链霉菌操作手册

PAGEPAGE27链霉菌室实验操作手册（2003年）TOC\o"1-2"\h\z\u第一章培养基抗生素生长因子 3常用抗生素及其使用浓度 3LB（Luria-Bertani）培养基 3LA 3基本培养基（MM） 3R5（1L）链霉菌原生质体转化时用 4YEME(酵母膏-麦芽膏培养基)1L（液体培养链霉菌） 4TSBY（1L）（液体培养链霉菌） 4MS培养基 52CMY培养基（用于井岗的接合转移） 5YMS培养基（阿维，井岗产孢） 5YD培养基 5生长因子补充物的使用浓度 5第二章DNA基本操作 7大肠杆菌质粒的抽提 7酶连反应 7DNA片段凝胶回收 7DNA纯化 9E.coil总DNA的提取 9链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进） 10去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明） 10AT克隆（详见说明书） 10SouthernBlot 11第三章PCR及相关技术 13PCR 13PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429重叠延伸技术） 14PCR定点诱变（DpnI法） 14第四章基因片段转移技术 15大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化 15DNA转化 15大肠杆菌质粒的快速检测 15接合转移（详见英文《手册》249页） 16链霉菌原生质体的制备 16链霉菌原生质体的转化 17PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化 17第五章RNA操作技术 19链霉菌总RNA的抽提 19链霉菌的RT-PCR（promegaRTkit） 19第六章蛋白质基本操作技术 21SDS，考马斯亮蓝染色 21大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）： 21链霉菌总蛋白抽提： 22大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）： 22WesternBlot 23第七章遗传作图相关技术 25链霉菌孢子悬液的制备 25链霉菌中NF的证明 25孢子杂交 25在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因 25第八章其他技术 27链霉菌菌种保藏 27检测链霉菌淀粉酶的活性 27

第一章培养基抗生素生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度（μg/ml）链霉菌大肠杆菌2CM氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin,AmpChloramphenicol,CmlHygromycin,HygKanamycin,KmSpectinomycin,SpcStreptomycin,StrThiostrepton,ThioErythomycin,EryApramycin,Amblacathygaac或aphaadAstrtsrermEaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10R－2550502510－50R－－－50－2.5－5050-1002550505025不敏感2030-50*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！！！*R表示不敏感*Km和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg,Km,VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO40.5g,MgSO4·7H2O0.2g,FeSO4·7H2O0.01g,蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。配置MM的琼脂有labagar、Iceagar(IA)R5（1L）链霉菌原生质体转化时用蔗糖103gK2SO40.25gMgCl2·6H2O10.12g葡萄糖10gDifco酪蛋白氨基酸0.1g微量元素溶液2mlOxoid酵母提取物5gTES5.73g加蒸馏水至1000ml称取5.5gDifco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。使用时，将培养基融化，每瓶中加入：KH2PO4(0.5%)2.5mlCaCl2·2H2O(5M)1mlL-脯氨酸(20%)3.75mlNaOH(1M)调pH至7.3对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》）YEME(酵母膏-麦芽膏培养基)1L（液体培养链霉菌）Oxoid酵母提取物3gOxoid蛋白胨Tryptone5g麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630）3g葡萄糖10g蔗糖＊340g蒸馏水至1000ml高压灭菌后加入：（8磅灭菌，113－114゜C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。）