动物细胞工程1305dx课件

2.2动物细胞工程2.2动物细胞工程1动物细胞培养动物细胞融合生产单克隆抗体动物细胞核移植动物细胞工程常用技术基础动物细胞培养动物细胞融合生产单克隆抗体动物细胞核移植动物细胞2皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，10～14天后就要被身体排斥。

对一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚3

“人耳鼠”再出风头

2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动——这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。

在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。

人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？“人耳鼠”再出风头在京展出的数天，尽管门票高达204动物细胞培养和核移植技术一、动物细胞培养概念原理细胞增殖从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖培养目的获得细胞或细胞产物动物细胞培养和核移植技术一、动物细胞培养概念原理细胞增殖从动5剪碎胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理动物胚胎或幼龄动物的组织单个细胞细胞悬液细胞贴壁、接触抑制单个细胞、制作细胞悬液10代以内：正常细胞10—50代左右：部分细胞的核型可能发生变化加培养液原代培养胰蛋白酶消化传代培养过程动物细胞培养能不能最终培养成一个完整的生物体？50代以后细胞发生突变，获得不死性细胞系遗传物质未改变遗传物质已改变（控制好时间）细胞株剪碎胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理动物胚胎或幼6思考讨论：1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？因为其细胞分裂能力强，分化程度低。2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖，分散成单个细胞可扩大细胞与培养液的接触面积，利于细胞吸收营养。4、在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。3、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理。思考讨论：1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物76、为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，此时活性较高。而胃蛋白酶适宜PH为2.0在PH为7.2-7.4的培养液中会失活。5、用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？因细胞膜主要成分是磷脂和蛋白质，故长时间处理当然会损伤细胞。因此操作时要注意控制好时间！7、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？8、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？9、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。进行传代培养，将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。6、为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最811、传代培养的细胞能一直传代下去吗？12、有些为何能一直传下去？13、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？不都能发生突变，朝着癌细胞方向发展不全是14、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？保存10代以内的细胞，因为10－50代部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展15、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体10、如何理解原代培养和传代培养？上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养11、传代培养的细胞能一直传代下去吗？12、有些为何能一直传9多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的10条件1.无菌、无毒环境3.适宜的温度和PH4.气体环境(灭菌处理，加抗生素，定期更换培养液)葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等严格配置成的合成培养基，再加上血清、血浆等36.5±0.5℃O2和CO2（95%空气和5%CO2）,CO2的作用主要是维持PH7.2—7.42.营养物质保证细胞顺利的生长增殖条件1.无菌、无毒环境3.适宜的温度和PH4.气体环境(灭菌11植物组织培养和动物细胞培养的比较：比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖动物血清、血浆培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白取材植物幼嫩部分或花药胚胎或幼龄动物的器官或组织其他条件无菌无毒，适宜条件无菌无毒，适宜条件植物组织培养和动物细胞培养的比较：比较项目植物组织培养动物细12应用应用13二、动物体细胞核移植技术和克隆动物概念原理将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物动物细胞核的全能性分类胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度高，恢复全能性困难二、动物体细胞核移植技术和克隆动物概念原理将动物的一14体细胞核移植技术1.克隆羊培育过程黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利体细胞核移植技术1.克隆羊培育过程黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊15卵母细胞采集、培养电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚胎MⅡ中期卵母细胞供体牛（高产奶牛）供体细胞注入去核卵母细胞代孕母牛克隆牛体细胞培养去核卵母细胞去核胚胎移植过程卵母细胞采集、培养电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚16２、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变思考题3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞1、为何选择去核卵母细胞作为受体细胞？卵母细胞的细胞质可使体细胞核的全能性得以表达；细胞体积大，容易操作；细胞质多，营养丰富，能为早期胚胎的形成提供营养。去核是为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。２、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什174.动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性．

