食品微生物检验复习整理

食品微生物检验复习整理第一章绪论第一节食品微生物检验的意义1、食品微生物检验定义：应用微生物学的理论与方法，研究外界环境和食品中微生物的种类、数量、性质、活动规律及其对人和动物健康的影响。2、食品微生物检验的特点（1）研究对象及范围广（2）涉及学科多样（3）实用性及应用性强（4）采用标准化3、食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分（原因）——它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。——通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生情况，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物的食物中毒的防治措施。——食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒和人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重大意义。4、食品微生物检验的目的：为生产出安全、卫生、符合标准的食品提供科学依据。食品微生物检验的内容和范围内容——食品加工过程：食品生产环境；原料、加工过程；成品运输；保存——微生物的对象：各种指标菌的生物学特性、各种指标菌常规检验方法——食品的对象：每种食品的常见微生物；样品的采集、处理、检验的方法和程序；有关材料和用品2、范围：——生产环境的检验：车间用水空气地面墙壁——原辅料检验：食用动物、果蔬谷物添加剂——食品加工、储藏、销售诸环节的检验：食品从业人员的卫生状况、加工工具、运输车辆、包装材料——食品的检验：出厂食品、可疑食品、食物中毒食品的检验食品微生物检验的指标1、我国卫生部颁布的食品微生物指标有：菌落总数；大肠菌群；致病菌。··菌落总数（AerobicPlateCount）：是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。意义：是判断食品卫生质量的重要依据之一。（1）可以反应食品的新鲜度。（2）可以反应食品被细菌污染的程度。（3）生产过程中食品是否变质。（4）食品生产的一般卫生状况等。··大肠菌群（ColiformBacteria）：包括大肠杆菌和产气杆菌的一些中间类型的细菌。这些细菌是寄居于人及温血动物肠道内的常居菌，它随着大便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。意义：以大肠菌群作为粪便污染食品的卫生指标来评价食品的质量，具有广泛的意义。··致病菌：即能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应选择一定的参考菌群进行检验。··霉菌及其毒素有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。第四节食品微生物检验的发展（一）致病菌检测阶段微生物从不知到知的过程：酿酒、列文虎克、巴斯德、科赫1、酿酒2、列文虎克：自制显微镜，微生物世界3、巴斯德——彻底否定了自然发生说——证实发酵由微生物引起——免疫学—预防接种——发明巴氏消毒法（减毒疫苗、炭疽杆菌、狂犬病疫苗）4、科赫培养出炭疽杆菌、霍乱弧菌、结核杆菌等病原微生物第一次用科学的方法证明某种特定的微生物是某种特定疾病的病原。“科赫原则”：（1）为了证明某一种细菌是某一疾病的病因，必须在这种疾病的所有病例中都发现有这种细菌；（2）然后，必须将这种细菌从病体中完全分离出来，在体外培养成纯菌种；（3）这种纯菌种，经过接种后，必须能将疾病传给健康的动物；（4）按上面规定的方法接种过的动物身上，必须取得同样的细菌，然后，在动物体外，再次培养出这种纯菌种。