透明质酸(玻尿酸)

目录TOC\o"1-3"\h\u220261、透明质酸的简介 226232、透明质酸的结构及理化性质 297862.1透明质酸的结构 2262832.2透明质酸理化性质 2280632.3透明质酸生理功能 3121853透明质酸的制备方法 356533.1动物组织提取法 327103.2酶聚人工合成法 4280723.3微生物发酵法 464973.3.1透明质酸生产菌株的选育 549543.3.2透明质酸发酵条件的优化 5312803.3.3透明质酸的提取 689254透明质酸的改性 11161204.1酯化改性 11243724.2酰胺化改性 12153674.3交联改性 13233964.4疏水改性 14206054.5接枝改性 15229334.6还原末端改性 1680265透明质酸的应用 1772515.1在化妆品中的应用 1797945.2在临床医学中的应用 187255.3在保健食品中的应用 18182186透明质酸的国内外生产研究现状及常见产品 18205926.1透明质酸的国内外生产研究现状 18175366.2常见产品 20165407我的设计方案 2027539参考文献： 22透明质酸简介1、透明质酸的简介透明质酸(HyaluronicAcid，简称HA)，又名“玻璃酸”，是一种不含硫酸基团的天然粘多糖，广泛分布于动物和人体的细胞外基质中，在皮肤、肺和肠中含量较高(大于50%)，同时也存在于滑液、脐带和血液中。透明质酸另一名称为玻尿酸，但是玻尿酸与\o"尿酸"尿酸没有任何关系。透明质酸因其独特的理化性质和生物学功能，被广泛应用于临床医学、高级化妆品、美容整形和保健食品等领域。但天然透明质酸存在稳定性较差、易发生降解和亲水性过强等缺点，限制了其应用，因此通过对透明质酸修饰改性，从而开拓具有新的生物活性和功能性的透明质酸衍生物成为目前研究的热点[1]。2、透明质酸的结构及理化性质2.1透明质酸的结构透明质酸是一种高分子的聚合物。是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级直链粘多糖。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1，3-配糖键相连，双糖单位之间由β-1，4-配糖键相连。分子中两种单糖按1:1的摩尔比组成。双糖单位可达25000之多。在体内透明质酸的分子量从5千到2千万道尔顿[2,3]。2.2透明质酸理化性质电子显微镜下观察证实HA为一线性单链,分子量为4×106,链长约为10μm。由于直链链轴上单糖之间氢键的作用,HA分子在空间呈刚性的螺旋柱型,其半径为200nm,柱内侧因有大量羟基而产生强亲水性。在溶液中HA结合的水分可达其本身重量的1000倍,且这些水在螺旋柱内固定不动,不易流失[4]。HA水溶液是一种非牛顿型流体,有着良好的粘弹性和应变性。一般来说,溶液浓度和分子量的增加会使溶液粘度增加。低浓度的HA溶液主要表现为粘性,而高浓度溶液则主要显示其弹性[5]。2.3透明质酸生理功能在生物组织中，HA以游离形式广泛分布于结缔组织的细胞外基质中，是细胞外基质（ECM）的主要成分之一，在保持组织抗压缩性及张力和维持组织形态方面具有重要作用。而HA在体内不仅是通过其粘弹性、大分子网状结构等发挥细胞连接、物理屏障、渗透压调节和机械离缓冲等功能，而且具有灭活自由基、调节细胞功能等生理活性，在肿瘤扩散、伤口愈合、胚胎形成、抑制疼痛和炎症反应中具有重要的作用[6]。HA为关节滑液的主要成分之一，因其独特的润滑特性，对维持关节功能具有重要意义（杨小立，2006；王国金，2009；Gastonetal.，2007）。据研究表明（郭学平等，2002）HA具有抗皮肤衰老和防止皮肤皱纹形成功能，阳光中紫外线照射所产生的活性氧自由基能被表皮中的HA可清除，保护皮肤免受其害，被称为高效的自由基“清道夫”。HA在皮肤中表现的生理功能还有保水作用，维持细胞外的空间，参与角蛋白细胞的变化过程和受体结合作用等。3透明质酸的制备方法3.1动物组织提取法HA几乎存在于所有的动物组织中，分布广泛。提取HA的传统方法是以动物组织为原料，从人脐带（LagoaGetal.，2005；沈渤江等，1985）、鸡冠（颜延宁，2006）、牛羊眼珠的玻璃体（TadashiYetal.，2004）、鲸鱼软骨中（E.Yu.Ignatovaetal.，1990）来提取HA。动物组织提取法对原料要求较高，原料必须是新鲜采集的，并经过冷冻处理。动物原料组织价格昂贵、来源困难，并这些动物原料组织中HA纯度低、收率低。在提取过程中，要消耗大量的有机溶剂和酶，并且操作单元多、工艺复杂，会大大增加制备HA的成本。此外，从动物组织中提取的HA杂质含量高，产品精制困难。总之，由于该方法制备HA生产成本高，原料来源有限，HA纯化工艺复杂，动物原料组织提取法已不能满足目前市场的需要，已逐渐被发酵法所取代。3.2酶聚人工合成法通过研究表明,在生物体内HA是通过透明质酸合成酶催化UDP-G1cA和UDP-G1cNAc合成[7]利用单体酶催化在体外聚合合成透明质酸,首先使用多糖类聚合物合成透明质酸氧氮杂环戊烯衍生物,然后添加透明质酸分解酶制造出衍生物和酶的复合体,接着在90℃反应液中清除其中的酶合成透明质酸,然后再对其进行沉淀、分离即可得到透明质酸精品。凌敏等[8]根据从Streptococcusequi扩增出透明质酸合成酶(sqHAS)基因,构建表达质粒pSE-sqHAS并转化大肠杆菌DHSa,诱导培养后在细胞膜中检测到sqHAS蛋白及活性。利用携带该酶的细胞膜以UDP-G1cA和UDP-G1cNAc为底物在体外合成了分子量为3.6×106Da的HA,分别是发酵法生产和提取法生产的HA的分子量的2.5倍和5倍左右。但是HA体外合成的前体物质价格昂贵,难于应用于实际工业化生产中,因此这种方法仅适用于生产高分子量、高纯度具有特殊用途的HA。3.3微生物发酵法发酵法制备透明质酸可以最早可以追溯到70年代，但一直没有大量开发，直到1985年，日本资生堂首次报道了用链球菌生产透明质酸的方法后，发酵法制备透明质酸才有了长足的进展。已报道的产透明质酸菌主要为伯杰氏手册中链球菌的A组与C组，如化脓链球菌(StreptococcuspyogenesA群)、兽疫链球菌(Streptococcus200epidemicus(群))、马疫链球菌(Streptococcuseguic群)、类马链球菌(Streptococcuseguismilisc群)、缺乳链球菌(c群)、鸡霍乱杆菌等。A群主要是化脓链球菌，系人体致病菌，不宜作为生产菌种，目前很少使用。C群链球菌为非人体致病菌，相对来说适用于工业生产。国外近年来利用C群链球菌生产透明质酸已达到产业化阶段。利用发酵法制备透明质酸的品质主要取决于如下四个方面：菌种的筛选、培养基的选配、发酵工艺的优化和分离提纯过程。