MgCl2·6H2O(2.5M)2ml/L制备原生质体时，还要加入：甘氨酸（20%）＊25ml/L蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。TSBY（1L）（液体培养链霉菌）Oxoid胰胨豆汤粉（TSB）30g蔗糖＊340gOxoid酵母抽提物5g蒸馏水至1000ml*不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。MS培养基将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时，用纱布过滤得到滤液，将每250ml滤液分装到装有5g琼脂，5g甘露醇的500ml三角瓶中，10磅灭菌，使用时调pH7.2-7.3。2CMY培养基（用于井岗的接合转移）可溶性淀粉10g胰蛋白胨2gNaCl1g(NH4)2SO42gK2HPO41gCaCO32g无机盐溶液*1ml琼脂20g蒸镏水1000mlPH7.2无机盐溶液(每升)FeSO4.7H2O1gMgCl.6H2O1gZnSO4.7H2O1gYMS培养基（阿维，井岗产孢）酵母抽提物4g可溶性淀粉4g麦芽糖10gCoCl..6H2O5mg琼脂20g蒸镏水1000mlPH7.2YD培养基酵母抽提物4g麦芽糖10g葡萄糖4gMgCl2gCaCl1.5g琼脂15g蒸镏水1000mlPH7.2生长因子补充物的使用浓度天蓝色链霉菌1258、J1501等都是营养缺陷型菌株，培养这些菌株时一般需向培养基中补加营养因子，使用浓度如表生长因子补充物的使用浓度表化合物储存液（mg/ml）1终作用浓度（μg/ml）组氨酸（Histidine）1050其它氨基酸27.537腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘧啶1.57.5维生素0.10.5储存液用无菌去离子水配置，8磅灭菌后4oC保存。对于半胱氨酸营养缺陷型菌株，补充光氨酸。

第二章DNA基本操作大肠杆菌质粒的抽提苯酚/氯仿溶液抽提法接种5mlLB，37℃摇床过夜培养（12小时）离心，3000rpm，5min去上清振荡混匀沉淀，分装在2个离心管中，spin一下，吸去上清，加入150μl的溶液I（50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris·Cl(PH8.0),10mmol/LEDTA(PH8.0)在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压蒸气下灭菌15min（8磅），贮存于4℃），剧烈振荡5分钟打散菌体（菌体不打散容易在产物中出现较多蛋白）。加入300μl溶液II（0.2mol/LnaOH,1%SDS,用2倍的溶液现配现用）后立即振荡混合均匀，处理2分钟后加入225μl溶液III（5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml）混合均匀，12000rpm离心5min，取上清液中于新的离心管。加120μl酸性苯酚/氯仿溶液，振荡混匀，12000rpm离心5min，再取上清液中于新的离心管中。用120ul氯仿重复操作5。加等体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混匀，12000rpm离心7min。沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。50℃烘干后加适量无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。氯化锂抽提法前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用SolutionIIIIII处理）加等体积的异丙醇，混匀，沉淀DNA，12000rpm离心7min。去上清，尽量去干净。用少量70％乙醇洗一下（洗去异丙醇），离心去尽酒精，50℃烘干沉淀，用适量ddH2O（100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）后加入4/5体积的氯化锂溶液（浓度约10mol/L）处理1min沉淀RNA和蛋白。12000rpm离心5min，取上清液于新的离心管中，用等体积的异丙醇混匀，12000rpm离心8min，去上清。将沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。50℃烘干后加一定量的无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。酶连反应一般采用10μl反应体系：T4连接酶1μl，连接酶缓冲液1μl，外源片段与载体按DNA摩尔含量3:1加入即可。如果是粘端连接，则需把外源片段和载体的混合物在50度处理10分钟使粘端变性，然后立即放入冰中5分钟。平端连接采用14度，粘端连接采用16度，连接4小时以上（一般可过夜）。＊外源片段与载体按DNA摩尔含量为3:1或外源更多。DNA片段凝胶回收1试剂盒回收(离心法)（详见说明书）在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量,该重量作为一个凝胶体积(如1oomg=1ooul)根据凝胶的浓度,加DE-A液凝胶浓度DE-A溶液体积≤1.0%3个凝胶体积≤1.5%4个凝胶体积≤2.0%5个凝胶体积混匀后于75oC加热,(低熔点琼脂糖凝胶于45oC加热),间断混合,直到凝胶熔化(6-8分钟).