基因芯片PGDPGS技术的临床应用课件

基因芯片PGD/PGS技术的临床应用基因芯片PGD/PGS技术的临床应用1染色体微阵列分析技术（CMA）胚胎植入前遗传学诊断和筛查（PGD/PGS）微阵列PGD/PGS的临床应用染色体微阵列分析技术（CMA）2染色体微阵列分析技术Chromosomemicroarray,CMA染色体微阵列分析技术3染色体微阵列分析(CMA)将已知序列的基因探针集成在平面基质载体上，形成密集、有序的DNA分子微阵列样本DNA荧光标记与芯片上所含的基因序列进行杂交通过扫描荧光信号的强度，检测样本基因表达情况。荧光信号强度与基因拷贝数正相关染色体微阵列分析(CMA)将已知序列的基因探针集成在平面基4临床生殖遗传学检测技术GBandFISHaCGH、aSNPCMA临床生殖遗传学检测技术GBandFISHaCGH、aSNP5

微阵列比较基因组杂交技术（aCGH）Microarraycomparativegenomichybridization

微阵列单核苷酸多态性分析技术（aSNP）Singlenucleotidepolymorphismarray高通量、微型化、集约化及标准化可对相关基因精确定位，能够快速全面地分析染色体结构与数目的异常染色体微阵列分析(CMA)微阵列比较基因组杂交技术（aCGH）高通量、微型化、集约化6微阵列比较基因组杂交（aCGH）6400个杂交位点微阵列比较基因组杂交（aCGH）6400个杂交位点7微阵列比较基因组杂交（aCGH）优点：同时检测46条染色体非整倍性分辨0.5Mb以上的染色体结构异常新鲜胚胎移植，无需冷冻胚胎缺点：不能检测出染色体平衡易位亲代染色体异常复发性流产、反复胚胎着床失败女方年龄≥35岁不孕症患者伴性遗传适应症：微阵列比较基因组杂交（aCGH）优点：同时检测46条染色体非82009年9月，世界上首例使用aCGH-PGS筛选诞生的婴儿Fisheletal.FertilSteril2010aCGH-PGS的临床应用卵母细胞检测2009年9月，世界上首例使用aCGH-PGS筛选诞生的婴儿9微阵列单核苷酸多态性分析（aSNP）1MakeamplifiedDNAGENOMICDNA(200-400ng)IncubateamplifiedDNA2FragmentamplifiedDNA3Precipitate&resuspend4PrepareBeadChip5HybridizesamplesonBeadChip6GenotypeandLOH/CNanalysis9ImageBeadChip8DAY1DAY2DAY3微阵列单核苷酸多态性分析（aSNP）1Makeamplif10微阵列单核苷酸多态性分析（aSNP）优点：可以同时检测46条染色体非整倍性

可以分辨50kb以上的染色体结构异常缺点：不能检测出染色体平衡易位不能进行新鲜胚胎移植亲代染色体异常反复胚胎着床失败、复发性流产女方年龄≥35岁不孕症患者伴性遗传线粒体突变、单亲二倍体适应症：微阵列单核苷酸多态性分析（aSNP）优点：可以同时检测46条11Infact,thefirstthreebabiesbornintheworldfromtheSNPtechnologywerefromLaJollaIVF.Pleaseseetheirphotosbelow.

ThefirstthreebabiesbornintheworldfromtheSNPtechnologywerefromLaJollaIVF.CA.USAInfact,thefirstthreebabie12遗传病筛查和诊断aCGHaSNPFISH23对染色体非整倍体是是最多10-12对拷贝数变异(CNVs)是是否染色体结构不平衡~0.5Mb~0.05Mb有限的单基因病否否否线粒体突变否是否单亲二倍体否是否常用检测技术的比较微阵列检测技术遗传病筛查和诊断aCGHaSNPFISH23对染色体非整倍体胚胎植入前遗传学诊断和筛查PGD/PGS胚胎植入前遗传学诊断和筛查14PCRFISHaCGHaSNPNGS聚合酶链式反应荧光原位杂交微阵列比较基因组杂交微阵列单核苷酸多态性二代测序

胚胎植入前遗传学诊断与筛查（PGD/PGS）PCR聚合酶链式反应胚胎植入前遗传学诊断与筛查（PGD/P15JoyceC.etal.HumGenet(2012)131:175–186