生物发酵法的优点是产品不受原料资源限制、工艺简单并且成本低，所以目前对于透明质酸的制备多选用发酵法。发酵法制备透明质酸目前所用的菌种主要有兽疫链球菌、马疫链球菌和类马疫链球菌等。发酵法制备透明质酸分为需氧发酵和厌氧发酵，其中需氧发酵产率高且得到的透明质酸分子量高。在发酵过程中，温度通常为37℃，pH值需要控制在6.0-8.5范围内，过酸过碱的环境都会影响菌体生长，降低透明质酸的产率。也可在不同发酵阶段采用不同的溶氧量来提高透明质酸的产率。此外，发酵液黏度可直观反映出透明质酸的产率，透明质酸的假塑性在高剪切速率作用溶液黏度下降，高搅拌速率能显著提高透明质酸的分子量，但过高的速度会破坏分子反而降低透明质酸的分子量，所以搅拌速度通常控制在100~800r/min。也可通过在发酵液中加入少量尿嘧啶、谷氨酰胺和天冬氨酸，或加入溶菌酶来提高透明质酸产率[9-12]。3.3.1透明质酸生产菌株的选育野生型的链球菌作为HA产生菌,首先要经过诱变使其成为溶血素和透明质酸酶缺陷型菌株。链球菌多会产生溶血素(Streptolysin),溶血素有溶解红细胞、杀死白细胞和毒害心脏的作用。溶血素混入成品HA,还会使HA的品质降低,不能用于医药品和化妆品,所以规模生产必须获得非溶血性的菌株。邓开野[13]从血琼脂平板上筛选出一株不具有溶血性的突变菌株,其性能比原始菌株有很大提高。野生型的产生HA的链球菌在产生透明质酸的同时产生透明质酸酶,透明质酸酶可将透明质酸降解或低分子量化,因此透明质酸酶的产生对HA的发酵非常不利。虽可采用在发酵培养集中添加透明质酸酶的抑制剂,如藻酸硫酸盐等的方式来提高HA的产量。但现在发酵生产上所采用的菌种,一般都是经诱变处理得到的透明质酸酶的缺陷型。冯建成[14]对马疫链球菌SH-0进行诱变,筛选出溶血素和透明质酸酶双缺陷型突变菌株SH-2,使透明质酸产量提高5倍。诱变菌种的目的是为了获得HA产量高、优良性状稳定的菌株。孙建[15]通过紫外线和NTG复合诱变处理得到溶血性弱的菌株,突变菌株比出发菌株透明质酸产量提高1倍以上。张淑荣等[16]利用物理方法紫外线,γ射线及辅助磁场筛选诱变兽疫链球菌,研究获得性状优良,产量相对稳定的透明质酸高产菌种,透明质酸产量可稳定在3～5g/L。罗强[17]采用NTG诱变原生质体,选育了一株产透明质酸的兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)H235。化学诱变剂污染环境、操作不安全,因此较为安全的物理诱变方法越来越受到人们的关注,但诱变剂量的大小以及突变后菌株的回复突变是采用物理诱变剂所需进一步研究的工作。目前,HA产生菌的诱变方法多为紫外线照射和化学诱变剂等常规方法。另外,郝宁[18]等运用基因诱变育种将vgb基因导入兽疫链球菌以促进细胞在低氧状态下的生长,同时HA合成基因的导入将增加HA合成途径的前体供应,使HA产量增加31%。此法生产的HA相对分子质量相对均一、分散性小,由于2个前体物UDP-N-乙酰氨基葡糖和UDP-葡萄糖醛酸价格昂贵。因此,此法生产HA成本高,目前只用于实验室中。3.3.2透明质酸发酵条件的优化链球菌的营养需求较为苛刻,通常在含血清、脑心浸液等培养基上菌体才能较好地生长,但这类营养物质价格昂贵,大规模生产成本太高,所以通常以蛋白胨、酵母膏或浸出粉、牛肉浸膏等的复合氮源代替。另外,有研究表明在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸,可以提高HA的产率。国内外文献资料大多使用葡萄糖作为碳源,也有用蔗糖、半乳糖等研究链球菌的利用情况,姚敏杰等[19]以不同碳源进行对比实验,发现只有蔗糖不能被利用,而高海军[20]等发现蔗糖仅比葡萄糖利用率低。考察兽疫链球菌对于常用碳源的利用情况,发现可溶性淀粉作碳源其菌体量和透明质酸产量较大;其次,才为葡萄糖和蔗糖。产生如此大的差异的原因是因为菌种的差异还是方法所造成的仍需要深入的研究。氮源不仅为菌体长氮元素,而且大多数有机氮源还能提供多种生长因子。国外有报道用化学合成培养(Chemicaldefinedmedia)与酵母粉为复合氮源培养基比较,发现在化学合成培养基中兽疫链球菌生长速率降低,而HA产率系数和比合成率却与复合氮源中的类似。国内大多采用有机物作为氮源,包括胨、酵母膏、大豆水解物等。不同的菌株对于氮源利用情况相差也大,高海军[21]等发现酵母膏作为单一氮源时,HA产量及菌体量均较高,其次为酵母膏与蛋白胨的混合氮源以及玉米浆。安海平[22]等发现对于马链球菌N2506,蛋白胨与酵母膏以1:1比例效果最好,无机氮源对HA发酵过程作用不大。Ogrodowski等[23]发现添加溶菌酶能够提高透明质酸的产量,这是因为透明质酸生产菌需分泌大量的透明质酸以保护其细胞壁免遭破坏;同时,溶菌酶能诱导透明质酸合成酶的活性。在发酵过程中添加含有羟基的酚类化合物如苯酚、丹宁等能大幅提高透明质酸的产量;此外葡糖胺、丙酮酸、尿嘧啶等因为是HA合成的前体物质,通过添加也可获得高分子量的HA[24]。孟庆繁[25]添加十二烷基硫酸钠(SDS)能够大幅度提高HA产量。这是因为菌体在产生HA的同时会产生HA酶,该酶可以使HA分解,导致HA产量下降。而SDS作为HA酶活性抑制剂,保护HA不被降解。3.3.3透明质酸的提取发酵法之所以没有得到广泛应用其原因是多方面的,其中对发酵液中HA产物的提取工艺不成熟是一个重要方面。具体表现在缺少一条被广泛认可和接受的可用于工业生产的下游分离工艺。分离纯化发酵液中的HA有多种报道,如有机溶剂沉淀法、离子交换法等。沉淀HA的有机溶剂有乙醇、丙酮、乙酸等,有机溶剂的作用是通过降低水溶液的介电常数从而增加溶质分子异性电荷库仑力的引力达到沉淀的目的。预处理预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺。对于一些非透明质酸酶缺陷型菌株发酵所得的发酵液，通过预处理可以杀灭透明质酸酶，减少HA分子量的降低。史鹏等[26]采用两种预处理方式进行灭酶，热处理方式为发酵液在70℃下保温1h，静置5h；酸处理方式为发酵液用三氯乙酸调pH值至4.5，1h后回调至6.0，静置5h，两种预处理方式的蛋白质去除率、HA得率很接近，但酸处理的分子量降低率要低于热处理，表明酸处理能更有效的抑制透明质酸酶的活性。杀灭发酵液中的菌体通常加入杀菌剂，常用的杀菌剂包括三氯乙酸、氯仿等。三氯乙酸可以溶解细胞上的脂类物质，使细胞破坏，从而起到灭菌和抑制酶活力的作用。氯仿和三氯乙酸的作用类似，能够使HA逐渐从细胞膜上脱落[27]，使蛋白质变性沉淀，并能渗入细胞膜，除去细菌内毒素等致炎物质，使HA产品安全性提高[28]。采用加热进行灭菌，灭菌温度一般为75～80℃[29]，国外专利报道，将发酵液加热到90℃，再除去菌体[30]。 