鸭胚性腺组织微囊藻毒素检测方法建立

鸭胚性腺组织微囊藻毒素检测方法建立摘要：微囊藻毒素（Microcystins）是一类具有生物活性的七肽类毒素，由淡水中的蓝藻细菌生产。由于现代工业产业的快速发展，使得水体污染日益严重，富营养化现象加剧，不断繁殖的蓝藻细菌所产生的大量的微囊藻毒素已经严重危害到生活在其周围环境中的动物以及人类的健康。本实验通过对注射了适当剂量纯微囊藻毒素的鸭胚性腺进行酶联免疫吸附试验，检测不同孵化天数下，性腺中富集的微囊藻毒素的量。结果表明，纯种的微囊藻毒素会对鸭胚胎的生长发育造成一定影响，并在性腺组织中富集，且大于0.1μg/egg的剂量将会导致鸭胚大量死亡。关键词：微囊藻毒素，鸭胚，性腺，检测BuildoftheDetectionMethodforMicrocystinsintheGonadofDuckEmbryo07093201LUChen-Cen（QiuzhenSchoolofHuzhouTeachersCollege,Huzhou313000）Abstract:Microcystinsareafamilyofheptapeptidestoxinswithbiologicalactivityproducedbyfreshwatercyanobacteria.Becauseofthefastdevelopmentofmodernindustry,waterpollutionincreasinglyseriousandeutrophicationphenomenongrowingheavily,thecyanobacteriaproliferateandproducealargenumberofmicrocystins,ithasseriouslydamagedanimalsandhumanhealthyintheenvironment.Inthisexperiment,weinjectedproperdosemicrocystinstotheduckembryo,andusedtheELISAtesttodetectthemicrocystinsinthegonadofduckembryoatthedifferentincubatedate.Theresultsshowedthatthemicrocystinscouldinfluencetheduckgrowingdevelopmentandaccumulateinthegonad.Themortalityoftheduckembryosincreasedsignificantlywhentheinjecteddosewasmorethan0.1μg/egg.Keywords:Microcystins,duckembryo,gonad,detect目录1引言…………………………12材料与方法…………………22.1材料……………………22.1.1樱桃谷种鸭蛋2.1.2微囊藻毒素2.1.3MC检测试剂盒2.1.4化学药品和试剂2.1.5主要仪器设备2.1.6其他实验用具2.1.7主要试剂的制备2.1.8酶标仪的设置2.1.9色谱柱的预处理2.2方法和步骤……………42.2.1藻毒素的处理2.2.2鸭胚的处理.4性腺组织中藻毒素的纯化2.2.5性腺组织中3结果…………………………93.1鸭胚处理结果…………93.1.1种鸭蛋重量统计分析.3处理后鸭胚死亡情况3.2性腺处理结果…………123.2.1性腺分离3.2.2破碎、离心及纯化3.3组织中微囊藻毒素的检测结果………134讨论…………………………175总结与展望…………………20参考文献…………………21致谢…………………23PAGE241.引言科技在不断的发展，人们的生活水平也在不断的提高，然而在这一切物质上成功的背后，我们所付出的代价以及必须面对的后果也是不容忽视的。其中，水体污染情况的日益加剧就是较为严重的问题之一。因为工业以及农业生产中所排放出的毒害物质（如氮、磷等）使得水体富营养化问题加剧，这就直接导致了水体中的一些有毒害的藻类，特别是蓝藻的大量繁殖。这些藻类不断的累积并产生严重的水华污染现象。现在，这已经成为了全球所关注的环境问题了。而在我国，这样的现象近几年来也是屡见不鲜，亟待解决。蓝藻水华污染所造成的主要危害是由于有毒的蓝藻细菌会向水体中释放出多种不同类型的微囊藻毒素(Microcystis)[1]。微囊藻毒素(Microcystis)是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大且造成危害最严重的藻毒素种类，其中以微囊藻毒素-LR(MC-LR)亚型的毒性最强[2-3]，伤害力较大。我国产生富营养化的江河、湖泊水体中，主要存在的是微囊藻毒素MC-LR和MC-RR[4]这两种微囊藻毒素亚型。一些研究已经表明了微囊藻毒素通过抑制细胞中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1（PP1）和2A（PP2A）来起作用[5-6]，通过这样的途径来抑制蛋白磷酸酶活性，诱发细胞角蛋白高度磷酸化，打破磷酸化和脱磷酸化平衡，促进肿瘤的发生[7-8]，严重时会导致体内的一些组织器官衰竭、坏死[9]，危及人们的生命。另一研究表明，若是长期的摄入小剂量的微囊藻毒素，也能够引起人体最初的癌变，进而引发癌症[10]。