胚胎植入前遗传学诊断与筛查（PGD/PGS）PGDPGS目的诊断出遗传学正常的胚胎，从而使遗传学正常的胎儿妊娠/出生染色体正常的胎儿妊娠/出生适应症单基因病、X连锁遗传、亲代染色体异常高龄、反复妊娠失败、复发性流产、严重男性不育生育力可生育不育、低生育力常用诊断技术FISH、PCR、arrayFISH、array未确诊结果的处理不移植可移植产前诊断建议与自然妊娠标准相同JoyceC.etal.HumGenet(201216PGD/PGS的适应症PGD单基因疾病：常显、常隐、X连锁染色体异常：结构、数目异常PGS染色体非整倍性异常女方年龄≥35岁、复发性流产反复胚胎植入失败、不良孕产史严重男性不育症PGD/PGS的适应症PGD单基因疾病：常显、常隐、X连锁P17微阵列PGD/PGS的临床应用微阵列PGD/PGS的临床应用18PGD单基因疾病：常显、常隐、X连锁染色体异常：结构、数目异常K.HaapaniemiKouruetal.HumanReproduction,Vol.27,No.9pp.2843–2849,2012瑞典斯德哥尔摩PGD中心1996年~2009年256对夫妇569个促排卵周期PGD单基因疾病：常显、常隐、X连锁K.Haapaniem19亲代染色体异常我国普通人群染色体异常：0.47%不孕不育患者染色体异常：3%~10%，显著增高染色体结构异常：罗氏易位、平衡易位

倒位、缺失、重复染色体数目异常：21三体（嵌合型）性染色体异常：Turner综合征XYY综合征亲代染色体异常我国普通人群染色体异常：0.47%染色体结构异20我院夫妇双方染色体G显带核型分析时间检查总例数数目异常结构异常异常占比参考值2009.12-2014.028026对186

对313对6.22%3%~10%备注：数目异常包括：Turner、Klinefelter、XYY、XXX、及其嵌合体结构异常包括：易位，倒位，缺失、重复，其中易位占结构异常的44.4%我院夫妇双方染色体G显带核型分析时间检查数目异常结构异常异常21夫妇双方染色体G显带核型分析Turner45,XOKlinefelter47,XXY数目异常夫妇双方染色体G显带核型分析Turner45,XOKli22结构异常平衡易位46,XYt(1,6)(qter;q12)罗氏易位45,XYt(13,14)(q10;q10)夫妇双方染色体G显带核型分析结构异常平衡易位罗氏易位夫妇双方染色体G显带核型分析23染色体结构异常类型正常配子携带者异常配子平衡易位1/181/1816/18罗氏易位1/61/64/6倒位1/41/42/4缺失、重复1/201/2亲代染色体结构异常染色体结构正常配子携带者异常配子平衡易位1/181/181624夫妇一方或双方染色体异常复发性流产不明原因复发性流产HelenFlynnetal。J.Obstet.Gynaecol.Res.Vol.40,No.1:109–116,January2014Chromosomalabnormalityandrepeatedmiscarriage1992.01-2011.03夫妇一方或双方染色体异常复发性流产不明原因复发性流产Hele25HelenFlynnetal。J.Obstet.Gynaecol.Res.Vol.40,No.1:109–116,January2014Thecumulativelivebirthrate总流产率55.6%HelenFlynnetal。J.Obstet.G26F.Fiorentinoetal.HumanReproduction,Vol.26,No.7pp.1925–1935,2011F.Fiorentinoetal.HumanRep27F.Fiorentinoetal.HumanReproduction,Vol.26,No.7pp.1925–1935,2011F.Fiorentinoetal.HumanRep28NathanR.Treff,etal.FertilityandSterilityVol.95,No.5,April2011NathanR.Treff,etal.Fertil29基因芯片PGDPGS技术的临床应用课件30基因芯片PGDPGS技术的临床应用课件31女方年龄≥35岁、复发性流产反复胚胎植入失败、不良孕产史严重男性不育症PGSAMA：高龄RM：复发性流产RIF：反复种植失败SMF：严重男性因素HumanReproductionUpdate,Vol.18,No.3pp.234-247,2012欧洲人类生殖与胚胎学协会PGD联盟1997~2007年57家中心超过27000个周期女方年龄≥35岁、复发性流产PGSAMA：高龄R32复发性流产（RecurrentSpontaneousAbortion,RSA）概念：与同一配偶连续发生3次或3次以上临床妊娠