加0.5个DE-A体积的DE-B溶液,混匀(是否需调整PH值,见注意事项1);当分离的DNA片段小与400bp时,加入异丙醇至终浓度为20%;吸3中的混合液,转移到DNA制备管,3600rpm离心1分钟.如制备管中有残留,适当提高速度,再离心1分钟,去滤液;将制备管置回离心管,加0.5mlW1溶液,3600rpm离心30,弃滤液;将制备管置回离心管,加0.7mlW2溶液,3600rpm离心30,弃滤液,重复一次;（W2中含有酒精，应保证瓶子密封。）将制备管置回离心管,最高速度离心1分钟;将制备管置洁净的1.5ml离心管中,在DNA制备膜正中央加25ul水或洗脱液,室温静置1分钟.最高速度离心1分钟洗脱DNA.注意事项;此法适合从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA,用其他缓冲液时,加DE-B溶液后,溶液的PH要调整到6.5以下.勿将DNA长时间暴露在高温下,线型DNA于高温条件下易水解.勿将凝胶长时间暴露在紫外灯,减少紫外灯对DNA的损伤.2步骤中的凝胶必须完全熔化,否则将严重影响DNA的回收效率.步骤4中吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次,可提高回收效率.将洗脱液或水加热到60゜C,可提高回收效率。（重要）DNA分子呈酸性,建议在洗脱液中保存。（试剂盒中提供的洗脱液好像对PCR有某种抑制作用。）2silica回收1在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量;2.加入2-3倍体积的6MKI或NaI（避光4度保存）;65oC温浴,间断混合,直到凝胶熔化;加适量的振匀的silica悬液（10ul）充分混匀,冰上放置15分钟（或更长）,间断混合;5000rpm离心3分钟,弃上清;加1ml预冷的NEWbuffer（先用100ul打散沉淀，再用900ul混匀），冰上洗盐2分钟，间断混合;12000rpm离心10s,弃上清;重复6,7步骤1次;于50oC烘箱烘干;加10ul的去离子水用枪头打匀,65oC水浴15分钟,间断混匀;12000rpm离心10s，把上清转移到另外洁净的离心管中;跑胶检测回收效率.注意事项＊48步均在冰上操作，防止解吸附，silica只在低温下对DNA有吸附作用。＊NEWBuffer：（100ml）1ml5MNacl,1ml1MpH7.5This-HCl,0.5ml0.5MEDTA,50ml100%ETOH,去离子水加至100ml。（-20度保存）＊Silica配法见：TIGJanuary1995Vol.11No.1.AninexpensivealternativetoglassmilkforDNApurifyication.DNA纯化用苯酚:氯仿抽提把样品至置于离心管中,加入等体积的苯酚:氯仿,混匀,使之成为乳浊状;12000rpm离心,5分钟:用枪头把水相移到另一离心管中.加入等体积氯仿并重复2—4用2/3体积的异丙醇（或2倍无水乙醇）,1/10体积的3M醋酸钠,沉淀10分钟（-20度长时间沉淀可提高产量）12000rpm离心5分钟,弃液体70%的乙醇洗盐10分钟，去上清，重复8一次，再12000rpm离心弃液体.50度烘干.去离子水溶解。LiCl抽提1把样品至置于离心管中,加4/5体积10MLiCl2室温下静置1分钟312000rpm离心5分钟4把液体转移到另一离心管中5.加2/3体积的异丙醇沉淀10分钟往下的步骤同于上面的8-12E.coil总DNA的提取1将过夜培养的大肠杆菌离心去上清。2加500μl水重悬浮，加入500μl2%SDS,混合振荡约1min，55℃温育15min，直到溶液的粘度显著下降。3加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠（自然pH）。4加入150μl中性苯酚，混合振荡均匀后，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。5用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止，6加入1倍体积的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），上下颠倒混合直至出现白色絮状DNA沉淀团，用吸头挑出DNA沉淀团。7用70%乙醇洗涤DNA沉淀团两次。8烘干，溶解DNA沉淀。链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进）1将适量的菌体悬浮于500μl溶菌酶溶液（2％）中，37℃温育1hr左右至完全溶菌，2加入500μl碱性SDS溶液（0.3mol/LNaOH,2%SDS），立即振荡混合完全，3打开管盖，在70℃放置15min（对大于20kb的质粒则最好放在55℃,30min），然后于水浴中冷却至室温，4加入100μl酸性苯酚/氯仿溶液，用混合器振荡至液体彻底混合均匀，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。5用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止。6在上清液中加入1/10体积的3MNaAc溶液和1倍体积的异丙醇沉淀5分钟（或2.2倍体积的无水乙醇沉淀1h），12000rpm离心8min，7用70%乙醇洗涤沉淀两次,8干燥后加一定量的TE（d2H2O）缓冲液溶解。另：可使用抽提总DNA的试剂盒，将总DNA与质粒DNA一起抽提。