思考题4.动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？在1997年185、对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？多莉克隆过程的受体细胞是去核卵细胞，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核卵母细胞；多莉克隆过程是将供体细胞核注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体细胞注入受体细胞。6、讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明理由？卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物，操作也方便思考题5、对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点19应用在畜牧业、医药卫生，以及其他领域有着广泛的应用前景1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育2、保护濒危物种，增加存活数量3、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白4、可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植5、人的核移植胚胎干细胞经诱导分化用于组织器官移植6、了解胚胎发育、衰老过程、研究疾病应用在畜牧业、医药卫生，以及其他领域有着广泛的应用前景1、加20材料一：克隆羊“多莉”的摇篮——英国罗斯林研究所曾进行过约３００例羊细胞克隆－移植实验。结果除“多莉”以外，其余克隆羊或胎死腹中，或以畸形问世，而且后者发生几率高达９９％。目前的体细胞动物克隆实验成功率都非常低，据哈里·格里芬所长称，小羊“多莉”是两百多个克隆胚胎中惟一的成功者。他说，在公开发表的研究里，克隆胚胎最终成活率大概是２％，实际成功率很可能比这还要低得多。许多动物在即将出生或出生后不久即死去，肺、肾、心血管系统等重要器官出现问题的风险很高。材料二：1996年7月5日，苏格兰罗斯林研究所和英国PPL公司共同培育的克隆羊——“多莉”问世，1997年2月23日公布于众，引起各界的普遍关注。2003年2月14日，罗斯林研究所证实“多莉”已死亡。“多莉”的尸体已解剖并制成标本，现存放于苏格兰国家博物馆。“多莉”的死亡再次引起世界的关注。

据介绍，绵羊通常能活到11~12年。但2002年1月科学家发现“多莉”羊的左右腿患上了关节炎这种典型的“高龄病症”，以后又得了老年羊常得的肺部感染疾病。研究人员不得不对其实施了“安乐死”。“多莉”羊的“英年早逝”，震惊了世界，引起了人们对克隆动物健康的关注，以及对克隆技术的发展前景的再思考。材料一：克隆羊“多莉”的摇篮——英国罗斯林研究所曾进行过约３21体细胞核移植技术存在的问题：绝大多数克隆动物还存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。体细胞核移植技术成功率非常低。体细胞核移植技术各个环节也有待进一步改进。对克隆动物食品的安全性问题也存在争议。体细胞核移植技术存在的问题：绝大多数克隆动物还存在健康问题，22动物细胞融合和单克隆抗体细胞融合是正常的生命活动正在融合的两个细胞

受精作用动物细胞融合和单克隆抗体细胞融合是正常的生命活动正在融合的两23一、动物细胞融合融合成功的标志：概念：两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程原理：细胞膜的流动性细胞核融合成一个核融合结果：形成具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞即为杂交细胞。一、动物细胞融合融合成功的标志：概念：两个或多个动物细胞结合24融合含不同DNA的两个细胞灭活的病毒，如灭活的仙台病毒等有丝分裂杂交细胞过程：用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程融合含不同DNA的两个细胞灭活的病毒，如灭活的仙台病毒等有丝25诱导动物细胞融合的方法：常用诱导方法：灭活的病毒、聚乙二醇、电激

诱导方法物理法化学法生物法聚乙二醇PEG诱导融合电激，振动，离心灭活的病毒诱导融合(动物细胞融合特有，病毒外壳上的糖蛋白可促进细胞融合。)紫外线丧失感染性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）仙台病毒诱导动物细胞融合的方法：常用诱导方法：灭活的病毒、聚乙二醇、26应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段杂交瘤技术，制备单克隆抗体。〔最重要用途〕优点：突破了有性杂交技术的局限，使远缘杂交成为可能应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重27植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合过程原理细胞融合的过程诱导方法用途细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性、细胞增殖去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合物理法：离心、振动、电激等化学方法：聚乙二醇（PEG）物理、化学法：与植物相同；生物方法：灭活的病毒获得杂种植株制备单克隆抗体细胞融合，植物组织培养细胞融合植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物28什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞受抗原刺激后，增殖分化成的浆细胞可以产生抗体。动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。但是每一个B淋巴细胞只能分泌一种特异性抗体。什么是抗体？29人们获得抗体的传统方法是?将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体这种方法的缺点是什么?效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反响。能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？B淋巴细胞在体外不能无限增殖。思考讨论人们获得抗体的传统方法是?思考讨论30二、单克隆抗体概念：