流产称为复发性流产。发病率：10~15%，其中80%为早期流产病因：能够识别的仅占一半；包括免疫功能异常、内分泌异常、染色体异常、

母体生殖道异常……FrancoCausioetal,2002,Chromosomeanalysisofspontaneousabortionsafterinvitrofertilization(IVF)andintracytoplasmicsperminjection(ICSI),EuropeanJournalofObstetrics&GynecologyandReproductiveBiology复发性流产概念：与同一配偶连续发生3次或3次33免疫因素内分泌因素解剖因素遗传因素感染因素病因不明20%20%12~16%2~5%1~2%40%复发性流产病因分布免疫因素内分泌因素解剖因素遗传因素感染因素病因不明20%20胚胎染色体核型异常是RSA的常见诱因胚胎染色体核型异常是RSA的常见诱因35胚胎染色体核型异常是RSA的常见诱因635abortedproducts：normalkaryotypeswere44.9%(n=285;euploid280,translocation5)abnormalkaryotypeswere55.1%(n=350;trisomy199,doubletrisomy22,monosomy25,polyploidy38,tetraploidy9,derivativeoftranslocation34,others23)胚胎染色体核型异常是RSA的常见诱因635aborted36PereMiretal.JAssistReprodGenet(2013)30:143–149ClinicaloutcomeafteraCGH-PGSPereMiretal.JAssistRepro37aCGH-PGS技术在我中心的应用①连续发生3次或3次以上自然流产，且妊娠时间<12周②夫妇双方染色体核型正常③女方催乳素、卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇、孕酮、睾

酮等水平正常，无内分泌疾病史④盆腔超声、子宫输卵管造影排除生殖道器质性病变⑤宫颈分泌物检查排除沙眼衣原体、解脲支原体感染，TORCH

检查排除近期感染⑥自身抗体检测为阴性⑦男方精液常规检查正常或治疗后恢复正常复发性流产患者PGS纳入条件aCGH-PGS技术在我中心的应用①连续发生3次或3次以上38患者指征复发性流产筛查周期31个芯片检测卵裂球数202个正常胚胎53个（26.24%）异常胚胎145个（71.78%）筛查失败4个（1.98%）移植周期24个临床妊娠16例临床妊娠率66.67%（16/24）早期流产率6.25%（1/16）截止2014.02.28aCGH-PGS技术在我中心的应用患者指征复发性流产筛查周期31个芯片检测卵裂球数202个正常39aSNP-PGS技术aSNP-PGS技术4023-chromosomesinglenucleotidepolymorphism(SNP)microarraypreimplantationgeneticscreening(PGS)forrecurrentpregnancyloss(RPL)in687invitrofertilization(IVF)cyclesand5871embryosMATERIALSANDMETHODS:AretrospectivereviewwasconductedofallembryosthatunderwentPGSby23chromosomeSNPmicroarraysfromJanuary2010toApril2012.PatientsunderwentstandardIVFandPGSprimarilyduetoahistoryof≥2spontaneousmiscarriages.CONCLUSION:PGSusing23chromosomeSNPmicroarraysinwomenwithRPLwassuperiortoFISHPGS.Furthermore,performingthebiopsyattheblastocyststagewassuperiortocleavagestagebiopsy.Theapplicationofdensemicroarray23chromosomePGSattheblastocyststagemaysubstantiallyimprovepregnancyoutcomesincouplessufferingfromRPL.23-chromosomesinglenucleotid41aSNP-PGS技术在我中心的应用病史2008年结婚2006、2007年自然流产3次2010、2011年孕6月余均因胎儿畸形行引产术平素月经规律，周期25-35天，经期5天，痛经（-）女方：李XX，29岁；男方：崔XX，29岁aSNP-PGS技术在我中心的应用病史女方：李XX，29岁42相关检查2012年7月宫腔镜：正常宫腔。双方染色体均正常男方精液检查正常相关检查43治疗