去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明）注：CIAP一般为原酶，酶量过大会失去粘性末端，因此应适当减小酶的用量，一般0.5ul即可。也可减少温浴时间，如37℃,10~20min即可。AT克隆（详见说明书）所用的载体:pGEM-T,pGEM-TEasyVetorSystem1.酶连体系10ulstandardReationPositivecontrolBackgroundcontrol2XRapidLigationBuffer,T4DNALigation5ul5ul5ulpGEM-T,pGEM-TEasyVetor(50ng)1ul1ul1ulPCRproductXulControlinsertDNA2ulT4DNALigase(3weissuntis/ul)1ulDeionizedwatertoafinalvolumeof10ul10ul10ul(2).反应4oC过夜注:PCR产物和载体的摩尔比为:(ngofvectorxkbsizeofinsert)/(kbsizeofvector)*(insert:vectorration)=ngofinsert一般外源和载体的摩尔比例为3:1T载体大小为3bkb50ng2.转化取大肠杆菌感受态细胞100ul,连接产物2-5ul加入1.5ml的离心管中,混匀.冰上放置20分钟.42oC热激90秒.(不要摇动)立即置冰上3-5分钟.加1mlSOC培养基(室温)37oC培养1.5小时(约150rpm摇动).离心,去上清,余下的混匀涂皿(LB/抗生素/IPTG/X-Gal).37oC培养16—24小时,挑白斑.＊所用的培养基:SOC培养基胰蛋白胨2g酵母抽提物0.5g1MNaCl1ml1MKCl0.25ml2MMg2+储液1ml2M葡萄糖1ml*Mg2+储液MgCl.6H2O20.33gMgSO4.7H2O24.65g加双蒸水到100ml,过滤灭菌*葡萄糖过滤灭菌SouthernBlot转膜1.DNA经酶切后，用Agarose凝胶电泳分离，切去多余的胶块并在右下角切去一角以便于识别方向，接着EB染色并拍照。（注意：TAE需新配，凝胶浓度视片段大小而定，一般为0.8%~1.0%，电压1~50v/cm）2.拍照后的凝胶先用无菌的去离子水轻轻摇晃，洗2次，5min/次。3.去嘌呤：在室温下，把凝胶置于盛有0.25MHCl的大平皿中轻轻摇动，直到溴酚蓝由蓝变黄（如果杂交的目标片段小于5kb，此步可省略），再用无菌水摇动洗5min。4.DNA变性：把凝胶放入盛有变性液的平皿中，轻轻摇动，洗2次，15min/次，再用无菌水洗5min。5.中和：把凝胶放入盛有中和缓冲液的平皿中，轻轻摇动，洗2次，15min/次。6.把凝胶放入盛有20xSSC的平皿中，平衡10min。7.印迹：用一玻璃板横放于盛有20xSSC的搪瓷盘上作为桥，把一张用20xSSC浸润的3MM的Whatman滤纸铺在玻璃板上，其两端放入瓷盘的20xSSC液体中，用玻璃棒赶尽气泡。把凝胶（点样孔面朝下）放在滤纸上，避免气泡产生，凝胶周围用胶板封住。剪一张比凝胶略大的带正电的尼龙膜平铺在凝胶上，避免气泡产生，（使凝胶湿润再放膜）。再在尼龙膜上放两张与尼龙膜大小一致的3MM滤纸，然后放一叠吸水纸在滤纸上，再在吸水纸上一平板，平板上放一500g的重物，印迹时间大于2h。8.紫外交联：取下重物及吸水纸拿出尼龙膜放在一滤纸上，与胶接触面朝上，放入紫外胶膜仪中胶联。9.用无菌水洗膜10min，如不立即杂交，自然烘干保存。预杂交及杂交1.裁剪一张比尼龙膜稍大的杂交袋，把尼龙膜放入袋中，用封口机先封住三边，放入10ml预杂交液，赶尽气泡，封口。把杂交袋放入杂交筒中，预杂交时间大于4h,温度65゜C。2.加探针：把探针先煮沸15min后立即放入冰中，至少10min，然后把探针加入1ml预杂交液中，剪去杂交袋一角，除去绝大部分预杂交液，加入杂交液，除尽气泡封口，放入杂交筒中65゜C杂交6~20h。洗膜1.用2xSSC,0.1%SDS室温下轻轻摇动洗2次，5min/次2.用0.5xSSC,0.1%SDS在68゜C条件下洗膜2次，5min/次，轻轻摇动（可在杂交筒中进行）Dig检测1.洗膜后，用washingbuffer摇动润洗5min。2.用100mlBlockingsolution温育30min，轻轻摇动。3.用20mlAntibodysolution温育30min，轻轻摇动。4.用washingbuffer轻轻摇动洗2次，每次15min。5.在20mlDetectionbuffer中平衡5min。6.把膜转到用铂纸包裹的盛有新配置的Colorsubtratesolution的平皿中显色。7.用PH8.0TE终止反应。

第三章PCR及相关技术PCR不同公司不同的酶要求的反应体系与反应条件会有不同，PCR反应可参考该酶的产品说明上的反应体系与反应条件。一般的反应体系如：引物(50pmol/μl)各1μl反应终浓度:各1pmol/μl模板(约30ng/μl)1μl约30ngBuffer(10,含Mg2+)5μl1dNTPs(10mM)1μl0.2μM高温聚合酶(5U/μl)0.2～1μl1－5UddH2O总体积50μlPCR反应参考程序：――――――――――――――――时间Step1预变性95-96℃3-8minStep2变性94℃50secStep3复性＊50secStep4延伸72℃＊Step52、3、4步骤循环（25次左右）；Step6延伸72℃10min4℃结束反应（4度长时间保温对PCR仪有较大损伤，一般不超过1小时便及时取出，绝对不允许过夜保温）。