试验，根据误差结果判断方法可否接受。4、评价后实验：临床相关研究，如确定参考值，特殊病人标本的测定。5、方法应用：QC等。评价实验

一、评价实验的内容与过程：1、评价前实验：包括候选51评价实验与分析误差类型的关系分析误差的类型评价实验

初步评价

最后评价偶然误差(RE)批内/天内重复性天间重复性恒定误差(CE)干扰与比较方法对比比例误差(PE)回收评价实验与分析误差类型的关系分析误差52三、评价实验重复性试验回收试验干扰试验方法比较试验检测能力测定三、评价实验重复性试验53（一）重复性试验1、定义：对同一材料分成数份试验样品，进行多次分析测定。2、目的：考察RE。3、形式与方法：

批内重复性实验天内重复性实验天间重复性实验病人标本的平行双份测定4、分析样品的选择：标准液：作批内重复性，简便稳定，代表最好的重复性。冻干质控血清：作天间重复性，稳定、方便。

病人标本：混合血清：5、分析物浓度的选择：医学决定水平。（一）重复性试验1、定义：54（二）回收试验1、定义：分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。2、目的：测定PE，衡量准确度。3、方法：分析样品：病人样品＋被分析物的纯品标准液基础样品：病人样品＋相同量的无分析物的溶剂两样品测定结果之差为回收量。再求回收率。（二）回收试验1、定义：分析方法正确测定加入常规分析样品中的55回收率计算，以测定血清钙为例：(1)样品制备：①基础样品：血清2ml＋蒸馏水0.1ml②分析样品：血清2ml＋4mmol/L钙标准液0.1ml③分析样品：血清2ml＋25mmol/L钙标准液0.1ml(2)计算公式及计算结果：加入浓度=标准液浓度×标准液量(ml)血清量(ml)+标准液量(ml)回收浓度=分析样品测得浓度－基础样品测得浓度

回收率(%)=

回收浓度加入浓度×100%回收率计算，以测定血清钙为例：(1)样品制备：加入浓度=标准56血清钙回收试验结果测得浓度(mmol/L)加入浓度(mmol/L)回收浓度(mmol/L)回收率(%)①1.70－－－－－－②1.880.190.1894.7③2.851.191.1596.6平均95.7血清钙回收试验结果测得浓度(mmol/L)加入浓度回收浓度回574、回收试验注意事项：①准确吸量②作高、中、低三个浓度（线性范围内）的回收实验，计算平均回收率。③分析样品终浓度最好达医学决定水平。④加入标准液的体积要在10％以内。⑤一般标准液浓度比欲增加的浓度至少高10倍。⑥最好重复测定几次。⑦病人样品数视具体情况而定。⑧最好同时用对比方法测回收。4、回收试验注意事项：58（三）干扰试验1、目的：衡量准确度。加入一定浓度的干扰物则形成CE，干扰物浓度不同则误差大小不同，但与被分析物的浓度无关。2、方法：分析样品：病人样品＋疑有干扰或非特异性反应的物质。基础样品：病人样品＋相同量的无干扰或非特异性反应物质的溶剂测定两样品，结果之差即干扰值。3、完整的干扰试验包括：初筛试验：确定有无干扰干扰程度的定量（三）干扰试验1、目的：衡量准确度。加入一定浓度的干扰物则形594、可疑干扰物的浓度：须达到临床有价值的范围，有可能应达到病理标本的最高浓度值。确定有干扰后，应求得最低可疑物浓度值。5、可疑干扰物：Bil溶血（Hb、血细胞组分）脂血防腐剂抗凝剂药物4、可疑干扰物的浓度：606、消除干扰的方法：①作空白（对照）试验：试剂空白标本空白②采用各种物理、化学的方法，分离除去干扰物③双波长或多波长检测6、消除干扰的方法：61（四）方法比较试验1、目的：考察SE(CE+PE），以考察候选方法是否可被接受的措施之一。2、方法：对一组病人的标本用候选方法和对比方法同时测定，最后观察二者之间的差异。3、比较方法的选择：在临床生化常规方法的评价时，最好选参考方法。（四）方法比较试验1、目的：考察SE(CE+PE），以考察候624、注意事项：

①试验样品数：多于40②重要分析：每个样品最好各测2次，分两批进行，要在一天内，最好4h内。两批操作中，样品顺序重排，空白、标准重做。③实验的时间间隔：每天2～5个样品，约测20天。④统计处理：配对t检验相关与回归分析：y=a+bx(a:CE,b:PE,r:两法相关性是否密切)4、注意事项：63以GOD-POD法为例，探讨其方法学评价过程1、试剂配方的选择：

①GOD浓度：

选用180mg/dlGlu溶液作底物溶液。GOD浓度：0.5，1，1.5，2，3，4，20u/ml

A0.30.20.110203040min(1.5,2,3,4u/ml)1u/ml0.5u/ml选2u/mlGOD，10min达终点（6min达终点）以GOD-POD法为例，探讨其方法学评价过程1、试剂配方的选64②POD浓度：底物浓度：180mg/dlGlu溶液400mg/dlGlu溶液POD浓度：0.025，0.15，0.3，1mg/dl0.15，0.3，1mg/dl0.025mg/dlA0.30.20.1102030405060min选A更高的0.3mg/dl浓度②POD浓度：0.15，0.3，1mg/dl0.025mg/65③4-AA浓度：底物同上，4-AA为3，5，8mg/dl。

4-AA浓度15’A20’A40’A60’A30.330.3280.3280.32850.3270.3270.3270.32780.3250.3250.3250.325反应结果一致，故选用5mg/dl③4-AA浓度：4-AA浓度15’A20’A40’A60’A66④酚浓度：

底物浓度同上，酚浓度为15，25，50，