2012年10月采用GnRH-a长方案行ICSI-ET治疗COH8天HCG日：LH2.45miu/ml，E24537pg/ml，P1.43ng/ml获卵25枚，受精24枚，20枚达到活检要求行aSNP-PGS筛查，1枚正常冷冻胚胎移植1枚，15天后，血HCG2047miu/ml孕39周，顺产一健康女婴，体重3800g治疗44

aCGH、aSNP是目前常用于PGD/PGS的微阵列技术。

亲代染色体异常PGD患者以平衡易位、罗氏易位居多。

此类患者经微阵列PGD检测后具有较高的临床妊娠率。

不明原因复发性流产患者胚胎行微阵列PGS筛查，能

达到较高的临床妊娠率，大幅降低流产率。对于亲代染色体易位患者及不明原因复发性流产患者

微阵列PGD/PGS是较好的选择。小结：aCGH、aSNP是目前常用于PGD/PGS的微阵列技术。45PGS的发展方向：更加安全：

对胚胎发育影响小更加可靠：

高DNA质量

降低嵌合影响E.Grecoetal.AdvancesinReproductiveSciences1(2013)7-14卵裂期→囊胚期PGS的发展方向：更加安全：E.Grecoetal.46PGS的发展方向：更加精确：检测位点更多更加省时：优化实验流程降低成本单细胞二代测序（NGS）PGS的发展方向：更加精确：检测位点更多单细胞二代测序（NG47谢谢谢谢基因芯片PGD/PGS技术的临床应用基因芯片PGD/PGS技术的临床应用49染色体微阵列分析技术（CMA）胚胎植入前遗传学诊断和筛查（PGD/PGS）微阵列PGD/PGS的临床应用染色体微阵列分析技术（CMA）50染色体微阵列分析技术Chromosomemicroarray,CMA染色体微阵列分析技术51染色体微阵列分析(CMA)将已知序列的基因探针集成在平面基质载体上，形成密集、有序的DNA分子微阵列样本DNA荧光标记与芯片上所含的基因序列进行杂交通过扫描荧光信号的强度，检测样本基因表达情况。荧光信号强度与基因拷贝数正相关染色体微阵列分析(CMA)将已知序列的基因探针集成在平面基52临床生殖遗传学检测技术GBandFISHaCGH、aSNPCMA临床生殖遗传学检测技术GBandFISHaCGH、aSNP53

微阵列比较基因组杂交技术（aCGH）Microarraycomparativegenomichybridization

微阵列单核苷酸多态性分析技术（aSNP）Singlenucleotidepolymorphismarray高通量、微型化、集约化及标准化可对相关基因精确定位，能够快速全面地分析染色体结构与数目的异常染色体微阵列分析(CMA)微阵列比较基因组杂交技术（aCGH）高通量、微型化、集约化54微阵列比较基因组杂交（aCGH）6400个杂交位点微阵列比较基因组杂交（aCGH）6400个杂交位点55微阵列比较基因组杂交（aCGH）优点：同时检测46条染色体非整倍性分辨0.5Mb以上的染色体结构异常新鲜胚胎移植，无需冷冻胚胎缺点：不能检测出染色体平衡易位亲代染色体异常复发性流产、反复胚胎着床失败女方年龄≥35岁不孕症患者伴性遗传适应症：微阵列比较基因组杂交（aCGH）优点：同时检测46条染色体非562009年9月，世界上首例使用aCGH-PGS筛选诞生的婴儿Fisheletal.FertilSteril2010aCGH-PGS的临床应用卵母细胞检测2009年9月，世界上首例使用aCGH-PGS筛选诞生的婴儿57微阵列单核苷酸多态性分析（aSNP）1MakeamplifiedDNAGENOMICDNA(200-400ng)IncubateamplifiedDNA2FragmentamplifiedDNA3Precipitate&resuspend4PrepareBeadChip5HybridizesamplesonBeadChip6GenotypeandLOH/CNanalysis9ImageBeadChip8DAY1DAY2DAY3微阵列单核苷酸多态性分析（aSNP）1Makeamplif58微阵列单核苷酸多态性分析（aSNP）优点：可以同时检测46条染色体非整倍性

可以分辨50kb以上的染色体结构异常缺点：不能检测出染色体平衡易位不能进行新鲜胚胎移植亲代染色体异常反复胚胎着床失败、复发性流产女方年龄≥35岁不孕症患者伴性遗传线粒体突变、单亲二倍体适应症：微阵列单核苷酸多态性分析（aSNP）优点：可以同时检测46条59Infact,thefirstthreebabiesbornintheworldfromtheSNPtechnologywerefromLaJollaIVF.Pleaseseetheirphotosbelow.