目前已知微囊藻毒素有80多种异构体，其中最常见的3种为亮氨酸/精氨酸异构体（MC-LR）、双精氨酸异构体（MC-RR）和酪氨酸/精氨酸异构体（MC-YR）[11]，且微囊藻毒素所具有的特殊的氨基酸结构又与其所产生的生物毒性密切相关[12]。鉴于上述微囊藻毒素对人体产生的严重的危害性，WHO国际癌症研究机构（InternationalAgencyforResearchonCancer,IARC）将微囊藻毒素中的MC-LR亚型归为对人类可能的致癌物，并将其安全限值暂定为1μg/L，而我国也在2007年将这一标准列入《生活饮用水水质卫生规范》中并颁布执行。就目前情况而言，人们日常生活中的工、农业污染依旧严峻，蓝藻细菌大量繁殖并产生有害的微囊藻毒素，这些微囊藻毒素在水体中不断的富集，且不容易根治，例如漂白粉等自来水消毒剂对其就根本毫无作用，不能够将其杀灭，这必然是对周围环境中的动物以及人类的一大潜在威胁。本实验中，我们选用樱桃谷种鸭蛋作为材料，将纯微囊藻毒素稀释至适当的浓度后注射进受精蛋的卵黄中，并在适宜的实验条件下继续孵化种鸭蛋，使鸭胚生长发育的环境中存在微囊藻毒素，然后根据实验的需要，将不同孵化天数的鸭胚的性腺组织从鸭胚体中分离出来，并通过细胞破碎、离心等方法将这些性腺组织细胞内的物质提取出来，再利用色谱柱将其进一步的分离纯化，最后，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）对所得物质进行定量检测，得出数据，研究在不同的孵化天数下，微囊藻毒素在鸭胚性腺组织中所富集的量。2.材料与方法2.1材料2.1.1樱桃谷种鸭蛋购于湖州塘甸建华种禽厂。本实验中，对照组的40枚种鸭蛋是从8月份购买来的400枚种鸭蛋中随机抽取的，实验组的100枚种鸭蛋是从10月份购买来的300枚种鸭蛋中随机抽取的。2.1.2微囊藻毒素购于北京伊普瑞斯科技有限公司。2.1.3MC检测试剂盒购于Beacon公司。2.1.4化学药品和试剂主要的化学药品和试剂见表2-1所列：表2-1主要的化学药品和试剂名称纯度来源甲醇色谱纯韩国SK化学公司甲醇分析纯上海试剂总厂无水乙醇分析纯杭州萧山化学试剂厂氯化钠分析纯无锡市晨阳化工有限公司苯扎溴铵分析纯南昌白云药业有限公司2.1.5主要仪器设备主要的仪器和设备见表2-2所列：表2-2主要仪器与设备名称型号制造商或产地冰箱BCD-251AE中国海信伯乐680型酶标仪BIO-RAD公司电子天平梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司Grumbach孵化器南京皓海仪器仪表有限公司JY96-Ⅱ超声波细胞粉碎机宁波新芝生物股份有限公司C18反相色谱柱美国Waters公司生物体视显微镜S27日本OLYMPUS公司高速离心机CR22G/CR21G天美科技有限公司续表2-2名称型号制造商或产地立式压力蒸汽灭菌锅上海博迅实业有限公司医疗设备厂电热鼓风干燥箱101A-2上海浦东荣丰科学仪器有限公司超级恒温水槽DKB-501A上海森信实验仪器有限公司SZ-97自动三重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂高温恒温培养箱日本SANYO公司2.1.6其他实验用具一次性注射器，酒精灯，眼科镊子，解剖刀，解剖针，解剖剪，培养皿，吸水纸，标签纸，滤纸，擦镜纸，塑料烧杯，100mL玻璃烧杯，50mL玻璃烧杯，100mL量筒，50mL量筒，100mL容量瓶，100-1000μL移液枪，10-100μL移液枪，0.1-10μL移液枪，锥形瓶，蒸馏水瓶，试管，试管架，脸盆，一次性手套，胶头滴管，记号笔，铅笔，EP管，药匙，泡沫盒，泡沫板，保鲜薄膜，封口膜，纱布，脱脂棉。2.1.7主要试剂的制备85%甲醇水溶液：将浓度为100%的甲醇水溶液注入量筒，取85mL，然后加入蒸馏水定容至100mL。75%酒精：将浓度为100%的酒精注入量筒，取75mL，然后加入蒸馏水定容至100mL。生理盐水：先用电子天平称量0.9g氯化钠并用少量蒸馏水溶解，然后注入容量瓶内加蒸馏水定容至100mL。2.1.8酶标仪的设置⑴接上电源，打开机器后面的开关，机器开启自检后，根据仪器上的提示，输入密码“00000”后按输入键即可进入机器的操作界面。⑵如果试验的程序已编好，则可直接调出在储存检索菜单里的程序，直接读板。如试验的程序需重新编辑，则按照编辑菜单里面的程序设置，进行新的试验程序的编辑。⑶标准品的设置①标准品信息的设置，包括标准品的数量、浓度和单位。标准品数量：可设置0-12个标准品数量标准品浓度：在浓度选项里填入已给定浓度的大小标准品单位：根据已知浓度的单位选择与之相一致的单位②标准曲线的设置，包括曲线种类和坐标轴。曲线种类：酶标仪中有多种曲线可供选择用于标准品的拟合坐标轴：根据需要对坐标轴的X轴、Y轴进行线性或非线性的设置⑷试验模式的设定根据需要选择适当的波长、振动强度、读数方式等。一般在酶标仪中选择微囊藻毒素的检测，则机器默认波长为450nm单波长，振动强度为中等，读数方式为步进。⑸手工排版根据试剂盒微孔中的阴性对照、标准品、质控品、样品等的排列顺序准确的设置各孔的性质，另外在最后设置一个空白作为对照。⑹读板将装有样品的微孔条放入酶标仪中，按“读板”进行检测，并查看拟合曲线。2.1.9色谱柱的预处理性腺组织破碎离心后浓缩液在用C18反相色谱柱分离纯化前，所用的色谱柱应先进行预处理，即活化。先后用5mL100%甲醇（色谱纯）和5mL去离子水淋洗色谱柱，过柱速度约为3mL/min。