通过有效除菌可以改善分离效果，使HA分离得率提高，同时也可以去除部分杂蛋白。除菌的方法较多，祝庆等[31]比较了微滤除菌和经盐酸、甲醛和三氯乙酸分别处理后再离心除菌的效果，发现微滤除菌效果最好，但微滤过程中需要加压和不断稀释，在后期沉淀阶段需消耗大量有机溶剂，滤速慢也使得整个分离周期延长，因此工业化生产可行性不大。相对于盐酸法、甲醛法，三氯乙酸除菌法HA产量和质量均有提高，这是由于三氯乙酸的加入使HA与蛋白质的络合有一定的解除。邓禹等[32]采用25g/L三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀，以混合硅藻土为过滤助剂，再配以特定的后处理工艺，所得成品透明质酸中蛋白质含量仅为0.047%。周荣清等[33]比较了絮凝、离心、三氯乙酸3种预处理方式对超滤膜污染的影响，所采用的絮凝剂为阴离子型聚丙烯酰胺（AN926），添加量为100×10－3mg/mL，絮凝预处理的上清液经超滤后膜通量降低率仅为其它两种方法的1/10，表明絮凝法预处理可以有效除去菌体和杂蛋白，改善膜分离效果郭育涛等[27]采用发酵液中加入2倍体积的氯仿除菌体的方法，在28℃、pH值为7.0的条件下搅拌60min，离心后，HA提取率达97.5%，纯度达97.3%。国外专利报道了采用过滤除去菌体的方法[33,34]。盛瑞堂等[35]也采用过滤法除去菌体，并发现使用硅藻土作为吸附剂时的滤液浊度和终滤液HA收率优于活性炭。在HA发酵结束后，将发酵液加入工业乙醇得到HA粗品沉淀，以20g/L的浓度溶于去离子水，加入硅藻土，充分搅拌以吸附菌体杂质，在pH值4.6～4.8的条件下过滤，滤液在pH值为4.8时浊度最小，在pH值为4.6时蛋白含量最低，蛋白含量和浊度变化趋势随pH值改变基本一致。过滤法除菌体是物理过程，操作简便，效果明显，并且容易在工业化生产中应用。分离工艺.1乙醇分离除去发酵液中的菌体后，需要将HA分离出来，这是一个初步纯化的过程。乙醇沉淀是分离各种多糖常用的一种方法，可以使HA有效脱水、脱色，从而提高HA产品品质[26]。为了使HA完全沉淀，溶液中应有足够的离子强度，常加入浓度为1%左右的NaCl或NaAc以达到适宜的离子强度。乙醇添加量一般为发酵液体积的2倍[27]，如果乙醇添加量足够大，HA浓度低至0.1%也可沉淀完全[28]。HA溶液具有较高的黏度，乙醇沉淀时如果HA浓度过高，沉淀趋向于糖浆状而难以分离；如果浓度过低，所需乙醇量偏大，不利于降低成本[29]。预处理时由于发酵液黏度较高，离心或过滤前往往要对发酵液进行稀释，HA常因稀释而浓度较低，直接采用乙醇沉淀会消耗大量乙醇，而浓缩可以减少乙醇用量。盛瑞堂等[35]采用超滤法对过滤后的发酵液进行浓缩，使HA溶液体积减少了67.1%，相应的乙醇用量降低了67.1%。孙宏伟等[36]应用气隙式膜蒸馏分离技术对发酵液进行浓缩分离，使用膜孔径为0.2µm的聚四氟乙烯（PTFE）微孔疏水平板膜组件，可使原料液的浓度提高1.6倍以上。在浓缩发酵液的同时，超滤还可以去除一些小分子杂蛋白，有利于后期的纯化Bracke[37]及Ellwood[38]采用MWCO（截断相对分子质量）分别为10000、20000、30000的超滤膜渗滤去除发酵液中的小分子物质，效果显著；盛瑞堂等[35]采用超滤除去杂蛋白总量的53.9%。可见，在乙醇沉淀前采用膜技术进行浓缩有利于降低成本和后期纯化。.2膜技术分离膜技术不仅可以用于发酵液的浓缩，将其作为一种主体技术分离、提纯发酵液中的HA也有一定可行性。周海东等[39]采用PVDF材质的膜，对HA发酵液进行错流微滤和超滤，HA浓度在一定的范围内（微滤≤1.2g/L，超滤≤1.5g/L），膜工艺可稳定地运行。Zhou等[40]采用先微滤后超滤的两步切向流过滤工艺对发酵液中HA进行分离，共进行两次，第一次微滤和超滤以纯水作为过滤洗液，第二次微滤时以第一次超滤所得的透过液作为过滤洗液，两次高效的分步分离纯化可使HA得率超过77%。可见，以膜分离技术为主体，采用微滤和超滤相结合的工艺，能够实现HA发酵液的分离提纯。但是，在微滤过程中HA的透过率较低；在超滤过程中虽然蛋白质相对于HA的选择性较高，但蛋白质的透过率较低，因此，应针对溶液条件的变化进行研究，以提高HA在微滤膜中及蛋白质在超滤膜中的透过率。.3壳聚糖分离近年来，利用壳聚糖带相反电荷的吸附作用将HA分离下来的方法也见诸报道。德国专利[41]报道了将壳聚糖直接加入发酵液中以沉淀HA。Yang等[42]通过沉淀方法使壳聚糖与磁铁矿微粒共轭形成复合物微粒（壳-磁微粒），探讨了该复合物微粒通过电荷吸附作用从发酵液中分离HA的效果，发现通过调节pH值在6～8之间，HA在发酵液中并不能直接被分离下来。经乙醇沉淀分离后的HA粗品，在pH值为6的条件下溶解，用壳-磁微粒进行吸附；在pH值为8的条件下进行洗提，只有30%HA被壳-磁微粒吸附结合，又只有大约30%壳-磁微粒结合的HA被洗提下来；通过降低pH值至4.0来增加壳-磁复合物正电荷密度后，吸附作用显著提高，但又会出现壳聚糖与磁微粒易分散等问题。因此，这种分离与纯化方法在实际生产中的可行性尚有待进一步研究。纯化工艺.1季铵盐纯化氯化十六烷基吡啶（CPC）是一种季铵盐类阳离子表面活性剂，它能与黏多糖分子中的聚阴离子形成络合物，此络合物在低浓度盐溶液中产生沉淀，而在高浓度的盐溶液中逐渐解离，引起HA与CPC复合物解离所需的盐浓度远比其它黏多糖与CPC复合物解离所需浓度要低，利用此性质可达到纯化HA的目的。Cifonelli等[43]早在1957年就对发酵液经浓缩后再用CPC纯化进行了研究。洪水声等[44]向HA粗品溶液中加入等体积的质量分数为4%的CPC溶液，形成絮状物后静置1h，再离心分离，沉淀溶于1.5mol/L的NaCl溶液中，离心除去不溶物。祝庆[45]将乙醇沉淀得到的HA粗品溶于0.05mol/L的NaCl溶液中，加入1%CPC，搅拌30min后静置1h，离心收集沉淀后溶于不同浓度NaCl溶液中，发现NaCl溶液浓度为0.35mol/L时HA纯度和产量较高。丁霞[46]将HA粗品溶于0.15mo1/LNaCl中得到0.25%的HA溶液，1倍体积10%CPC(溶在0.15mo1/LNaCl中)加入8倍体积的0.25%的HA溶液中，通过离心分离CPC沉淀，用0.15mol/LNaCl洗涤，得到较纯的HA溶液。采用CPC进行纯化的优点是操作简单，但CPC回收困难，单位价格较高，所以应用成本较高。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）纯化HA的作用机制与CPC相似，但成本相对较低。丁霞等[47]将初步除去菌体和不溶性杂质的提取液中加入CTAB，通过离心分离沉淀，并用0.15mol/LNaCl洗涤沉淀，浸泡在1.5mol/LNaCl溶液中过夜，CTAB-HA复合物可解离溶解，最终可得清亮、较纯的HA液体。