注：引物应该用专门的软件（如PrimerPremier）认真设计，注意两条引物的Tm值大致相等，GC含量较均一，引物自身以及之间不形成强的二级结构，特别是引物的3’端，引物不和模板其他位置形成强的配对（主要看引物3’端）。MgCl2浓度依不同的模板和引物而定。MgCl2的浓度对PCR结果影响很大。链霉菌的PCR因模板的GC含量高，可加DMSO（能降低复性温度）其浓度可在0~10%之间变化。模板为环形质粒时若一次没有扩增出来，可以考虑先用酶将其切成线性再作。对高GC含量的模板，预变性的时间也可适当延长，甚至先在沸水中煮5分种，然后迅速放入冰中。如果使用预变性温度高或时间长，一般要使用“热启动”，即在预变性后再加入酶，这样一是可以保护酶，二是可以避免低温时酶的非特异性扩增。现在的PCR仪一般都有“热盖”装置，可以代替原来使用的矿物油，避免PCR过程中水份蒸发到管盖上。复性温度依引物Tm值及引物与模板的匹配程度而定，提高复性温度可提高扩增的特异性，而当无扩增条带时，可适当降低复性温度。延伸时间可根据扩增区域的长度确定，扩增区域越长，延伸时间越长。不同的聚合酶的延伸速度不一样，具体看说明书，一般高保真聚合酶平均每分钟延伸600bp，普通Taq酶每分钟延伸1kb。根据不同需要使用不同的聚合酶，尤其当用于扩增表达的基因序列时，一定要使用高保真的酶，作普通的PCR验证时就可用普通Taq酶。以链霉菌或其他高GC含量的DNA作模板时，由于GC含量越高，模板和引物的二级结构越复杂，延伸和配对越难，PCR反应不好做，可以暂时（2003年7月－）用TaKaRa的LaTaq酶作普通的PCR，保真度不敢保证，但扩增效果很好。酶的用量可参考说明书，并不是越多越好。LATaq酶的GCbuffer往往能用于别的酶(如普通Taq酶或高保真酶probest)，使它们也能很容易地扩出高G+C的模板来。PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429重叠延伸技术）注：1.两条模板的量无需太大，因尽量保证1:1。2.保证引物之间不会有干扰3.四条引物的PCR重组比三条引物的PCR桥重组容易操作。即分别设计引物对两个模板进行扩增，使扩增后两个模板有35-40bp的重叠序列，分别回收两个模板在只有两条外引物的条件下进行常规PCR.PCR定点诱变（DpnI法）1.引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp，设计的突变位点需位于引物中部。2.PCR反应：使用高保真的pyrobestDNA聚合酶；循环次数少，一般为12个循环。反应体系：10xpyrobestBuffer5uldNTPMixture(10mM)1ul模板DNA(5~50ng)1ulprimer1(125ng)1ulprimer2(125ng)1ulpyrobestDNApolymerase（TaKaRa）(5U/ul)0.25ul加无菌蒸馏水至50ul3.PCR产物沉淀纯化：加1/10体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20゜C冰箱）5min，离心弃上清，70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中。（此步可省略，直接用DpnI酶切）4.DpnI酶切：Buffer2ulBSA（100╳）0.2ulDNAxulDpnI0.5ul加无菌去离子水至20ul30゜C酶切1~4h；65゜C水浴15min终止反应。5.将酶切产物转化大肠杆菌DH5菌株，利用抗生素筛选突变子。6.测序验证

第四章基因片段转移技术大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化挑取保存的感受态细胞在LA平板上划单菌落。挑取长好的单菌落接入到装有5mlLB的universal瓶中，摇床过夜培养。从universal中取1ml过夜培养物，转接于装有20mlLB（用SOC或SOB可提高感受态效率）的250ml三角瓶中，培养2.5~3小时至OD600＝0.6将培养物倒入50ml已预冷的大离心管中，置于冰上待冷却离心，4℃.5000rpm.3分钟倒去上清液，先加少量0.1MCaCl2，打散沉淀，再加10ml，混匀，于冰上放置至少30分或过夜。离心，4℃.5000rpm.3分钟弃上清，加1ml0.1MCaCl2，在冰上轻轻打散沉淀，即可使用。以上步骤均需注意无菌和低温操作。DNA转化取100μl感受态细胞和5μl的酶连产物或1-2ul质粒混合冰上静置30分钟42℃热激90秒，然后在冰上放置5min加0.75mlLB培养基，在37度摇床上培养45分钟。然后3600转离心2分钟，去掉大部分上清。（此步不作为快转，作为慢转，慢转可提高效率，有些抗生素如Kan筛选时用慢转较好）涂布于有抗生素的筛选平板，一般12小时可有转化子出现。大肠杆菌质粒的快速检测从转化子平板上挑取单菌落，在另一平板上划小方块，37℃扩大培养12小时刮取适量（偏少）的菌体悬浮于30μl快检液I溶液中振荡均匀加入15μl碱性SDS溶液（0.3mol/LNaOH,2%SDS）（天冷时先使该溶液预热），立即振荡混合完全。在70℃放置15min（对大于20kb的质粒则最好放在55℃,30min）水浴时间不宜过长。冷却至室温，直接上样跑琼脂糖凝胶电泳检测（如果菌体过多，则点样时会发现样品很粘，所以掌握不好时可以在第4步之后加上一部5ul苯酚抽提，离心的步骤。）如果没有用苯酚处理，看胶时会发现很明显的总DNA的条带，但不影响实验结果的观察。点样时注意点上质粒载体质粒对照，一般在快检时会出现质粒CCC构型的条带，有时也会出现OC构型的。