由单个B淋巴细胞经过克隆形成的基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体特异性强、灵敏度高、产量大特点：二、单克隆抗体概念：由单个B淋巴细胞经过克隆形成的基因31如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能32多种杂交瘤细胞提取诱导融合小鼠骨髓瘤细胞经免疫的小鼠多种B淋巴细胞杂交瘤细胞第一次筛选用特定的选择培养基第二次筛选能产生特定抗体的杂交瘤细胞体外培养体内培养提取单克隆抗体BB细胞瘤瘤细胞多种杂交瘤细胞提取诱导融合小鼠骨髓瘤细胞经免疫的小鼠多种B33①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。

③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，可是能不断分裂增殖。你想到筛选杂交瘤细胞的方案了吗？

小资料：首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断34

在培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖细胞！加入氨基蝶呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。在培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖细胞！35

通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个，再由这些单细胞克隆生长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。最终选出分泌特定抗体的杂交细胞株进行扩大培养。再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释36阳性孔方法——抗原-抗体杂交法

在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。阳性孔方法——抗原-抗体杂交法在单克隆抗体制备过程中371、动物特异性免疫2、别离B淋巴细胞〔B〕；培养骨髓瘤细胞〔G〕。注意B淋巴细胞是一个系列。3、三种细胞融合方式:〔BB;BG;GG〕4、第一次筛选：在“选择培养基〞上培养筛选杂交瘤细胞〔只有BG杂交瘤细胞存活。而且BG杂交瘤细胞也是一个系列。〕5、第二次筛选：在“多孔培养板上〞培养，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养〞后并进展“专一抗体检测〞，“检测阳性〞的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。6、选择所需要的杂交瘤细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。7、提取单克隆抗体。单抗的制备过程要点：1、动物特异性免疫单抗的制备过程要点：38单克隆抗体的应用1、作为诊断试剂——单克隆抗体最广泛的用途2、用于治疗疾病和运载药物目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤单克隆抗体的应用1、作为诊断试剂——单克隆抗体最广泛的用途2392、动物细胞工程技术的基础是

A．动物细胞融合 B．胚胎移植

C．动物细胞培养D．核移植Ｃ1、动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较，正确的是A．结果是相同的 B．杂种细胞的形成过程基本相同C．操作过程中酶的作用相同D．诱导融合的手段相同Ｂ练习2、动物细胞工程技术的基础是Ｃ1、动物细胞融合和植物体细胞杂403、单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是①淋巴细胞②小鼠骨髓瘤细胞③B淋巴细胞自身融合细胞④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞⑤杂交瘤细胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③C练习3、单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞C练习41谢谢！谢谢！42人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。原代培养有关概念原代培养有关概念43细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。有关概念细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在44■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。接触抑制有关概念■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，45传代培养当原代培养的细胞处于接触抑制后,用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）有关概念传代培养当原代培养的细胞处于接触抑制后,用胰蛋白酶46▲细胞株：传代细胞一般能传到50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。▲细胞系：传代50代以后不能再传下去，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体有关概念▲细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。▲细胞株：传代细胞一般能传到50代，遗传物质一般不会发生改变472.2动物细胞工程2.2动物细胞工程48动物细胞培养动物细胞融合生产单克隆抗体动物细胞核移植动物细胞工程常用技术基础动物细胞培养动物细胞融合生产单克隆抗体动物细胞核移植动物细胞49皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，10～14天后就要被身体排斥。

对一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚50

“人耳鼠”再出风头

2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动——这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。