盛瑞堂等[35]报道了用CTAB沉淀法从发酵液中分离HA的方法，将发酵液稀释至4.5倍，调节pH值至6.5，加入发酵液体积12%的CTAB溶液（体积分数为10%），HA的收率可高达97.0%，与乙醇法相比，CTAB法HA的收率提高了2.1%，HA沉淀中杂蛋白的质量分数降低了2.4%，与CPC法相比成本降低了45.2%。可见，采用CTAB法对HA进行分离纯化具有明显优势和很好的应用前景。.2酶解纯化加入蛋白酶能够使HA与蛋白质的络合状态解除，HA更多地游离于溶液中，使其易于纯化。常用的蛋白酶有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，链酶蛋白酶等，链酶蛋白酶对接近糖蛋白质链肽键上的作用效果优于木瓜蛋白酶，而胃蛋白酶的水解作用不够彻底，往往需要配以其它酶才能见效。祝庆等[31]将除菌体后的上清液加入链酶蛋白酶作用2h，乙醇沉淀后再经氯仿除蛋白，HA产量得到了较大幅度的提高，杂蛋白的含量为2.8%，与采用氯仿三次除蛋白后的纯度相当。.3过滤法纯化过滤法纯化易于实现工业化，能有效滤除菌体和蛋白质，对分子量影响相对要小。盛瑞堂等[35]报道了采用过滤法纯化HA的工艺：将HA粗品以20g/L的浓度溶于水中，加入硅藻土作为吸附剂，调节溶液pH值至4.6～4.8，在HA粗品溶液中加入10g/L粗硅藻土和3.3g/L细硅藻土为助滤剂，用粗硅藻土和细硅藻土预涂层过滤，然后用H乙-1型滤板过滤，经过超滤后，将滤液用乙醇沉淀并干燥，得到葡糖醛酸含量达44.2%的HA。邓禹等[32]将发酵液经过前处理后，以发酵液质量1.2%的混合硅藻土（粗细硅藻土比为1.5∶1）作为过滤助剂，过滤温度为60℃，pH值为7.0，再配以酒精沉淀、气浮、酒精造粒的后处理工艺，得到的成品透明质酸中葡萄糖醛酸含量达46.39%，蛋白质含量仅为0.047%，相对分子质量为1.9×106Da。.4离子交换层析纯化在进入HA纯化阶段后，离子交换层析等具有选择性吸附特点的层析技术往往被采用。与化学方法相比，离子交换层析分离条件温和，不引起分子结构的变化，己经成为分离提取生物大分子的有效方法。离子交换法用于纯化HA的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件[46]。Poli等[47]将粗滤后的滤液先后流经阳离子交换树脂和AmberliteIRA900强碱型阴离子交换树脂，杂质吸附在树脂上，HA不被吸附而流出，流出液直接冷冻干燥或减压干燥可得纯度在98%以上的HA，其蛋白质含量为0.3%。Gerard等[48]曾报道了采用DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖分离HA的研究，但由于这两种层析剂价格昂贵，限制了在工业上的应用。选择经组氨酸修饰的强碱型阴离子树脂作为离子交换剂，以增大HA及其所含蛋白质、核酸等各组分与交换剂相互作用的差异，选择氯化钠为洗脱剂，对HA粗品进行离子交换层析，纯化质量收率为58%～61%，相对分子质量近1.0×106Da，蛋白质含量为0.075%。.5凝胶过滤柱层析纯化凝胶过滤层析常在纯化阶段的后期被采用，需要根据不同分离纯化目的和HA分子量大小选择合适的分子筛。采用SephadexG-25凝胶过滤柱层析分离HA溶液中残留的CPC及其它杂质。将发酵液经过氯仿与正丁醇混合液除蛋白、季铵盐（CPC）复合物沉淀、DEAE-纤维素柱层析后制得的样品，配成质量分数为0.5%的溶液，采用SephadexG-75凝胶过滤柱进行层析纯化，进样量为2.0mL，用蒸馏水进行洗脱，洗脱速度为6mL/h，收集洗脱峰并冷冻干燥，HA总收率为59.65%，蛋白质含量为0.075%。4透明质酸的改性尽管HA有诸多优点，但天然HA存在半衰期较短，在组织中易扩散和降解，稳定性较差，水溶性过强等缺点，限制了其应用领域，由此激发了国内外科学家对HA进行结构修饰和改性的兴趣，并对HA衍生物进行了大量研究。如图1-2所示，HA分子中可作为化学修饰位点的4个部位分别为羧基、羟基、N-乙酰氨基和还原末端，其中以羧基和羟基的修饰较常见，利用HA的修饰位点可通过以下三种方法对它进行改性从而改善其性能：(1)通过酯化反应、酰胺化反应和还原胺化反应等方法对HA进行交联、疏水、接枝和开环等化学改性，得到具有一定功能性的透明质酸衍生物，如透明质酸基凝胶；(2)利用HA的聚阴离子电解质性质，与阳离子化合物通过静电作用等形成复合物；(3)将HA与其它天然大分子或合成大分子共混改性，通过分子内和分子间氢键作用形成性能优良的共混膜等。透明质酸改性示意图[49]4.1酯化改性羧基和功能羟基是HA两个最常用的修饰部位，可与环氧化合物、醇、酸和酸酐类物质反应生成HA酯化衍生物。通过酯化改性，HA的理化性质和生物学性能得到一定程度改变，从而扩大了HA应用领域。羧基是HA的一个最重要修饰点，一定条件下，HA的羧基可与多种醇类发生酯化反应得到HA酯化衍生物HYAFF®，较典型的是HA乙基酯HYAFF®7和HA苄基酯HYAFF®11[50]。HYAFF具有良好的机械性能、热性能、渗透性、疏水性和稳定性等，在临床医学领域有广泛应用。Kong等[10-11]则在室温下以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为催化剂，通过HA羧基与单硬脂酸甘油酯(GMS)羟基之间的酯化反应合成了双亲性HA-GMS衍生物，探讨了HA/GMS摩尔比、pH和反应时间对取代度(DS)的影响，并得出在pH=7.4，HA/GMS=1/3及反应时间48h下可以得到较高取代度(DS=23%)的HA/GMS，并以此HA/GMS水溶液为水相，二氯甲烷为油相，Tween-80和Span-20(S)为非离子表面活性剂制备了O/W/S纳米微乳液，提供了可用于食品、医药和化妆品等领域的纳米HA载体。Prata等[51]用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GM)对HA改性，得到可光交联的酯化产物HAGM，并通过三种不同方法控制HAGM的微结构和分子间作用力制备了轻度交联的HAGM类凝胶、HAGM微球和HAGM微凝胶，前两者水溶液具有高粘弹性，而HAGM微凝胶则具有较好的弹性，类似于假塑性流体。HA侧链上的功能羟基是其另一个重要修饰点，Burdick等[52]用将甲基丙烯酸酐对HA改性同样得到可光交联酯化产物MeHA，在光引发剂及紫外光照下，MeHA通过自由基聚合形成网状凝胶，该凝胶具有良好的机械性能和低降解性，是理想的软骨组织载体。