ThefirstthreebabiesbornintheworldfromtheSNPtechnologywerefromLaJollaIVF.CA.USAInfact,thefirstthreebabie60遗传病筛查和诊断aCGHaSNPFISH23对染色体非整倍体是是最多10-12对拷贝数变异(CNVs)是是否染色体结构不平衡~0.5Mb~0.05Mb有限的单基因病否否否线粒体突变否是否单亲二倍体否是否常用检测技术的比较微阵列检测技术遗传病筛查和诊断aCGHaSNPFISH23对染色体非整倍体胚胎植入前遗传学诊断和筛查PGD/PGS胚胎植入前遗传学诊断和筛查62PCRFISHaCGHaSNPNGS聚合酶链式反应荧光原位杂交微阵列比较基因组杂交微阵列单核苷酸多态性二代测序

胚胎植入前遗传学诊断与筛查（PGD/PGS）PCR聚合酶链式反应胚胎植入前遗传学诊断与筛查（PGD/P63JoyceC.etal.HumGenet(2012)131:175–186

胚胎植入前遗传学诊断与筛查（PGD/PGS）PGDPGS目的诊断出遗传学正常的胚胎，从而使遗传学正常的胎儿妊娠/出生染色体正常的胎儿妊娠/出生适应症单基因病、X连锁遗传、亲代染色体异常高龄、反复妊娠失败、复发性流产、严重男性不育生育力可生育不育、低生育力常用诊断技术FISH、PCR、arrayFISH、array未确诊结果的处理不移植可移植产前诊断建议与自然妊娠标准相同JoyceC.etal.HumGenet(201264PGD/PGS的适应症PGD单基因疾病：常显、常隐、X连锁染色体异常：结构、数目异常PGS染色体非整倍性异常女方年龄≥35岁、复发性流产反复胚胎植入失败、不良孕产史严重男性不育症PGD/PGS的适应症PGD单基因疾病：常显、常隐、X连锁P65微阵列PGD/PGS的临床应用微阵列PGD/PGS的临床应用66PGD单基因疾病：常显、常隐、X连锁染色体异常：结构、数目异常K.HaapaniemiKouruetal.HumanReproduction,Vol.27,No.9pp.2843–2849,2012瑞典斯德哥尔摩PGD中心1996年~2009年256对夫妇569个促排卵周期PGD单基因疾病：常显、常隐、X连锁K.Haapaniem67亲代染色体异常我国普通人群染色体异常：0.47%不孕不育患者染色体异常：3%~10%，显著增高染色体结构异常：罗氏易位、平衡易位

倒位、缺失、重复染色体数目异常：21三体（嵌合型）性染色体异常：Turner综合征XYY综合征亲代染色体异常我国普通人群染色体异常：0.47%染色体结构异68我院夫妇双方染色体G显带核型分析时间检查总例数数目异常结构异常异常占比参考值2009.12-2014.028026对186