在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。

人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？“人耳鼠”再出风头在京展出的数天，尽管门票高达2051动物细胞培养和核移植技术一、动物细胞培养概念原理细胞增殖从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖培养目的获得细胞或细胞产物动物细胞培养和核移植技术一、动物细胞培养概念原理细胞增殖从动52剪碎胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理动物胚胎或幼龄动物的组织单个细胞细胞悬液细胞贴壁、接触抑制单个细胞、制作细胞悬液10代以内：正常细胞10—50代左右：部分细胞的核型可能发生变化加培养液原代培养胰蛋白酶消化传代培养过程动物细胞培养能不能最终培养成一个完整的生物体？50代以后细胞发生突变，获得不死性细胞系遗传物质未改变遗传物质已改变（控制好时间）细胞株剪碎胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理动物胚胎或幼53思考讨论：1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？因为其细胞分裂能力强，分化程度低。2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖，分散成单个细胞可扩大细胞与培养液的接触面积，利于细胞吸收营养。4、在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。3、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理。思考讨论：1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物546、为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，此时活性较高。而胃蛋白酶适宜PH为2.0在PH为7.2-7.4的培养液中会失活。5、用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？因细胞膜主要成分是磷脂和蛋白质，故长时间处理当然会损伤细胞。因此操作时要注意控制好时间！7、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？8、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？9、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。进行传代培养，将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。6、为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最5511、传代培养的细胞能一直传代下去吗？12、有些为何能一直传下去？13、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？不都能发生突变，朝着癌细胞方向发展不全是14、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？保存10代以内的细胞，因为10－50代部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展15、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体10、如何理解原代培养和传代培养？上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养11、传代培养的细胞能一直传代下去吗？12、有些为何能一直传56多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的57条件1.无菌、无毒环境3.适宜的温度和PH4.气体环境(灭菌处理，加抗生素，定期更换培养液)葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等严格配置成的合成培养基，再加上血清、血浆等36.5±0.5℃O2和CO2（95%空气和5%CO2）,CO2的作用主要是维持PH7.2—7.42.营养物质保证细胞顺利的生长增殖条件1.无菌、无毒环境3.适宜的温度和PH4.气体环境(灭菌58植物组织培养和动物细胞培养的比较：比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖动物血清、血浆培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白取材植物幼嫩部分或花药胚胎或幼龄动物的器官或组织其他条件无菌无毒，适宜条件无菌无毒，适宜条件植物组织培养和动物细胞培养的比较：比较项目植物组织培养动物细59应用应用60二、动物体细胞核移植技术和克隆动物概念原理将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物动物细胞核的全能性分类胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度高，恢复全能性困难二、动物体细胞核移植技术和克隆动物概念原理将动物的一61体细胞核移植技术1.克隆羊培育过程黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利体细胞核移植技术1.克隆羊培育过程黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊62卵母细胞采集、培养电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚胎MⅡ中期卵母细胞供体牛（高产奶牛）供体细胞注入去核卵母细胞代孕母牛克隆牛体细胞培养去核卵母细胞去核胚胎移植过程卵母细胞采集、培养电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚63２、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变思考题3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞1、为何选择去核卵母细胞作为受体细胞？卵母细胞的细胞质可使体细胞核的全能性得以表达；细胞体积大，容易操作；细胞质多，营养丰富，能为早期胚胎的形成提供营养。去核是为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。２、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什644.动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性．

思考题4.动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？在1997年655、对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？多莉克隆过程的受体细胞是去核卵细胞，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核卵母细胞；多莉克隆过程是将供体细胞核注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体细胞注入受体细胞。6、讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明理由？卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物，操作也方便思考题5、对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点66应用在畜牧业、医药卫生，以及其他领域有着广泛的应用前景1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育2、保护濒危物种，增加存活数量3、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白4、可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植5、人的核移植胚胎干细胞经诱导分化用于组织器官移植6、了解胚胎发育、衰老过程、研究疾病应用在畜牧业、医药卫生，以及其他领域有着广泛的应用前景1、加67材料一：克隆羊“多莉”的摇篮——英国罗斯林研究所曾进行过约３００例羊细胞克隆－移植实验。结果除“多莉”以外，其余克隆羊或胎死腹中，或以畸形问世，而且后者发生几率高达９９％。目前的体细胞动物克隆实验成功率都非常低，据哈里·格里芬所长称，小羊“多莉”是两百多个克隆胚胎中惟一的成功者。他说，在公开发表的研究里，克隆胚胎最终成活率大概是２％，实际成功率很可能比这还要低得多。许多动物在即将出生或出生后不久即死去，肺、肾、心血管系统等重要器官出现问题的风险很高。材料二：1996年7月5日，苏格兰罗斯林研究所和英国PPL公司共同培育的克隆羊——“多莉”问世，1997年2月23日公布于众，引起各界的普遍关注。2003年2月14日，罗斯林研究所证实“多莉”已死亡。“多莉”的尸体已解剖并制成标本，现存放于苏格兰国家博物馆。“多莉”的死亡再次引起世界的关注。