Eenschooten等[53]在NaHCO3缓冲液(pH=8~9)中用辛烯基琥珀酸酐(OSA)对HA酯化改性得到双亲性OSA-HA衍生物，并研究得出OSA/HA摩尔比和NaHCO3缓冲液浓度是影响OSA取代度的两个重要反应参数。Tømmeraas等[54]用类似方法通过烷烯基或芳香基琥珀酸酐(ASA)改性HA得到双亲性ASA-HA衍生物，并则初步探讨了其乳化性能，结果表明ASA的引入降低了HA的表面张力，使HA乳化性得到改善。4.2酰胺化改性HA的羧基活性较高，且通常是HA受体或透明质酸酶的识别点，因而对HA羧基的修饰较为常见，不仅可以发生酯化反应，还能与多种胺类物质发生酰胺化反应，得到HA酰胺化衍生物。Lee等[55]采用两步法制备了HA酰胺化衍生物HA-SH，第一步在pH=6.8条件下，以EDC和N-羟基苯并三唑(HOBt)为催化剂，制备了HA与胱胺盐酸盐的酰胺化产物，将二硫键S-S引入到HA主链上；第二步在pH=8.5条件下用二硫苏糖醇(DTT)还原S-S键得到硫醇SH，成功制备了HA-SH。然后将金(Au)纳米粒子溶液逐滴加入到HA-SH水溶液中，通过SH-Au之间的相互作用自组装得到HA/Au纳米粒子，TEM显示Au纳米粒子在HA-SH模板上呈一维排列，使HA链段结构直观可视化。Kim等[56]通过酰胺化反应将量子点(QDots)与HA结合获得了用于实时生物成像的HA-QDot，可作为治疗肝疾病的特定药物负载体。HA-QDot具体合成步骤为：第一步通过酰胺化反应制备了己二酸二酰肼(ADH)改性HA的产物HA-ADH(ADH含量为22%)，第二步在QDots的硼酸盐缓冲液中加入催化剂EDC和硫代-NHS，反应30min活化QDots表面的羧基，最后将HA-ADH的磷酸盐缓冲液滴入到已活化的QDots溶液中反应2h得到HA的衍生物HA-QDot。4.3交联改性HA的交联改性是指HA与带有相关官能团的交联剂发生分子间交联反应，或以交联剂为催化剂，发生分子内交联反应，得到具有不同交联度的分子网状结构，如水凝胶、交联膜和凝胶粒子等，从而大大改善HA的水溶性、粘弹性、流变性、机械强度和降解性能等，满足HA在临床、医药等领域的特殊要求。常见的交联改性方法有碳二亚胺交联、酰肼交联、二硫化物交联、聚乙二醇交联、环氧化物交联、醛交联和砜交联等。已二酸二酰肼(ADH)是较常用的酰肼交联剂，聂素云等[57]用溶剂挥发法制备了HA-ADH凝胶薄膜，结果表明HA用ADH交联后微观结构发生改变，溶解性降低，干态时HA-ADH薄膜结构较密致，可在水中发生明显的溶胀现象，溶胀后形成多孔网状结构。Pitarresi等[58]以EDC和硫代-NHS为催化剂，采用反相微乳液法使HA和α,β-聚天冬酰肼(PAHy)在pH=7.5的水相液滴中交联反应5h得到球形复合纳米粒子HA-PAHy。该纳米粒子在水介质中具有高溶胀率和较好的稳定性，同时在模拟细胞外液体及人的血浆生理环境中具有较好的药物释放能力，是有效的药物载体。二乙烯基砜(DVS)在室温下可与HA快速交联反应，因而也是一种较常用的交联剂。Jha等[59]首先用DVS对HA进行分子内交联得到HA弹性凝胶颗粒(HGPs)，HGPs经高碘酸钠氧化后与HA-ADH衍生物进行分子间交联反应得到双层交联网络凝胶(DXNs)，由于二次网络结构的存在，提高了该透明质酸凝胶的机械性能，适用于软组织修复工程。聚乙二醇(PEG)为分子大小可变的线性分子，具有良好的生物相容性，免疫学惰性，水溶性和两亲性，因而用PEG对HA进行交联改性引起国内外学者的广泛兴趣。陈景华等[60]用琥珀酸酐和NHS活化PEG末端羟基后与乙酰化处理后的HA发生交联反应，制得HA-PEG衍生物，结果表明该衍生物溶液属于标准的假塑性非牛顿流体，其流变性能符合生物医用材料要求。Wells等[61]在4℃下以EDC/NHS为催化剂将氨基封端的PEG-蒽接枝到HA主链上，得到具有优异生物相容性的光敏性HA-PEG衍生物。由于蒽基团的光二聚性质，当紫外波长大于300nm时，可得到光交联HA凝胶，而当紫外波长小于300nm时HA凝胶解交联(如下图所示)，因此该凝胶可用于眼科药物的运输，通过改变药物分子量和紫外曝光可达到药物长期缓释作用。HA凝胶的交联和解交联示意图4.4疏水改性透明质酸亲水性过强，通常以钠盐形式存在，难溶于绝大多数有机溶剂，这就限制了许多疏水性物质(药物或脂质)对其进行改性或结合，因而国内外开展了许多研究工作解决这一问题。较成熟的方法是制备透明质酸的四丁基铵盐(HA-TBA)使HA能溶于有机溶剂，以实现与疏水性物质的反应。Jin等[62]制备了疏水性HA-TBA，以四氢呋喃和乙腈为混合溶剂，通过酯化反应将改性后的神经酰胺(DS-Y30)接枝到HA-TBA上，得到双亲性衍生物HACE。HACE能与疏水性药物阿霉素(DOX)在二甲亚砜(DMSO)和水的混合溶剂中进行自组装，得到负载DOX的HACE纳米粒子，此纳米粒子可以作为黑霉瘤治疗的有效抗癌载体。Pravata等[63]通过一步法用十六烷基溴化铵(CTA-Br)改性Na-HA得到比HA-TBA疏水性更强的HA–CTA，并以DMSO为溶剂将酰氯基封端的低分子量聚乳酸(COL-OLA)接枝到HA-CTA上得到可降解的梳状衍生物CTA-HAOLA，此HA衍生物能在水溶液中自组装形成Na-HAOLA球形聚集体或CTA-Na-HAOLA水凝胶。Bergma等[64]以2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-嗪(CDMT)为催化剂，水和乙腈的混合溶液为溶剂，在中性条件下通过酰胺化反应将一系列亲疏水性不一的胺类物质接枝到HA主链上。这种嗪活化的酰胺化反应条件温和，胺类物质选择余地大，提供了一种新的制备功能性透明质酸衍生物的简便方法。Li等[65]以低分子量HA(5800Da)为原料，首先在甲酰胺溶剂中以嘧啶为催化剂得到乙酸酐改性的Ac-HA，接着在DMSO中以二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂将疏水性光敏单体脱镁叶绿酸(Pba)接枝到HA上得到酯化产物Ac-HA-Pba，该Ac–HA-Pba能在水溶液中自组装形成具有生物相容性和光猝灭性的单分散性纳米凝胶粒子，在光动力治疗领域具有潜在应用价值。Lee等[66]采用聚乙二醇(PEG)纳米复合技术，制备了能溶于DMSO中的纳米级HA/聚乙二醇二甲醚(HA/dmPEG)复合物，成功地把抗肿瘤药物紫杉醇(Paclitaxel)接枝到透明质酸上得到HA-Paclitaxel衍生物，并能在水溶液中自组装形成球状胶束(见下图)，该胶束具有显著的细胞毒性，有望成为治疗肿瘤的靶向特效药物。HA-紫杉醇胶束的形成过程4.5接枝改性Palumbo等[67]以DMSO为溶剂，通过HA-TBA与NHS活化的聚乳酸(PLA-NHS)之间的酯化反应得到接枝共聚物HA-PLA，结果表明疏水性PLA的取代度会影响HA-PLA在水溶液中的流变行为：低取代度的HA-PLA水溶液粘度较HA溶液高，形成更为密实的无规线团；而高取代度的HA-PLA亲水性降低，以类凝胶状态分散于水溶液中，并能溶于DMSO。