2.2方法和步骤2.2.1藻毒素的处理购买于北京伊普瑞斯科技有限公司的微囊藻毒素装于棕色小瓶中，瓶口用封口膜密封，每瓶含有1mg微囊藻毒素。使用时，撕去封口膜，打开瓶盖，按照以下方法配制微囊藻毒素溶液；⑴用50mL的蒸馏水将微囊藻毒素从原先的棕色小瓶中转移至一干净的玻璃烧杯中，混匀，此时烧杯中的微囊藻毒素浓度为1μg/50μL；⑵再用移液枪吸取1mL上述烧杯中的微囊藻毒素溶液至另一干净的玻璃烧杯中，然后加入9mL的蒸馏水，混匀，制成10mL浓度为0.1μg/50μL的微囊藻毒素溶液，用于给鸭胚注射。⑶将装有剩下的浓度为1μg/50μL的微囊藻毒素溶液的烧杯用保鲜薄膜封好，放于冰箱中冷藏。2.2.2鸭胚的处理⑴前期处理将购买来的樱桃谷种鸭蛋用水清洗2-3遍，并用一定浓度的苯扎溴铵（新洁尔灭）消毒1遍后用洁净干燥的纱布擦干，放入孵化箱中孵化。因鸭胚的受精率较低，尤其是夏天，其受精率只有50%多，所以藻毒素在种鸭蛋确定受精后再进行注射。因此，要将种鸭蛋在孵化箱中孵化3-4天。一般情况下在第4或第5天时，已可以区分出受精的蛋和未受精的蛋。将所有的种鸭蛋用照蛋器逐一照射，观察蛋内部的情况，若可以看见卵黄囊血管区，并观察到胚胎活动，则可确定为受精的蛋，用于注射微囊藻毒素或生理盐水；若观察不到上述现象，则为未受精的蛋，弃去。⑵注射将确定受精的蛋逐一编号后用电子天平称重并记录下号码与重量。然后开始注射，将事先已经配制好的浓度为0.1μg/50μL微囊藻毒素溶液用体积为1mL的注射器注射进实验组种鸭蛋的卵黄中，每个蛋注射50μL，注射的孔用石蜡封好。对照组则注射相同剂量的生理盐水，方法同上。因为种鸭蛋在孵化过程中存在着死亡的现象，特别是实验组，因注射进了毒素，死亡率一般情况会较高，所以，注射种鸭蛋时可根据情况，在藻毒素够用的前提下，多注射一些蛋，以免因中途死亡率过高而使实验无法正常进行。将注射好并封好口的蛋放入孵化箱中孵化。本实验中，我们根据需要，微囊藻毒素注射了100枚，作为实验组；生理盐水注射了40枚，作为对照组。⑶鸭胚孵化参数①温度1-14天胚龄38.5℃,14-25天胚龄37.5℃,27-28天胚龄37.2℃。②相对湿度1-7天胚龄65-70%，8-26天胚龄55-60%，27-28天胚龄70-75%。⑷性腺分离注射后，每天照蛋1次，观察鸭胚的生长发育情况，并记录死亡的数量，统计鸭胚的死亡率。在孵化至第13、17、21、25、29天时，每次分别处死实验组和对照组各5只鸭胚，共5次。分离性腺时，先用钳子将蛋壳敲破，并用镊子沿着破口拨开蛋壳空泡面，撕去蛋壳内的薄膜，轻轻的夹住鸭胚的脖子处将其取出，根据如下图2-1所示的鸭胚的内部结构图找到性腺组织，并将其分离出来，置于EP管中。图2-1鸭胚解剖直观图1.性腺；2.左肾的后部；3.输卵管分泌部；4.子宫部；5.阴道部；6.泄殖腔；7.心脏；8.左肺；9.肝脏；10.腺胃；11.肌胃；12.小肠；13.盲肠。2.2.3⑴提取原理因藻毒素是存在于细胞内的物质，所以在对性腺组织中的微囊藻毒素进行检测前，必须先将性腺组织中的细胞破碎，使其释放出所含的藻毒素，溶解于85%的甲醇水溶液中，然后利用离心去除细胞破碎所产生的细胞碎片，将含有细胞内含物的甲醇水溶液的上层清夜收集起来。⑵提取过程①将每次分离出来的五个性腺组织一起用电子天平称重；②用剪刀尽可能的将这五个性腺组织剪碎、混匀；③按照3:20的比例向剪碎的性腺组织中加入已经制备好的85%的甲醇水溶液，轻轻吹打使其混匀；④取一500mL的塑料烧杯，装满冰块，将上述装有性腺组织与甲醇水溶液混合物的EP管固定在冰块中，一起放入超声波细胞粉碎机中，若高度不够，可在烧杯下垫一块泡沫板。⑤打开开关，根据需要对机器进行设置，频率为50kHz,功率为100W，时间为10分钟；⑥设置好后开始细胞破碎；⑦将破碎后的悬浊液离心，10000r/min离心10min，收集上清液于一干净的EP管中；⑧剩下的沉淀用上述方法再次抽提；⑨将两次抽提所得的上层清夜合并，在EP管上贴上标签并做好标记；⑩将上层清夜置于40℃左右的烘箱中蒸发至甲醇挥发近干。2.2.4性腺组织中藻毒素的纯化⑴纯化中洗脱液的选择洗脱液是为了将分析物尽量从固定相中洗脱以进行分析。一些文献中报道用90%的甲醇（色谱纯）洗脱。但实验发现，该洗脱液会将一些杂质同时洗脱，造成色谱峰干扰严重。因此，用100%甲醇洗脱，减少了杂质干扰。⑵纯化过程①将破碎、离心并蒸发后的浓缩液移入已预处理好的C18反相色谱柱中；②用100%的甲醇作为洗脱液将其中的微囊藻毒素从固定相中洗脱出来，让其自然流下至一洁净干燥的试管中，并根据孵化天数不同在试管上做好标记；③将所有的试管置于40℃左右的烘箱中蒸发至管内的甲醇挥发近干。2.2.5性腺组织中⑴选用的试剂盒Beacon微囊藻毒素检测试剂盒适用于水中微囊藻毒素的定量检测。⑵检测原理Beacon微囊藻毒素检测试剂盒由可以和微囊藻毒素及微囊藻毒素酶标记物结合的多克隆抗体制成。样品中的微囊藻毒素与微囊藻毒素酶标记物竞争结合数量有限的抗体结点。检测过程中，先加入微囊藻毒素酶标记物及含有微囊藻毒素的样品到测试孔中接着加入抗体，酶标记物与样品中的微囊藻毒素竞争结合同样的抗体的结合点。测试孔中包被有抗兔IgG，用于捕获加入的兔抗微囊藻毒素抗体。孵育30分钟后洗掉小孔中所有没有结合的分子。每孔中加入干净的底物溶液，连接的酶结合物可以将底物转化成蓝色化合物，一个酶分子可以转化多个底物分子。