据介绍，绵羊通常能活到11~12年。但2002年1月科学家发现“多莉”羊的左右腿患上了关节炎这种典型的“高龄病症”，以后又得了老年羊常得的肺部感染疾病。研究人员不得不对其实施了“安乐死”。“多莉”羊的“英年早逝”，震惊了世界，引起了人们对克隆动物健康的关注，以及对克隆技术的发展前景的再思考。材料一：克隆羊“多莉”的摇篮——英国罗斯林研究所曾进行过约３68体细胞核移植技术存在的问题：绝大多数克隆动物还存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。体细胞核移植技术成功率非常低。体细胞核移植技术各个环节也有待进一步改进。对克隆动物食品的安全性问题也存在争议。体细胞核移植技术存在的问题：绝大多数克隆动物还存在健康问题，69动物细胞融合和单克隆抗体细胞融合是正常的生命活动正在融合的两个细胞

受精作用动物细胞融合和单克隆抗体细胞融合是正常的生命活动正在融合的两70一、动物细胞融合融合成功的标志：概念：两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程原理：细胞膜的流动性细胞核融合成一个核融合结果：形成具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞即为杂交细胞。一、动物细胞融合融合成功的标志：概念：两个或多个动物细胞结合71融合含不同DNA的两个细胞灭活的病毒，如灭活的仙台病毒等有丝分裂杂交细胞过程：用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程融合含不同DNA的两个细胞灭活的病毒，如灭活的仙台病毒等有丝72诱导动物细胞融合的方法：常用诱导方法：灭活的病毒、聚乙二醇、电激

诱导方法物理法化学法生物法聚乙二醇PEG诱导融合电激，振动，离心灭活的病毒诱导融合(动物细胞融合特有，病毒外壳上的糖蛋白可促进细胞融合。)紫外线丧失感染性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）仙台病毒诱导动物细胞融合的方法：常用诱导方法：灭活的病毒、聚乙二醇、73应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段杂交瘤技术，制备单克隆抗体。〔最重要用途〕优点：突破了有性杂交技术的局限，使远缘杂交成为可能应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重74植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合过程原理细胞融合的过程诱导方法用途细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性、细胞增殖去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合物理法：离心、振动、电激等化学方法：聚乙二醇（PEG）物理、化学法：与植物相同；生物方法：灭活的病毒获得杂种植株制备单克隆抗体细胞融合，植物组织培养细胞融合植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物75什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞受抗原刺激后，增殖分化成的浆细胞可以产生抗体。动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。但是每一个B淋巴细胞只能分泌一种特异性抗体。什么是抗体？76人们获得抗体的传统方法是?将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体这种方法的缺点是什么?效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反响。能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？B淋巴细胞在体外不能无限增殖。思考讨论人们获得抗体的传统方法是?思考讨论77二、单克隆抗体概念：

由单个B淋巴细胞经过克隆形成的基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体特异性强、灵敏度高、产量大特点：二、单克隆抗体概念：由单个B淋巴细胞经过克隆形成的基因78如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能79多种杂交瘤细胞提取诱导融合小鼠骨髓瘤细胞经免疫的小鼠多种B淋巴细胞杂交瘤细胞第一次筛选用特定的选择培养基第二次筛选能产生特定抗体的杂交瘤细胞体外培养体内培养提取单克隆抗体BB细胞瘤瘤细胞多种杂交瘤细胞提取诱导融合小鼠骨髓瘤细胞经免疫的小鼠多种B80①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。

③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，可是能不断分裂增殖。你想到筛选杂交瘤细胞的方案了吗？

小资料：首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断81

在培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖细胞！加入氨基蝶呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。在培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖细胞！82

通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使