此外，HA-PLA水溶液粘度均较高且具有剪切变稀行为，在生物医药、组织工程和药物负载等领域具有潜在应用价值。Wang等[68]首先将丙烯酰氯小分子接枝到TBAHA主链上得到含双键的TBAHA-acrylate，然后通过聚(L-亮氨酸)(PLeu-NH2)与TBAHA-acrylate之间的Michael加成反应合成了HA-g-PLe接枝共聚物，并研究了HA-g-PLe的构象、自组装行为及PLeu在接枝共聚物中的二级结构。结果表明接枝共聚物中PLeu链段间存在很强的分子内及分子间疏水作用，使PLeu与部分未接枝的HA链可形成分子间聚集体，因而HA-g-PLe可以在水溶液中形成凝胶状态，在注射增稠剂及组织工程领域有潜在应用价值。4.6还原末端改性透明质酸末端修饰较为少见，Tanaka等[69]以氰基硼氢化钠为催化剂，在水溶液中通过氨基硫脲(TSC)和HA还原末端的还原胺化反应制备了HA的衍生物HA-TSC，通过S-Au之间的相互作用将HA-TSC自组装固定于镀金玻璃板表面(如下图所示)，这种HA修饰的具有生物相容性的表面有望作为细胞培养应用的生物支架材料。HA-TSC的合成及HA固定层的制备示意图5透明质酸的应用5.1在化妆品中的应用透明质酸是构成细胞外基质和细胞间质的主要成分之一，是细胞间的填充物，对于皮肤的形态、结构、功能起着重要的作用。由于透明质酸具有保湿、修护、营养等作用，对皮肤有良好的亲合性且使用安全，其在美容化妆品中的应用越来越广泛。与其他常用保湿剂甘油、山梨醇、吡咯烷酮羧酸钠等相比，透明质酸受环境湿度影响较小。实验表明，透明质酸在低相对湿度（33%）下的吸湿量相对最高，而在高相对湿度（75%）下吸湿量相对最低。这种独特的性质，正适应皮肤在不同季节、不同湿度环境下的要求，因此被称为理想的智能保湿剂，广泛应用于保湿抗皱护肤品中。5.2在临床医学中的应用透明质酸是广泛分布在软结缔组织细胞外基质中的主要蛋自多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性，在临床医学中具有广泛的应用。在医药领域，透明质酸及其衍生物作为优良的药物载体，能够达到药物增稠、药物缓释、促进药物透皮能力及靶向性的目的透明质酸作为眼用制剂的媒介，能够明显提高药物生物利用度，且具有保湿润滑、抗炎和促修复作用:作为药物缓释载体，能够延缓药物释放速度，且对一些生物大分子药物还具有生物茹附作用作为抗肿瘤药物的靶向载体，能够增加抗肿瘤药在肿瘤和淋巴结中的吸收和滞留时间，提高药物的疗效。5.3在保健食品中的应用食用透明质酸美容保健食品，增加由真皮至表皮内源透明质酸的含量，使细胞活化，可发挥由内而外的全身美容作用。口服透明质酸保健食品可增加皮肤保水性，不但可以使皮肤富有弹性，减少皱纹，且在关节腔、血管、眼、脑等组织中起润滑保水的重要生理功能。国内外已有越来越多的透明质酸美容保健食品上市。透明质酸美容食品在日本最先开发和流行。日本透明质酸开发研究所生产的HyaronECM•E（细胞外基质提取物），多数试用者皮肤变得光滑、润泽，脸部、手脚以及全身均有美容效果。美国透明质酸保健食品近几年有十几个品牌上市，如NaturalMax公司生产的BeautyFast胶囊，SourceNaturals公司生产的含HyaluronicAcid胶丸和片剂等。我国台湾和大陆也陆续有产品上市，已上市的口服美容胶原透明质酸、瑞尔水缘胶囊中都含有透明质酸。6透明质酸的国内外生产研究现状及常见产品6.1透明质酸的国内外生产研究现状发酵法生产透明质酸成本低、提取工艺简单，已形成规模化生产，有很广阔的市场前景。国际市场上化妆品级的HA为1000～2000$/kg，而药用的HA为6000～20000$/kg。1985年HA在国际市场的总销售额为1亿美元，1990年上升为2亿多美元，1995年国际市场HA的总销售额就已达6亿美元，统计资料显示，2004年全球透明质酸应用的相关市场规模大约为30亿美元，药物化妆护肤产品添加物和医疗类产品市场各占一半。欧洲、美国和日本是生产和使用透明质酸产品的最大市场，预计未来每年将以15%的比例持续增长。目前，国内透明质酸年需求量在5吨左右。国外自20世纪80年代实现了发酵法生产透明质酸，生产的厂家由原来的十余家增加到上百家，而且规模也越来越大。反观我国，透明质酸的生产水平和生产效率都较低，通过微生物发酵法生产HA的厂家较少，这严重制约了我国透明质酸发展和应用。目前，我国透明质酸生产发展存在的主要瓶颈和需要解决的问题主要有以下几个方面:(1)菌种产量低:我国有文献报道，在实验室水平上产量能达到6～8g/L左右，但是应用到产业以后，受原料和发酵条件等影响，产量可能会低很多，距离国际上的工厂发酵水平8～10g/L以上还有很大的差距。因此采用传统的诱变育种或基因工程手段获得高产的菌种是一个重要的应用研究方向。(2)分子小且不均一:影响透明质酸分子大小因素有很多，据文献报道，在发酵过程中，溶氧、pH、温度都可以影响分子的大小。(3)发酵工艺不成熟:动力学是应用现代发酵技术的基础，对其进行研究，可以了解发酵过程的规律，从而对生产过程进行优化和控制，以获得高底物转化率和高生产强度。(4)发酵机理不清楚:据现有的文献报道，仅有很少的底物可以转化为透明质酸，尽管透明质酸的合成途径的研究已进行到分子水平，但还没有一套可行且能有效的大幅提高透明质酸产量的理论。目前，几个具有代表性的透明质酸生产企业如下：1）瑞典Q-麦德公司(Q-Med)：一家以开发、生产、销售产品为主，主要致力于透明质酸的商业化研究、生产和销售。其于1995年底完成稳定透明质酸的开发并申请了专利，这项专利贯穿了整个公司的产品开发。1996年底，该公司的第一个产品Restylane（中文名：瑞蓝）获欧洲CE认证通过上市。瑞蓝（Restylane）是中国国家食品药品监督管理局2005年以来唯一批准的进口面部注射填充剂。2003年美国药品监督管理局首次批准的唯一的透明质酸玻尿酸类面部注射填充剂。2）韩国LG：LG生命科学是拥有世界顶级技术与产品的研发制药企业。韩国LG生命科学自主研发的透明质酸应用于医药领域20多年。2010年开始，LG生命科学新增了透明质酸钠医学美容YVOIRE®伊婉™系列产品，即医学美容注射产品YVOIRE®伊婉™，在韩国拥有6个型号，获得了欧洲CE认证。YVOIRE®伊婉™使用的透明质酸钠原料通过了美国FDA和欧洲EDQM认证，YVOIRE®伊婉™系列产品现为韩国销量第一的透明质酸钠美容填充产品。3）华熙福瑞达生物医药有限公司：是目前国内唯一具有发酵法生产透明质酸药用辅料及原料药批准文号并通过GMP认证的生产企业。1990年研制成功的发酵法和2011年研制成功地酶切法是透明质酸生产的两大革命性突破，填补了国内外空白。凭借多年对透明质酸原料的研发、生产、市场功底，历经长达7年的终端产品的开发，2012年率先在国内研发成功透明质酸美容整形填充剂，品质达到世界领先水平。主要产品为润百颜。6.2常见产品1）口服透明质酸口服透明质酸保健食品主要有片剂，胶囊剂，口服液，代表性产品有：日本透明质酸研究所研制的匕7口ECM·E105，日本荣进商事生产的润丽Ex，吉林宏久生物科技公司的瑞尔水缘胶囊，Nature’sway公司的Hydraplenish，Syno—Vital公司的PureHyaluronicAcid，北京神源生物养生口服液。2）化妆品产品目前市场上有大量的含有透明质酸的护肤品，产品的好坏参差不齐，列举其中几个：曼秀雷敦旗下肌研系列，太阳芦荟社玻尿酸原液，