由于各个孔中抗体可结合位点是相同的，并且加入的微囊藻毒素酶标记物的量也是相同的，样品中微囊藻毒素含量低的则酶标记物结合得多，颜色会显深蓝色。反之，样品中微囊藻毒素含量高的则酶标记物结合得少，颜色会显浅蓝色。注意：颜色与微囊藻毒素的含量成反比。较深的颜色=较低的浓度较浅的颜色=较高的浓度⑶特性Beacon微囊藻毒素检测试剂盒没有区分微囊藻毒素-LR（作为标准品）及其他类型，然而可以测到微囊藻毒素的其它类型，以下表格中展示的相关值及交叉反应率（%CR），以下所有浓度均为ppb级（表2-3）。表2-3不同种类微囊藻毒素交叉反应率种类%CR微囊藻毒素-LR100微囊藻毒素-RR87微囊藻毒素-YR48Nodularin31⑷注意①不用时请将试剂盒储存于4-8℃。②不可冷冻试剂盒，不可使其暴露在大于37℃环境中。③开始实验前，所有试剂达到室温。④不可适用过期试剂。⑤不同批次的试剂不可混用。⑥使用确证方法确认阳性样品。⑸试剂盒组成①包被有羊抗兔抗体的的微孔板（12×8条）②阴性对照品一瓶（0ppb微囊藻毒素-LR）③0.1ppb,0.3ppb,0.8ppb,2ppb微囊藻毒素-LR标准品各一瓶④1.0ppb微囊藻毒素质控样品一瓶⑤微囊藻毒素HRP酶标记物一瓶⑥兔抗微囊藻毒素抗体溶液一瓶⑦底物一瓶⑧停止液一瓶（注意:1N盐酸，小心处理）⑨100×清洗液⑹需要设备①酶标仪②薄膜③计时器或表④蒸馏水或去离子水⑤振荡器⑺检测程序①将所有试剂及样品置于室温下，从铝箔袋中拿出要求数量的微孔条，放入干燥剂并重新封好袋子以免微孔条受潮。②稀释100倍浓缩清洗液为1倍清洗液，例：取5mL100倍清洗液到500mL洗瓶中并加入495mL蒸馏水。③稀释性腺组织中的藻毒素提取物，用生理盐水稀释不同孵化天数的鸭胚的性腺组织中的藻毒素提取物，将其均定容至100μL。④吸取50μL酶标记物到微孔板的每个孔中。⑤吸取50μL标准，阴性对照，样品到对应微孔中，各孔依次为阴性对照、0.1ng/mL标准品、0.3ng/mL标准品、0.8ng/mL标准品、1.0ng/mL标准品、2.0ng/mL标准品、实验组孵化13天的鸭胚性腺组织提取物、实验组孵化17天的鸭胚性腺组织提取物、实验组孵化21天的鸭胚性腺组织提取物、实验组孵化25天的鸭胚性腺组织提取物和实验组孵化29天的鸭胚性腺组织提取物。注意：必须保证每种溶液使用干净的吸头吸取，避免交叉污染。⑥加入50μL抗体溶液到每个小孔中，然后快速震荡使孔中的溶液混合，并敷上薄膜，或者微孔板可以放在振荡器上震荡孵育，从而达到在孵育期间持续震荡的效果。⑦孵育30分钟后，去掉封口膜将微孔中的溶液倒入水槽中，用1倍清洗液清洗清洗微孔（清洗时要使清洗液完全充满微孔），震荡后倒掉，重复四次，总共五次洗板。在吸水纸上拍打，尽可能将水拍干。⑧每个微孔中加入100μL底物溶液，盖上小孔再孵育30分钟。⑨按照加底物的顺序每孔中加入100μL停止液。停止液为1N盐酸，需小心操作。⑩450nm下读板，如果酶标仪有双波长，可同时测605或650nm双波长；如果酶标仪可以处理数据，可用半对数线性或4参数曲线拟合，如果为手动计算，则可按照以下部分进行。⑻计算结果读板之后，求标准，阴性对照，样品的平均吸光度值并按以下方法计算%B0：%B0=标准、阴性对照、样品吸光度值的平均值/阴性对照的平均吸光值②以%B0为Y轴，以微囊藻毒素标准浓度的半对数值为X轴，绘制曲线。③通过每个样品的%B0，在图上计算出微囊藻毒素的浓度。④如果样品%B0在设定的标准%B0范围之内，就可以得出一个具体的浓度值。如果样品%B0出了范围只能说明样品的浓度大于高浓度的标准或低于低浓度的标准。⑼质量控制①1.0ppb质控样的%B0值应该处于下面的范围之内：1.0ppbMicrocystincontrol0.80-1.30ppb②样品计算（表2-4）表2-4样品计算参考表物质吸光度值平均吸光度+/-SD%RSD%B0浓度（ppb）阴性对照1.4781.5521.515±0.0523.4100N/A0.11.2551.1941.225±0.0433.580.8N/A0.30.9410.9320.937±0.0060.6861.8N/A0.80.6260.6020.614±0.0172.740.5N/A2.00.3890.3860.302±0.0080.5425.6N/A样品0.6100.6340.622±0.0172.731.50.909结果3.1鸭胚处理结果3.1.1种鸭蛋重量统计分析使用SPSS13.0统计软件统计分析对照组（八月）与实验组（十月）种鸭蛋重量差异的显著性，结果如表3-1。表3-1对照组与实验组种鸭蛋重量差异显著性分析组别重量（平均值±标准差）显著性对照组（八月）73.16±1.00P=0.004实验组（十月）81.45±2.31由统计分析可知，P=0.004<0.05，对照组与实验组种鸭蛋重量的差异是显著的，但是，在此实验中，我们研究的是微囊藻毒素在鸭胚的组织器官中所富集的量，即不同孵化天数下，鸭胚吸收并在其体内组织器官中所积累的微囊藻毒素的量，而对照组并不注射微囊藻毒素，所以，对照组与实验组存在的重量上的差异并不会影响本次实验的最终结果。3.1.2鸭胚胎发育的过程与特征如表3-2。表3-2鸭胚胎发育的过程与特征胚龄(d)照蛋时的特征胚蛋解剖时的特征1-1.5蛋黄表面有一颗颜色稍深、四周稍亮的圆点，俗称“鱼眼珠”或“白光珠”未解剖2.5-3已经可以看见卵黄囊血管区，其形状很像樱桃，故称“樱桃珠”未解剖4卵黄囊血管的形状像静止的蚊子，俗称“蚊虫珠”。