快检液I：0.3M蔗糖，25mMpH8.0Tris-HCl，0.5mMEDTA，0.02％溴甲酚绿接合转移（详见英文《手册》249页）1.带有oriT的目的质粒转化进入大肠杆菌ET12567(pUZ8002),得到转化子;2.将转化子的过夜培养物转接在LB中，在合适抗生素下,37oC培养转化子,到合适浓度(OD600:0.4-0.6)收集菌体;3.用等体积新鲜的LB洗涤菌体两次(洗掉抗生素),0.1倍体积的LB悬浮.备用;4.链霉菌孢子的热激和预萌发（一般的接合转移只须做热激）(1)新鲜孢子悬浮于5ml0.05MPH8.0的TES;(2)50ºC水浴热激10分钟;(3)冷却到室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基;(4)37ºC摇床分别培养2-３小时;（5）离心收集孢子并重新悬浮于适量的水或TES中;（6）在振荡器上打散孢子或只作热激按下面步骤：将适量的孢子加入1mlSOC或2倍YT培养基，50度处理10分钟，离心，去大部分上清。5.按(1*e-8)：(1*e-9)与3中的大肠杆菌混匀(不一定)6.30ºC培养13-20小时左右用适当浓度的抗生素和萘啶酮酸（抑制大肠杆菌）覆盖6.30ºC培养数天（一般2天）可得到接合转移子.7.挑选接合转移子到含适当抗生素和萘啶酮酸的平板上,验证;（作筛选双交换菌株时继续作下面步骤）8.直接将得到的接合转移子作影印，寻找单抗的菌株即为双交换菌株。如果得不到，就要通过单交换菌株的松弛培养来得到双交换菌株。得到的单交换接合转移子划线于合适的培养基(含萘啶酮酸，不含别的抗生素)松弛培养;9.得到的孢子或菌体稀释涂皿或划单菌落（forBld菌株）,影印筛选双交换.注意事项:1不同的孢子热激的温度和时间不同,预培养的时间不同.2不同的链霉菌接合转移所用的培养基不同预萌发培养基Difco酵母膏1%Difco酪蛋白氨基酸1%CaCl20.1M(需配制5M的原液,分开灭菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中去)链霉菌原生质体的制备1.在装有不锈钢弹簧的三角瓶中加入250ml的YEME+TSBY(1:1)(一定要加Glycine)，接种100ul的孢子悬液，于30度摇床中培养36~40hr（视具体情况，有时培养24h已足够。）。2.将培养物倒入universal中，用无菌水涮洗三角瓶，收集洗液于同一universal中，然后3000rpm离心10min。3.弃上清，将菌丝体悬浮于15ml的10.3%的蔗糖溶液中，3000rpm离心10min，弃上清。同此法洗两次。4.取1ml菌丝体，加入4ml的溶菌酶溶液（溶菌酶母液为50mg/mlPBuffer，终浓度为2mg/ml，用PBuffer稀释），于30度水浴30~60min（间隔七八分种轻轻摇动）至上清呈乳状。5.加入5ml的PBuffer并用5ml的吸管吹吸几次，继续温浴10min。（使大量的原生质体释放出来。）6.用装有脱脂棉的试管过滤，滤液转入无菌干净的universal中，3000rpm离心7min（不用brake档防止其破裂）。原生质体沉淀呈黄色。7.弃上清，轻柔打散原生质体，用PBuffer洗两次（洗去溶菌酶）。每次仍使用3000rpm离心7min。（此步可省略）8.弃上清，用枪将原生质体打散，分装，于-70度保存。注：1..P缓冲液（原生质体转化用）（Okanishi,1974）蔗糖103g，K2SO40.25g,MgCl2·6H2O2.02g,微量元素溶液2ml，蒸馏水800ml灭菌后每80ml上述溶液中加入：0.5%KH2PO41ml,3.68%CaCl2·2H2O10ml,5.73%TES缓冲液(pH7.2)10ml2．溶菌时间不能过长，否则会使原生质体破裂。离心后若看到很粘的絮状物，则说明原生质体破裂。链霉菌原生质体的转化1.将最多5ul的DNA（质粒或酶连产物）加于已经装有50ul原生质体的指型管（1.5ml）的管壁上（不与原生质体接触）。2.吸取200ul的25%PEG4000（PEG应先灭菌，再用PBuffer配置），将DNA冲入原生质体中，小心抽吸几次使之混匀。3.将混合物涂布于R5平板上（不含任何抗生素）。4.30度培养14~20hr后（待原生质体再生后，即平板呈雾状），用含有适当抗生素的1ml无菌水溶液覆盖。5.再培养1~2d后，可以看到小的转化子菌落长出。PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化1.将天蓝色链霉菌库斯质粒转化进入大肠杆菌BW25113/pIJ790*菌株中，此步可用常规的CaCl2法。（pIJ790带有cat基因和对温度敏感的复制区，培养时温度要严格控制在30゜C以下）2.培养含库斯质粒的BW25113/pIJ790菌株：从平板上挑取大肠杆菌单菌落接入5ml含25ug/mlCml,100ug/mlAmp的SOB-MgSO4（不加MgCl2的SOB中加入MgSO4至20mM）中，30゜C摇床培养过夜。3.取一部分过夜培养物至25ml新鲜的SOB-MgSO4培养基（含25ug/mlCml,100ug/mlAmp）中，菌体终浓度为1%，添加250ul1ML-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统。4.30゜C，200rpm摇床培养3-5h至OD600~0.6。5.将培养物倒入预冷的30ml离心管中，冰上置10min(从此细胞温度要保持在0~4゜C)。4000rpm4゜C离心5min。6.