意大利DIBI狄比复方透明质酸精华/补水原液，L'AURENE/露芸妮微分子透明质酸原液3）医疗产品医用的透明质酸主要是凝胶类产品，代表产品有：RICERFARMASRL公司的牙周用透明质酸凝胶，，山东博士伦福瑞达制药有限公司的施沛克（医用玻璃酸钠凝胶），“纽奥天露”医用透明质酸钠凝胶-眼科粘弹性保护剂，上海其胜牌医用透明质酸钠凝胶。7我的设计方案目前,HA主要从3个方面获取:人脐带、鸡冠和溶血性的A、C族链球菌培养物。前面两种来源主要有产量低,生物污染和HA的纯化要花费大量的人力物力等缺点;同时由于种间病毒传递危险及其它外来的感染,使得来源于动物组织的生化产品遭到日益强烈的反对。细菌来源的HA具有技术、经济及伦理上的优势。因此微生物合成法生产透明质酸逐步取代动物组织提取法,成为透明质酸来源的首选方法。产HA的菌种主要是A组和C组链球菌,A组中主要有化脓链球菌(S.pyogenes),其治病性强较少作为生产菌种;C组中主要有马疫链球菌(S.equi)、兽疫链球菌(S.zooepidemicus)、类马链球菌(S.equisimilis)等,C组链球菌属于非人体致病菌,适合于大规模发酵生产。因此本方案选择C组菌中的兽疫链球菌发酵生产透明质酸。链球菌属于兼性厌氧菌，研究发现,链球菌在有氧发酵条件下生产HA的产量比无氧发酵条件下高。在发酵模式上,分批发酵在链球菌发酵生产HA中仍然占支配地位。连续发酵尽管有利于延长培养时间,减少蛋白质的污染,但由于高度囊膜包裹的链球菌在连续培养中HA生产的不稳定性,使得HA在恒化器中生产不容易得到。HA的发酵培养基具有非牛顿流变学特性,改变搅拌速率和通气率是调节溶氧的两种主要方式。本方案选择的通气量0.8VVm，搅拌速率为150r/min，随着发酵时间的延长，溶氧浓度的降低可以适当提高搅拌速率，链球菌对于培养基的要求极其苛刻,由于没有TCA循环,缺乏必须的合成大部分氨基酸和核苷的前体,因而其培养基必须富含嘌呤、维生素和超过10种以上的氨基酸。典型的生长培养基是多采用葡萄糖作为碳源,并在培养基中补充小牛血或血清。下面附上一个用兽疫链球菌发酵生产透明质酸的流程图:参考文献：[1]王娟勤.透明质酸的改性及功能化D.江南大学,2013.［2］SaariH.Differentialeffectsofreactiveoxygenspe-ciesonnativsynovialfluidandpurifiedhumanum-bilicalcordhyaluronate［J］.Inflammation，1993，17（4）：403-415.［3］JeonO.Mechanicalpropertiesanddegradationbe-haviorsofhyaluroniacidhydrogelscross-linkedatvariouscross-linkingdenseties［J］.CarbohydratePoly-mers，2007，10：1-7.[4]FouissacE,MilasM,RinaudoM.AMacromolecules,1993,26:6945~6951.[5]洪水声,陈佳,滕利荣,等.高等学校化学学报,2004,25(5):853~857.[6]于雷，2003；M.S.Gastonetal.，2007；IlkkaT.Harvinaetal.，2006；VasfiKaratosunetal.2006.[7]ValarieL,BruceA.JBiolchem,1999,274:4239~4245.]。因此,近年有学者尝试在体外以酶法合成HA,并取得一些进展。小林四郎等[小林四郎.触媒,2004,46(5):344~350.[8]凌敏,黄日波,黄鲲,等.工业微生物,2003,33(2):4~8.[9]梁天佐.微生物发酵法产透明质酸工艺研究［M］.河北农业大学，2010：16-18.；[10]郭学平，王春喜，崔大鹏.发酵法制备透明质酸［J］.日用化学工业，1994（2）：47-48.[11]郭学平，王春喜，凌沛学，等.透明质酸及其发酵生产概述［J］.中国生化药物杂志，1998，19（4）：209.[12]RaoYM，SureshkumarGK.Improvemeninbio-reactorproductivitiesusinfreeradicals：HOCI-in-ducedoverproductionofxanthangumfromXan-thomomascampestrisanditsmechanism［J］.Bio-technolBioeng，2001，72（1）：62-68.[13]邓开野,于雷,任露泉,等.吉林大学学报,2005,35(2):210~213.[14]冯建成,崔贞华,尹姣,等.湖北大学学报,2005,27(1):57~60.[15]孙建,霍向东,张志东.新疆农业科学,2006,43(1):72~74.[16]张淑荣,许伟坚,张鹏,等.北京化工大学学报,1999,26(1):1~4.[17]罗强,孙启玲.四川大学学报,2003,40(5):949~952.[18]郝宁,张晋宇,陈国强.中国生物工程杂志,2005,25(6):56~60.[19]姚敏杰,安海平,陈玉铭.江苏食品与发酵,1995,2:19~25.[20]高海军,陈坚,管轶众,等.无锡轻工业大学学报,1999,18(3):17~22.[21]高海军,陈坚,章燕芳,等.生物工程学报,2000,16(3):396~399.[22]安海平,姚敏杰,陈玉铭,等.江苏食品与分酵,1995,(1):1~4.[23]OgrodowskiCS,HokkaCO,SantanaMH.AppBiochemBiotechno-logy,2005,121:753~761.[24]StangohlS.USPatent:6537795,2003.[25]孟庆繁,滕利荣,洪水声,等.吉林大学学报,2004,42(1):121~125.[26]史鹏，蔡海波，杨利，等.发酵液预处理方法对透明质酸分子量降低的影响[J].