卵黄颜色稍深的下部似月牙状，又称“月牙”未解剖5蛋转动时，卵黄不易跟随转动，俗称“钉壳”。胚胎和卵黄囊血管形状像一只小的蜘蛛，故又称“小蜘蛛”未解剖5.5能明显看到黑色的眼点，俗称“起珠”、“单珠”、“起眼”未解剖7胚胎形似“电话筒”，一端是头部，另一端为弯曲增大躯干部，俗称“沉”。正面已布满扩大的卵黄和血管未解剖9正面：胚胎较易看到，像在羊水中浮游一样，俗称“浮”背面：卵黄扩大到背面，蛋转动时两边卵黄不易晃动，俗称“边口发硬”未解剖10-11蛋转动时，两边卵黄容易晃动，俗称“晃得动”。接着背面尿囊血管迅速伸展，越出卵黄，俗称“发边”未解剖12-13尿囊血管继续伸展，在蛋的小头合拢，整个蛋除气室外布满血管，俗称“合拢”、“长足”胚胎的头部偏向气室，眼裂缩小，喙具一定形状，爪角质化，全部躯干覆以绒羽。尿囊在蛋的小头完全合拢14血管开始加粗，血管颜色开始加深未解剖15血管继续加粗，颜色逐渐加深。左右两边卵黄在大头端连接未解剖16小头发亮的部分随着胚胎日龄的增加而逐渐缩小未解剖17-19小头发亮的部分逐渐缩小，蛋内黑影部分则相应增大，说明胚胎身体在逐日增长胚胎头部位于翼下，眼睛已被眼睑覆盖，横着的位置开始改变，逐渐与长轴平行。卵黄与蛋白明显减少，羊膜及尿囊中液体减少续表3-2胚龄(d)照蛋时的特征胚蛋解剖时的特征20-21以小头对准光源，看不到发亮的部分，俗称“关门”、“封门”胚胎嘴上的鼻孔已成形，小头蛋白已全部输入羊膜囊中，蛋壳与尿囊极易剥离，照蛋时看不到小头发亮的部分22-23气室朝一方倾斜，这是胚胎转身的缘故，俗称“斜口”、“转身”未解剖24-25气室内可以看见黑影在闪动，俗称“闪毛”胚胎两腿弯曲朝向头部，颈部肌肉发达，同时大转身，颈部及翼突入气室内，准备啄壳。卵黄绝大部分已进入腹中，尿囊血管逐渐萎缩，胎膜完全退化26-27起初是胚胎喙部穿破壳膜，伸入气室内，称为“起嘌”、“啄壳”未解剖27.5-29出壳出壳雏鸭出生重一般为蛋重的65%-70%，腹中尚存约有5克卵黄3.1.3本次实验中，实验组（十月）与对照组（八月）鸭胚的死亡情况如表3-3和3-4，以及图3-1、3-2、3-3和3-4。表3-3不同月份不同孵化天数鸭胚的死亡量组别不同胚龄的死亡量（个）5天9天13天17天21天25天29天总计对照(八月)02300218实验(十月)141526533470实验组（十月）的鸭胚注射了0.1μg纯的微囊藻毒素，所以，其总体的死亡量比较高，但这并没有影响实验的顺利进行。表3-4不同月份不同孵化天数鸭胚的死亡率组别不同胚龄的死亡率5天9天13天17天21天25天29天总死亡率对照(八月)0%5.00%9.09%0%0%13.33%12.50%2.00%实验(十月)14.00%17.44%39.39%14.29%12.00%17.65%28.57%70.00%图3-1八月份对照组鸭胚死亡量变化图3-2十月份实验组鸭胚死亡量变化图3-3八月份对照组鸭胚死亡率变化图3-4十月份实验组鸭胚死亡率变化3.2性腺检测结果3.2.1性腺分离根据实验的设计，解剖不同孵化天数的鸭胚，每次解剖5只，从胚体中分离出性腺组织合并，低温冷冻保存待检。其总体的取样量如表3-5。表3-5不同孵化天数鸭胚性腺组织的取样量不同胚龄性腺组织取样量（g）13天17天21天25天29天实验组(n=5)0.01960.02170.03730.03500.02603.2.2破碎、离心及纯化分离得到的性腺组织，采用85%的甲醇水溶液，通过细胞破碎、离心等方法，提取出其内含的微囊藻毒素，然后经C18反相色谱柱纯化富集，并将甲醇水溶液蒸发近干后，就得到了将要用于进行ELISA检测的性腺组织微囊藻毒素浓缩液，此浓缩液有略微呈乳白色，且随着孵化天数的增加，颜色加深。3.3组织中微囊藻毒素的检测结果将纯化得到的微囊藻毒素浓缩液均定容至100μL，然后进行ELISA检测。本次实验中，我们一共进行了4次ELISA检测。⑴第一次ELISA检测图3-5第一次ELISA检测拟合曲线由软件通过曲线拟合的标准曲线公式为：y=2.0639-2.0619*x，相关系数为：0.8749。其中x为吸光度。由该公式计算得出第一次ELISA检测的结果（表3-6）。表3-6第一次ELISA检测结果标准/标准品吸光度浓度(μg/μL)阴性对照1.357-0.7340.1ng/mL1.076-0.1550.3ng/mL0.7050.6100.8ng/mL0.4241.1891.0ng/mL0.3471.348续表3-6标准/标准品吸光度浓度(μg/μL)2.0ng/mL0.2471.555实验组13天胚龄鸭胚性腺中藻毒素0.7500.517实验组17天胚龄鸭胚性腺中藻毒素0.9980.006实验组21天胚龄鸭胚性腺中藻毒素1.008-0.014实验组25天胚龄鸭胚性腺中藻毒素0.6230.779实验组29天胚龄鸭胚性腺中藻毒素0.8120.390第一次的ELISA检测得出的性腺组织中微囊藻毒素的浓度数据不理想，所以，我们进行了第二次ELISA检测。⑵第二次ELISA检测图3-6第二次ELISA检测拟合曲线由软件通过曲线拟合的标准曲线公式为：y=0.0464-2.7671*lg(x)，相关系数为：0.9353。其中x为吸光度。由该公式计算得出第二次ELISA检测的结果（见表3-7）。