弃掉上清，加1ml预冷的10%甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml10%甘油,摇匀。7.4000rpm4゜C离心5min，弃掉上清，用10%甘油洗涤。重复上面操作：4000rpm4゜C离心5min，尽量弃去上清，用残留液将细胞打散。（感受态细胞浓度越高电转效果越好）8.在预冷的0.2cm的电转化杯中混合50ul感受态细胞与1-2ulPCR产物（经纯化，可尽量浓，但不能加得过多），混匀后立即电击，电击条件：200Ω,25uF,2.5kv,电击结果为4.5~4.9ms较理想。（电转化杯在70％乙醇中保存，用前先在无菌环境下用无水乙醇洗一下，再吹干，放冰上预冷，无水乙醇能加快吹干的速度。也可以选择0.1cm的电转化杯，但电击的参数就得变为：1.8kV，？Ω,?uF）9.立即加1ml预冷的SOC，37゜C诱导培养40min（如需在同一库斯质粒上中断基因，则30゜C诱导培养）。10.涂LA（含100ug/mlAmp及与电转片段携带的抗性标记相应的抗生素）平板，37゜C过夜培养。（转化子中含有两种质粒，分别是重组前和重组后的质粒，所以要抽质粒再转化一次DH5）

第五章RNA操作技术链霉菌总RNA的抽提1.在MS平板上铺上已灭菌的玻璃纸，接种适量的孢子悬液，涂布均匀，30度培养适当时间，刮取菌丝体,在预冷的碾钵中加入液氮碾磨2~3次。收集粉末状菌丝体小半勺于1.5ml的指型管中。加入250ul的悬浮缓冲液混匀置于冰上。2*.收集液体培养物(洗过的),加入溶菌酶溶液（溶菌酶的终浓度为2mg/ml，用PBuffer稀释）使终体积250ul。于30度水浴15min(原生质体刚开始形成)。3.加入70ulEDTA(0.25M),混匀。4.加入375ul的裂解缓冲液充分混匀，溶液呈清亮状。5.加入等体积的热酚,用手震荡混匀,于65度水浴5min。(a.水饱和酚应提前于65度加热,高温下,酚的溶解度加大。b.RNA在碱性环境中易分解。)6.13,000rpm离心5min,取上清。(室温下,酚仍有少量与水混溶,因而上清为乳白色。)7.再次加入等体积的热酚,震荡混匀,于65度水浴5min.13,000rpm离心5min,取上清。8.加入等体积酚/氯仿(1:1),震荡混匀,13,000rpm离心5min,取上清。9.加入等体积的氯仿,震荡混匀,13,000rpm离心5min,取上清。(一定要充分震荡,以除尽残余的酚,否则,酚会对后续实验造成不良影响。)

10.加入1/5体积的LiCl(10M),两倍体积的无水乙醇,混匀,于-20度放置2hr。11.于4度,13,000rpm,30min,有白色沉淀。12.用80%的冰乙醇洗两次（在冰上进行），以将盐离子去除干净。13.冷冻真空干燥。14.溶于适当的DEPC处理过的水中，于-70度保藏。注：1.所有的枪头、指型管均需用DEPC(0.1%)（Takara）水处理。DEPC为油状，不溶于水，应充分搅拌，使其均匀分散。2.所有操作必须戴上手套，而且手套要经常换。3.水饱和酚：将重蒸酚适量装于一密闭瓶中，加入酚的1/2体积的去离子水，混匀，于65℃温浴，使酚充分溶解于水。链霉菌的RT-PCR（promegaRTkit）反转录：1.反应体系（50ul）模板（去除了DNA的RNA）*ul引物（可以只是下游引物）（50pmol/ul）1uldNTP(10mM)1ulMgSO42ul5*buffer10ulAMV1ulH2O至50ul2.反应程序：模板、引物和水混合后60(或65)度保温4min（保证mRNA的强二级结构完全打开），取出置于冰上再加入其他成分（避免AMV高温失活）。48℃45min95℃2min4℃5min产物于-20℃保藏。反转录产物可不经纯化直接用于常规PCR扩增。注：1.引物设计见常规PCR扩增。但要保证引物之间不会有干扰。2.模板中的DNA要去除干净，做好阴性对照。（即以RNA为模板进行相同的反应。）

第六章蛋白质基本操作技术SDS，考马斯亮蓝染色将干净的胶板装好，用琼脂糖胶（至少1％浓度）封边。配分离胶，配方如下：（1.5mm厚的胶需要10ml）10%分离胶（5ml）：去离子水1.25ml，30%丙烯酰胺1.7ml，1MThis-HCl（pH=8.8）1.95ml，10%SDS50ul，10%过硫酸胺100ul，TEMED2ul。（倒胶前才加入TEMED催化剂）用去离子水密封液面，左右轻轻摇摆使液面水平（聚丙烯酰胺的聚合不能接触氧气，所以用水封液面，水还能使聚丙烯酰胺的上液面保持平整。）室温聚合或放温箱中加速聚合，倾斜胶板吸出水，倒浓缩胶（1.5mm厚的胶需要3ml）。浓缩胶配方如下：浓缩胶1ml：去离子水0.68ml，1MThis-HCl（pH=6.8）0.13ml，30%丙烯酰胺0.17ml，10%SDS10ul，10%过硫酸胺10ul，TEMED1ul。（倒胶前才加入TEMED催化剂）插上梳子，等胶凝固后，拔掉梳子，如果胶孔里有很多气泡，需要用滤纸剪成小条吸去气泡。加入电泳缓冲液点样电泳，蛋白在浓缩胶时可以用150V电压，在分离胶时可以用250V电压，注意观察蛋白的浓缩效果，如果浓缩效果不好说明电泳缓冲液或配胶时的缓冲液用的次数过多，或已经不能用了，电泳缓冲液可用4-5次。电泳完毕后用染色液染胶至少1小时，脱色2至5小时（根据胶的厚度），其间换脱色液2-3次，可用水继续脱色和短期保存胶，或制备干胶长期保存。试剂：30%丙烯酰胺：29g丙烯酰胺，1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺，温去离子水定容到100ml（请先在棕色瓶子上做好记号定容，丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺都有毒，要带手套和口罩操作，不要污染量桶）Tris-Gly电泳缓冲液（5倍，1L）：15.1gTris，94gGlycine，pH8.3，50ml10%SDS，去离子水定容。