对313对6.22%3%~10%备注：数目异常包括：Turner、Klinefelter、XYY、XXX、及其嵌合体结构异常包括：易位，倒位，缺失、重复，其中易位占结构异常的44.4%我院夫妇双方染色体G显带核型分析时间检查数目异常结构异常异常69夫妇双方染色体G显带核型分析Turner45,XOKlinefelter47,XXY数目异常夫妇双方染色体G显带核型分析Turner45,XOKli70结构异常平衡易位46,XYt(1,6)(qter;q12)罗氏易位45,XYt(13,14)(q10;q10)夫妇双方染色体G显带核型分析结构异常平衡易位罗氏易位夫妇双方染色体G显带核型分析71染色体结构异常类型正常配子携带者异常配子平衡易位1/181/1816/18罗氏易位1/61/64/6倒位1/41/42/4缺失、重复1/201/2亲代染色体结构异常染色体结构正常配子携带者异常配子平衡易位1/181/181672夫妇一方或双方染色体异常复发性流产不明原因复发性流产HelenFlynnetal。J.Obstet.Gynaecol.Res.Vol.40,No.1:109–116,January2014Chromosomalabnormalityandrepeatedmiscarriage1992.01-2011.03夫妇一方或双方染色体异常复发性流产不明原因复发性流产Hele73HelenFlynnetal。J.Obstet.Gynaecol.Res.Vol.40,No.1:109–116,January2014Thecumulativelivebirthrate总流产率55.6%HelenFlynnetal。J.Obstet.G74F.Fiorentinoetal.HumanReproduction,Vol.26,No.7pp.1925–1935,2011F.Fiorentinoetal.HumanRep75F.Fiorentinoetal.HumanReproduction,Vol.26,No.7pp.1925–1935,2011F.Fiorentinoetal.HumanRep76NathanR.Treff,etal.FertilityandSterilityVol.95,No.5,April2011NathanR.Treff,etal.Fertil77基因芯片PGDPGS技术的临床应用课件78基因芯片PGDPGS技术的临床应用课件79女方年龄≥35岁、复发性流产反复胚胎植入失败、不良孕产史严重男性不育症PGSAMA：高龄RM：复发性流产RIF：反复种植失败SMF：严重男性因素HumanReproductionUpdate,Vol.18,No.3pp.234-247,2012欧洲人类生殖与胚胎学协会PGD联盟1997~2007年57家中心超过27000个周期女方年龄≥35岁、复发性流产PGSAMA：高龄R80复发性流产（RecurrentSpontaneousAbortion,RSA）概念：与同一配偶连续发生3次或3次以上临床妊娠

流产称为复发性流产。发病率：10~15%，其中80%为早期流产病因：能够识别的仅占一半；包括免疫功能异常、内分泌异常、染色体异常、

母体生殖道异常……FrancoCausioetal,2002,Chromosomeanalysisofspontaneousabortionsafterinvitrofertilization(IVF)andintracytoplasmicsperminjection(ICSI),EuropeanJournalofObstetrics&GynecologyandReproductiveBiology复发性流产概念：与同一配偶连续发生3次或3次81免疫因素内分泌因素解剖因素遗传因素感染因素病因不明20%20%12~16%2~5%1~2%40%复发性流产病因分布免疫因素内分泌因素解剖因素遗传因素感染因素病因不明20%20胚胎染色体核型异常是RSA的常见诱因胚胎染色体核型异常是RSA的常见诱因83胚胎染色体核型异常是RSA的常见诱因635abortedproducts：normalkaryotypeswere44.9%(n=285;euploid280,translocation5)abnormalkaryotypeswere55.1%(n=350;trisomy199,doubletrisomy22,monosomy25,polyploidy38,tetraploidy9,derivativeoftranslocation34,others23)胚胎染色体核型异常是RSA的常见诱因635aborted84PereMiretal.JAssistReprodGenet(2013)30:143–149ClinicaloutcomeafteraCGH-PGSPereMiretal.JAssistRepro85aCGH-PGS技术在我中心的应用①连续发生3次或3次以上自然流产，且妊娠时间<12周②夫妇双方染色体核型正常③女方催乳素、卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇、孕酮、睾

酮等水平正常，无内分泌疾病史④盆腔超声、子宫输卵管造影排除生殖道器质性病变⑤宫颈分泌物检查排除沙眼衣原体、解脲支原体感染，TORCH

检查排除近期感染⑥自身抗体检测为阴性⑦男方精液常规检查正常或治疗后恢复正常复发性流产患者PGS纳入条件aCGH-PGS技术在我中心的应用①连续发生3次或3次以上86患者指征复发性流产筛查周期31个芯片检测卵裂球数202个正常胚胎53个（26.24%）异常胚胎145个（71.78%）筛查失败4个（1.98%）移植周期24个临床妊娠16例临床妊娠率66.67%（16/24）早期流产率6.25%（1/16）截止2014.02.28aCGH-PGS技术在我中心的应用患者指征复发性流产筛查周期31个芯片检测卵裂球数202个正常87aSNP-PGS技术aSNP-PGS技术8823-chromosomesinglenucleotidepolymorphism(SNP)microarraypreimplantationgeneticscreening(PGS)forrecurrentpregnancyloss(RPL)in687invitrofertilization(IVF)cyclesand5871embryosMATERIALSANDMETHODS:Aretrospectivereviewwasconductedo