中国医药工业杂志，2005，36（12）：741-743.[27]郭育涛，陈坚，高海军，等.发酵液中透明质酸提取的新方法[J].无锡轻工大学学报，2000，19(5)：437-439.[28]王大为，张艳荣，沙坤.中国林蛙皮多糖类天然保湿因子的提取与鉴定[J].吉林农业大学学报，2002，24(6)：99-102.[29]郭学平，凌沛学，王春喜，等.透明质酸的生产[J]，药物生物技术，2000，7(1)：61-64.[30]NimrodA，GreenmanB，KannerD.Highmolecularweightsodiumhyaluronate：US，4784990[P/OL].1985-01-18[1988-11-15].[31]祝庆.兽疫链球菌NW-162型菌株透明质酸发酵及提取工艺研究[D].西安：西北大学化工系，2001.[32]邓禹，堵国成，李秀芬，等.基于发酵液特性的透明质酸提取预处理工艺[J].过程工程学报，2007，7(2)：380-384.[33]周荣清，郭祀远，李琳.透明质酸发酵液的絮凝预处理研究[J].食品与发酵工业，2001，27(12)：16-19.[34]FlaviaC，MichaelO，VincenzaC.Processforthepreparationandpurificationofhighmolecularweighthyaluronicacid：WO，9504132[P/OL].1994-07-29[1995-02-09].[35]盛瑞堂，孙猛，谭天伟.过滤法分离纯化透明质酸[J].过程工程学报，2006，6（2）：285-288.[36]孙宏伟，任佚凯，李家玲.气隙式膜蒸馏法分离浓缩透明质酸水溶液的研究[J].北京化工大学学报，1999，26（2）：1-3.[37]BrackeJW，ThackerK.Hyaluronicacidfrombacterialculture：US，4517295[P/OL].1983-02-18[1985-05-14].[38]EllwoodDC，EvansCG，DunnGM，etal.Productionofhyaluronicacid：US，5563051[P/OL].1995-01-24[1996-10-08].[39]周海东，倪晋仁，黄文，等.膜技术分离透明质酸发酵液可行性研究[J].食品与发酵工业，2005，31（11）：46-51.[40]ZhouHD，NiJRHuangW，etal.Separationofhyaluronicacidfromfermentationbrothbytangentialflowmicrofiltrationandultrafiltration[J].SeparationandPurificationTechnology，2006，52（1）：29-38.[41]LothFrith.DiefolgendenAngabensinddenvomAnmeldereingereichtenUnterlagenentnommen：Germany，DE19712931AI[P].1998-10-01.[42]YangPF，LeeCK.HAinteractionwithchitosan-conjugatedmagnetiteparticlesanditspurification[J].BiochemicalEngineeringJounral，2007，33：284-289.[43]MoreauC，DurandR.Dehydrationoffructoseto5-hydroxymethylfurfuraloverH-mordenites[J].AppliedCatalysisA：General，1996，145(1-2)：211-224.[44]MoreauC，DurandR.HydrolysisofsucroseinthepresenceofH-formzeolites[J].IndustrialCropsandProducts，2000，11(2-3)：237-242.[45]ReijendamJW，HeeresGJ，JanssenMJ.Polyenyl-substitutedfuransandthiophenes，Astudyoftheelectronicspectra（Ⅰ)[J].Tetrahedron，1970，26(6)：1291-1302.[46]ReijendamJW，HeeresGJ，JanssenMJ.Polyenyl-substitutedfuransandthiophenes，Astudyoftheelectronicspectra(Ⅱ)[J].Tetrahedron，1970，26(6)：1303-1310.[47]MorikawaS.Synthesisofhydroxymethylfurfuraland2,5-furandicarboxaldehyde[J].NoguchiKenkyushoJiho，1978，21：25-33.[37]MorikawaS，TeratakeS.2,5-Furandicarboxaldehyde：JP，54009260[P].1979-01-24.[48]MorikawaS.Synthesisof2,5-furandicarboxaldehydefrom5-hydroxymethylfurfural[J].NoguchiKenkyushoJiho，1979，22：20-27.[49]徐晶，艾玲，白绘宇等.透明质酸改性研究进展[J].高分子通报，2011(2):78-84.[50]CampocciaD，DohertyP，RadiceM，etal.Semisyntheticresorbablematerialsfromhyaluronanesterification[J].Biomaterials，1998，19(23):2101-2127[51]PrataJE，BarthTA，BencherifSA，etal.ComplexfluidsbasedonmethacrylatedhyaluronicAcid[J].Biomacromolecules，2010，11(3):769-775[52]BurdickJA，ChungC，JiaX，etal.Controlleddegradationandmechanicalbehaviorofphotopolymerizedhyaluronicacidnetworks[J].Biomacromolecules，2004，6(1):386-391[53]EenschootenC，GuillaumieF，KontogeorgisGM，etal.Preparationandstructuralcharacterisationofnovelandversatileamphiphilic