10%过硫酸胺：0.5g过硫酸胺，去离子水定容到5ml。4度保存。（此物容易失活，最好每次少量配置。胶凝不了，凝的时间长或凝得不充分多半是它的问题。过硫酸胺在聚合反应过程中提供自由基。）脱色液（0.5L）：50ml冰醋酸，225ml甲醇，225ml去离子水。（甲醇有毒）（或50ml冰醋酸，235ml95%乙醇，215ml去离子水。）（防止挥发，密闭保存。）染色液：0.25%（染色效果不好就加大）的考马斯亮蓝溶于脱色液中。大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）：可溶性蛋白的表达没有固定的方法，对不同的蛋白会有不同的方法，如果抽出的可溶性蛋白不多，可用基本培养基代替LB，用30或25度培养代替37度，IPTG（诱导物）的量也可减少，诱导时间也可变化。下面的方法仅供参考:将菌接种于5mlLB（含抗生素）培养基中过夜培养，将过夜培养物全部接种到200ml含抗生素的MM培养基中，37度培养4-5小时，加IPTG至终浓度0.5mM（可变），37度培养13小时。将细胞培养物用20mM的冰冷的Tris-HCl（pH=7.5）浓缩10倍，在冰上用超声波处理（powerlever为4-5，duty设为40－50％，60-120次脉冲，每30次脉冲后在冰中放30秒冷却），4度10000rpm离心10分钟,将上清通过0.45um的滤膜（细菌过滤器）附：MM培养基（1L）硫酸铵1g，磷酸氢二钾0.5g，7水硫酸镁0.2g，7水硫酸亚铁0.1g链霉菌总蛋白抽提：方法一：原生质体法用作链霉菌原生质体的一般步骤作到用过滤器过滤那一步，后面的操作就和大肠杆菌一样。方法二：液氮法将摇好或从平板（铺有玻璃纸）上刮下来的菌体放入已经由液氮预冷了的拈砵中，加液氮，用瓷棒将菌体磨成粉状，其间可加一两次液氮。（摇的菌体需先离心去掉培养基）将粉末收集到冰冻过的瓶子中（可-70度保存）直接加pH为7.4（或其他）的20mMTris-HCl到一定体积用大肠杆菌的方法加上样液，煮菌体，上样。（加上样液之前后一定将菌体尽量打散，可防止菌体不能完全破裂，且加入1M的DTT至终浓度50mM防止加热时二硫键的形成。）大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）：诱导蛋白表达：取过夜培养物50ul-200ul接种于5ml含抗生素的Universal瓶中37度摇2小时左右取一定体积的菌液做阴性对照，其余的加IPTG至终浓度为0.2mM（可变）（4ml培养基加80mM的IPTG10ul）37度摇2小时左右检测蛋白表达：取100ul（或更多）培养物，用pH值为7.4的20mMTris-HCl（或PBS7.4）浓缩10倍或5倍。（菌体多时也可不浓缩）加等体积的2倍上样液（SamplingBuffer），或1／9体积10倍上样液。（加上样液之前后最好将菌体尽量打散，可防止菌体不能完全破裂，还可加入1M的DTT至终浓度50mM防止加热时二硫键的形成。）100度煮2-4分钟12000rpm，离心1min（菌体破碎完全时也可不做）取上清点样做SDS部分试剂：蛋白上样buffer(2倍)（10ml）：SDS0.2g，溴酚蓝0.0006g，1MTris-HCl(pH=6.8)0.8ml，glycerol1.5ml。蛋白上样buffer(10倍)（10ml）：SDS1g，1MTris-HCl(pH=6.8)2.5ml，溴酚蓝0.003g，glycerol4ml。3．1MDTT（二硫苏糖醇）3.09gDTT溶于20ml0.01mol／l乙酸钠，过滤除菌，分装，-20度储存。WesternBlotSDS将胶切成所需的大小放入转移缓冲液中15-60分钟。（胶在不同的缓冲液中会有不同的大小，这一步能让胶的大小达到平衡。0.7mm的胶只需平衡20分钟左右，1.5mm的胶需平衡40分钟）将电转夹板平放在桌面上（先垫一层保鲜膜），依次在夹板的一面放上海绵，滤纸，胶（塑料片），膜，滤纸，海绵，关闭夹板。（所有的东西都要先用转移缓冲液（transferbuffer）浸湿；胶和膜之间不能留有气泡；需要用洁净的玻璃棒从一侧开始把气泡赶走；塑料片放在胶的旁边；蛋白转移一般用硝酸纤维素膜，光的一面朝向胶；滤纸的大小和海绵差不多，膜的大小比胶稍微大一点）将电转夹板放入电转槽中，有胶的一面朝向负极，电转槽中可放入搅拌子，在电转时搅拌可是缓冲液离子和温度保持均一，电转应在4度（冰箱中）进行，可30V过夜电转或70V电转5小时。拆开电转夹板，将膜放入洁净的培养皿（7cm）中，用丽春红（PonceauS）染液染色5分钟，室温，缓慢摇动。用去离子水脱色数秒钟，倾出去离子水，可以看见蛋白质红色的条带。（此步可不做，染色并不是很清楚。）用TBS润洗膜10分钟，脱去丽春红为止，如果没做第五步，则只需稍微润洗两三次即可，去掉SDS和电转缓冲液。倒掉所有的TBS，用封闭液（blockingsolution）浸泡膜一小时，室温（或4度，过夜），轻轻摇动用TTBS将膜润洗两三次（不需停留）将膜泡入含一抗的封闭液中，室温，轻摇2小时将一抗收集可在4度保存至少1-2周仍然有活性，（含有终浓度为0.02％的叠氮化钠防腐）重复8用含二抗的封闭液孵育1小时，收集含二抗的封闭液同步骤10重复8加显色液NBT-BCIP（10ml），暗处显色，摇动，5分钟至数小时内可显色好。试剂：ponceauSStain（丽春红染液）：1m