表3-7第二次ELISA检测结果标准/标准品吸光度浓度(μg/μL)阴性对照1.514-0.452续表3-7标准/标准品吸光度浓度(μg/μL)0.1ng/mL1.133-0.1070.3ng/mL0.7490.3940.8ng/mL0.4411.0301.0ng/mL0.3471.3182.0ng/mL0.2631.652实验组13天胚龄鸭胚性腺中藻毒素0.5980.664实验组17天胚龄鸭胚性腺中藻毒素0.8700.214实验组21天胚龄鸭胚性腺中藻毒素0.7580.379实验组25天胚龄鸭胚性腺中藻毒素0.5130.849实验组29天胚龄鸭胚性腺中藻毒素0.7160.448经过两次ELISA检测，得出的性腺中藻毒素浓度数据均不是很理想，但由于不同孵化天数的鸭胚的性腺组织中提取出的微囊藻毒素均只有100μL，而每次ELISA检测需要50μL，因此两次检测后，性腺组织中的微囊藻毒素提取物已用完。所以我们选用相同鸭胚中的肝脏组织的微囊藻毒素提取物来进行ELISA检测，以探索实验中可能存在的问题。⑶第三次ELISA检测图3-7第三次ELISA检测拟合曲线由软件通过曲线拟合的标准曲线公式为：y=-0.5195-3.0316*lg(x)，相关系数为：0.9245。其中x为吸光度。由该公式计算得出第三次ELISA检测的结果（见表3-8）。表3-8第三次ELISA检测结果标准/标准品吸光度浓度(μg/μL)阴性对照0.927-0.4200.1ng/mL0.727-0.0990.3ng/mL0.5010.8580.8ng/mL0.3031.0531.0ng/mL0.2621.2442.0ng/mL0.1981.613实验组13天胚龄鸭胚肝脏中藻毒素0.5490.270实验组17天胚龄鸭胚肝脏中藻毒素0.818-0.225实验组21天胚龄鸭胚肝脏中藻毒素0.5970.160实验组25天胚龄鸭胚肝脏中藻毒素0.5700.221实验组29天胚龄鸭胚肝脏中藻毒素0.754-0.148第三次的ELISA检测由于在操作过程中出现了一点小失误，所以最后得出的数据不能作为参考，因此，我们进行了第四次ELISA检测。⑷第四次ELISA检测图3-8第四次ELISA检测拟合曲线由软件通过曲线拟合的标准曲线公式为：y=-0.3357-3.4367*lg(x)，相关系数为：0.9399。其中x为吸光度。由该公式计算得出第四次ELISA检测的结果（见表3-9）。表3-9第四次ELISA检测结果标准/标准品吸光度浓度(μg/μL)阴性对照1.037-0.3900.1ng/mL0.847-0.0880.3ng/mL0.6210.3750.8ng/mL0.4120.9981.0ng/mL0.3431.2612.0ng/mL0.2621.663实验组13天胚龄鸭胚肝脏中藻毒素0.7230.148实验组17天胚龄鸭胚肝脏中藻毒素0.7580.078实验组21天胚龄鸭胚肝脏中藻毒素0.6570.291实验组25天胚龄鸭胚肝脏中藻毒素0.6280.359实验组29天胚龄鸭胚肝脏中藻毒素0.7750.0454．讨论微囊藻毒素是由蓝藻细菌产生的一类毒性很强的天然环肽毒素，有研究表明，其所具有的毒性与化学类有机磷神经毒剂相当[13]，非常厉害，对于接触过的人和动物都会产生致命性的危害。微囊藻毒素一般存在于含有蓝藻细菌的水体中，且因为它所具有的特殊的氨基酸结构，使得微囊藻毒素通常具有比较好的热稳定性，对其用100℃水浴加热煮沸也不会使其丧失毒性[14]，另外，我们平时生活中处理自来水所使用的混凝、沉淀、过滤和加氯等方法均不能彻底的将水体中的微囊藻毒素除尽[15-16]，再加上它能够抵抗pH值的变化、也不会被一些普通的蛋白水解酶所降解[17]。这些性质都使得微囊藻毒素能够在水体中不断的累积并稳定的存在。这对于周围环境中的动物、植物以及人类来说都是相当危险的。水是万物维持自身生命活动所不能缺少的物质，而水也是微囊藻毒素进入动、植物以及人体内的最主要途径。鱼、虾、蟹以及家禽类动物饮用了含有微囊藻毒素的水后，水中的微囊藻毒素就会在它们体内富集，慢慢的使它们体内的一些组织器官产生有害的变化，虽然这些动物都对微囊藻毒素有一定的抵抗能力，但当富集在体内的微囊藻毒素浓度达到一定的程度后，就会导致其死亡。对人体来说也是一样的，人体若是摄入了这些被微囊藻毒素污染的动物或是饮用水等，也会将微囊藻毒素带入体内并在体内不断积累，攻击体内的肝脏、性腺等组织器官，久而久之，各器官都会产生不同程度的病变，严重时也能致人死亡。因此，微囊藻毒素受到了越来越多的关注与研究。本次实验中，我们选用了鸭胚作为实验对象，对其注射一定量的适当浓度的微囊藻毒素，然后在不同的孵化时间点解剖相同数量的鸭胚，分离出性腺组织，通过细胞破碎、离心、过柱纯化以及酶联免疫吸附检测等步骤，研究微囊藻毒素在不同胚龄的鸭胚性腺组织中累积的情况。在实验中，我们所使用的微囊藻毒素是从北京伊普瑞斯科技有限公司购买来的纯种的微囊藻毒素，对于这种微囊藻毒素所具有的毒性作用到底有多强烈，我们并不是很了解。因此，在正式实验之前，我们进行了多次的预实验，以确定正式实验中，每枚种鸭蛋应该注射的微囊藻毒素的浓度与剂量。第一次预实验时，我们配制的微囊藻毒素溶液的浓度为16μg/50μL（1mg微囊藻毒素：3.125mL蒸馏水），并给每枚种鸭蛋注射50μL的剂量，即16μg/egg。然后每天照蛋观察，结果所有注射过微囊藻毒素的鸭胚胎在注射后的一个星期内几乎全部死亡了，所以16μg/egg的剂量过高，鸭胚不能耐受。第二次预实验时，我们配制的微囊藻毒素溶液的浓度为10μg/50μL（1mg微囊藻毒素：5mL蒸馏水），依然每枚种鸭蛋注射50μL的剂量，即10μg/egg。结果鸭胚胎的死亡情况与第一次预实验时差不多，死亡率也过高，所以10μg/egg的剂量鸭胚依然不能耐受。于是，我们又进行了8μg/egg（1mg微囊藻毒素：6.25mL蒸馏水）、3μg/egg（1mg微囊藻毒素：16.67mL蒸馏水）、1μg/egg（1mg微囊藻毒素：50mL蒸馏水）这三种浓度的预实验，三次预实验中，鸭胚胎的死亡率依然很高，说明微囊藻毒素的浓度太高了，鸭胚都不能够耐受。最后，我们进行了0.1μg/egg（1mg微囊藻毒素：500mL蒸馏水）的浓度试验，结果发现鸭胚胎的死亡情况明显好转，死亡率下降，说明鸭胚胎在一定程度上能够耐受0.1μg/egg的微囊藻毒素浓度。通过上述多次的预实验，最终确定了微囊藻毒素注射的浓度为0.1μg/50μL，剂量为每枚蛋50μL，即0.1μg/egg。在正式实验中，我们按照预定的方法和步骤纯化出鸭胚性腺组织中的微囊藻毒素，并进行了四次ELISA检测。以下是本人对这4次的ELISA检测的结果以及在过程中可能存在的问题的初步分析。第一次ELISA检测得出的数据从理论上来说不太正确，13天、25天以及29天胚龄的鸭胚性腺组织中的微囊藻毒素浓度过高了，而17天胚龄的鸭胚性腺组织中微囊藻毒素的浓度又有一些低，21天胚龄的鸭胚性腺组织中的微囊藻毒素浓度甚至为负数，考虑到可能是因为第一次操作，对步骤过程不太熟悉，操作中可能存在着一些漏洞，所以才导致了最后的结果不正确。因此，我们进行了第二次ELISA检测，结果得出的数据比第一次略好一些，没有像第一次一样出现负数的现象，但所有胚龄的鸭胚性腺组织中的微囊藻毒素浓度均过高了，且所得出的数据与鸭胚的胚龄不呈比例，所以在理论上依然不是最正确的。经过这两次的ELISA检测，我们考虑到所用的ELISA试剂盒虽然没过期，但已经放置了一年左右，所以导致了检测出的结果不正确，于是我们使用了新购买的ELISA试剂盒进行了第三次ELISA检测。但由于鸭胚中的性腺组织都比较小，从其中提取出来的物质也就相对要少一些，且经过前两次的ELISA检测，从鸭胚性腺组织中所提取出的微囊藻毒素已经用完了，所以在第三次ELISA检测中，我们使用了从相同的鸭胚的肝脏组织中采用相同的方法步骤提取出来的微囊藻毒素进行检测，以探究是否是试剂盒过期而造成了检测出的结果不正确。但第三次的检测在操作的过程中出现了一些小失误，这也可能是导致到最后的结果中出现了负数且数据依然不呈比例的原因，不过在这一次的检测中，所检测出的肝脏组织中的微囊藻毒素的浓度比前两次ELISA试验中所检测出的性腺组织中的微囊藻毒素的浓度有明显的降低，结合一些相关文献以及微囊藻毒素所具有的性质，可知一般情况下微囊藻毒素进入人或动物体内，最先危害的是肝脏组织，因此肝脏组织中所累积的微囊藻毒素量应该是最高，然而本次检测出的肝脏组织中的微囊藻毒素的浓度比前两次检测中的性腺组织微囊藻毒素浓度还要低，说明前两次所使用的试剂盒可能存在一些问题。但由于第三次检测的过程中存在着一些失误，其检测出的结果不能绝对的说明问题，因此，我们又用鸭胚肝脏组织中提取的微囊藻毒素进行了第四次ELISA检测。第四次检测中不存在操作方面的问题，检测后所得出的数据比第三次检测的结果要略好一些，所得数据中没有出现负数情况且微囊藻毒素的浓度没有太高，但是这些数据依然与鸭胚胚龄不呈比例。通过上述四次ELISA检测所得出的鸭胚性腺组织与肝脏组织中的微囊藻毒素的浓度的结果，本人认为虽然最后检测出的浓度都不是太正确，但是检测出的阴性对照与标准品的浓度并没有很大的偏差，在理论允许的范围之内，所以ELISA检测中所使用的试剂盒以及检测过程中的操作方法等方面的原因应该不是造成最终的检测结果出现错误的主要因素。综上所述，本人认为导致最终结果错误的最主要的因素很有可能是在过柱纯化这一步骤上。因此对该方面做了一下简要的分析。在本次实验中，我们所使用的纯化设备为C18反相色谱柱，在进行纯化步骤之前，我们查阅了一些相关的文献，综合了所阅文献中的各要点以及数据，得出了C18反相色谱柱的分离纯化步骤（在该论文第6页的中间段有具体写出），即把破碎、离心并蒸发后的浓缩液通过预处理好的C18反相色谱柱，然后用100%的甲醇将其中的微囊藻毒素从色谱柱的固定相中洗脱下来。但是，用此方法纯化出的微囊藻毒素经ELISA检测后得出的数据并不是很正确，所以本人又再次查阅了另一些相关文献，结果发现，我们之前所总结出的分离纯化步骤中缺少了淋洗的过程，淋洗是为了将这些从组织中提取出来的浓缩物中可能存在的一些杂质去除，使得最后得到的微囊藻毒素更纯化[18]。且淋洗液的选择也非常的重要，过低会无法有效地除去浓缩物中的杂质，过高则可能将微囊藻毒素也一起淋洗掉。目前，已经有报道称先用20%、30%的甲醇各10mL淋洗，待吹干后再用5mL40%的甲醇淋洗，通过这样，可以有效地除去杂质且不会带出需要的微囊藻毒素，另外，该文献在洗脱液的选择方面也有不同的报道，他们认为若是用100%的甲醇作为洗脱液，其极性太强了，很有可能会将少量小柱上的填料也一起洗脱下来，在一定程度上增加了洗脱液中杂质的含量，因此，他们认为70%的甲醇作为洗脱液是最合适的[19]。结合上述相关的文献报道以及实验所得出的最终结果，本人认为本次实验中所检测出的微囊藻毒素的浓度都或多或少的有一些偏高是由于在分离纯化的过程方面存在着一定程度上的失误。因为分离纯化时没有将组织中所提取出的浓缩液中可能含有的除了微囊藻毒素之外的一些杂质除去，且所使用的洗脱液的浓度可能太高了，会将色谱柱上的填料也一起洗脱下来，反而增加了最后的杂质含量，使得所检测出的微囊藻毒素浓度过高了。另外，四次检测中微囊藻毒素的浓度并不是按照鸭胚胚龄的增加而升高的，这一点也与理论不符合，究其原因，也应该是在分离纯化上的失误。实验中出现了这些问题，主要是由于我们对纯化方面的知识点了解的不够详细深入且对文献查阅的不够全面客观，这还有待于在日后的研究工作中继续改进与完善。虽然本次实验最终得出的鸭胚性腺组织中微囊藻毒素的含量并不完全正确，没有与鸭胚的胚龄呈现正比关系，但是，从数据中，我们还是可以发现微囊藻毒素进入鸭胚体后会在其体内的性腺组织中富集，说明性腺组织也是微囊藻毒素的作用器官，且纯微囊藻毒素对鸭胚的致死作用是较大的。5．总结与展望微囊藻毒素是一种众所周知的肝毒素，且大量的研究都是针对其对于肝脏组织的损害而进行的。但是，随着研究的不断深入，研究人员发现微囊藻毒素对于性腺组织也存在着不小的伤害，并且推断性腺应该是仅次于肝脏的第2个微囊藻毒素的靶器官[20-21]，且性腺作为生殖系统很有可能会将这种毒性影响传递给后一代[22]。因此，本实验以鸭胚胎为材料，研究微囊藻毒素在鸭胚性腺组织中富集的状况，以探索微囊藻毒素对于动物性腺组织的危害情况。目前，微囊藻毒素的污染已十分严重了，这对于生活在水中的动、植物以及我们人类来说都是非常危险的。因此，用水禽类动物的胚胎为对象，研究微囊藻毒素对水产养殖以及家禽类食品安全性的影响有着非常重要的意义，且也有待于进一步研究。参考文献[1]黄书铭,张晟,张勇,等.水体中微囊藻毒素的毒性与检测方法的研究进展[J].安徽农业科学,2007,35(25):7767-7769[2]周宇.太湖地区市售饮用水中微囊藻毒素-LR含量水平调查分析[J].中国食品卫生杂质,2010,22(1):68-69[3]闫海,潘纲,张明明.微囊藻毒素研究进展[J].生态学报,2002,22(11):1968-1975[4]ShenPP,ShiQ,HuaZC,eta1.AnalysisofmicrocystinsincyanohacteriabloomsandsurfacewatersamplesfromMeiliangBay,TaihuLake,China[J].EnvironInt,2003,29:[5]YoshizawS,MatsushimaR.,Watana,etal.Inhibitionofproteinphosphatasesbymicrocystisandnodularinassociatedwithhepatotoxicity[J].CancerResClinOncol,1990,116:609-614[6]ElsaDias,MarianaAndrade,ElsaAlverca,etal.Comparativestudyofthecytotoxiceffectofmicrocistin-LRandpurifiedextractsfromMicrocystisaeruginosaonakidneycellline[J].Toxicon,2009,53:487-495[7]CarmichaelW.Useofacolorimericproteinphosphataseinhibitionassayandenzymelinkedimmunosorbentassayforthestudyofmicrocystinsandnodularin[J].Toxicon,1994,32(1):495-507[8]DuyTN,LampK,ShawGR.Toxicologyandriskassessmentoffreshwatercyanobacterial(Blue-greenalgae)toxinsinwater[J].RevEnvironContamToxicol,2000,163:113-186[9]FalconerIR,YeungDS.Cytoskeletalchangesinhepatocytesinducedbymicrocystistoxinsandtheirrelationtohyperphosphorilationofcellproteins[J].ChemBiolInteract,1992,81:181-196[10]UenoY,NagataST,sutsumiT,etal.Detectionofmicrocystins,ablue-greenalgalhepatotoxins,indrinkingwatersampledinHaimenandFusui,endemicareasofprimarylivercancerinChina,byhighlysensitiveimmunoassay[J].Carcinogenesis,1996,17(6):1317-1321[11]王伟琴,庞晓露,金永堂.微囊藻毒素遗传毒性检测方法研究进展[J].中国公共卫生,2010,26(1):124-126[12]HaradK,ImanishiS,KatoH,etal.IsolationofAddafrommicrocystin-LRbymicrobialdegradation[J].Toxicon,2004,44:107-109[13]DawsonRM.Thetoxicologyofmicrocystins[J].Toxicon,1998,[14]柳丽丽,钟儒刚,曾毅.微囊藻