（二）指示菌检测阶段1、指示菌又称指标菌，是常规安全卫生监测中，可以用以指示检品（检验样品）卫生状况及安全性的指示性微生物2、常规检验指示菌的目的：主要是以安全卫生指示菌在检品中存在与否以及数量多少为依据，对照国家卫生标准，对检品的饮用、食用或使用的安全性作出评价。3、指示菌可分为三种类型：——第一种类型的指示菌是为了评价被检样品的一般卫生质量、污染程度以及安全性，最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌数。——第二种类型是特指粪便污染指示菌，主要是大肠菌群，其他还有肠球菌、亚硫酸盐还原梭菌等。它们的检出标志着检品受过人、畜粪便的污染，而且有肠道病原微生物存在的可能性。——第三种类型是其他指示菌，包括某些特定环境中不能检出的菌类，如特定菌、某些致病菌或其他指示性微生物。这些指示菌在不同样品中有不同含义。（三）微生态制剂检测阶段1、与人体共生的厌氧菌是人体存在的主要微生物菌群之一。生态平衡时，与人体“和平共处”，成为人体抵抗疾病的第一道防线；生态失调时，成为人体感染的主要条件致病菌，形成厌氧菌感染症。微生态制剂：以调节生态平衡为目的，主要是乳酸菌、双歧杆菌，检测其主要菌株的特性和数量就成了20世纪末食品微生物检测的一项重要内容。（四）现代基因工程菌和尚未能培养菌的检测致病性大肠杆菌、双歧肠杆菌蛋白病毒和嗜抗生素菌、加工处理受损暂时不能繁殖的菌体、目前条件尚不能培养的微生物等，这方面对食品微生物检验技术提出了挑战现代食品微生物检测在快速酶促反应及代谢产物的检测、免疫学方法检测抗原或抗体技术、分子生物学技术检测食源性病原菌和微生物检测的自动化系统等方面得到了迅速发展，这也是食品微生物学检测的未来发展趋势。第二章检验技术基础知识第一节良好的实验室操作规范FDA：美国食品及药物管理局GLP：良好的实验室操作规范一、GLP的主要目的：是严格控制化学品安全性评价试验的各个环节，即严格控制可能影响实验结果准确性的各种主客观因素，降低试验误差，确保实验结果的真实性。二、GLP的内容目标和范围任务和职责人员项目计划，协议和程序，以及GLP研究的实施设备材料检测系统仪器培训，教育和经验文件和记录项目报告审核纠正措施/预防措施持续改进在资助和合同下进行的研究内容概要：实验设施、人员管理、标准操作（SOP）、监督体制第二节检验技术基本原则和要求一、基本原则1.质量原则该原则要求检测检验技术保证检测质量，方法成熟、稳定，具有较高的精密度、准确度和良好的选择性，从而确保实验数据和结论的科学性、可信性和重复性。2.安全原则该原则要求检测检验技术所使用的方法不应对操作人员造成危害及环境污染或形成安全隐患。3．快速原则4．可操作原则操作必须简单明确，具有基本专业基础的人员经过短期培训都可以理解和掌握。5．经济原则该原则要求食品安全快速检测方法所要求的条件易于达到，以便方法的推广普及。二、检测技术操作的一般要求1．检验方法中所采用的名词及单位制，均应该符合国家规定的标准要求。2．检验方法中所使用试剂均为分析纯，所使用水为纯度能满足分析要求的蒸馏水或软化水或其他相当纯度的水，除非特别声明。3．检验中所用计量器具必须按国家规定及规程计量和校正。4．称取量取精度要求用数值的有效数位表示。其中准确称取系指用精密天平进行的称量操作，其精度为土0.0001g；吸取系指用移液管、刻度吸量管取液体物质的操作。5．检验有关要求：(1)检验时必须做空白试验。(2)检验时必须做平行试验。6．检验方法的选择：同一检验项目，如有两个或两个以上检验方法时，可根据不同条件选择使用。但必须以国家标准(GB)方法的第一法为仲裁方法。7．采样必须注意样品的生产日期、批号、代表性和均匀性。采集的数量应能反映该食品的卫生质量和满足检验项目对样品量的需要。8．一般样品在检验结束后，应保留1个月，以备需要时复查。保留期限从检验报告单签发日起计算。易变质食品不宜保留。保留样应加封存放在适当地方，并尽可能保持其原装。三、微生物检验实验室（一）微生物检验室基本条件1、微生物检验室包括：实验室+无菌室（无菌室+缓冲间）2、总要求：对各室的共同要求是高度的清洁卫生，也就是要尽可能地创造无菌条件。3、基本条件：微生物检验实验室必须具备显微镜工作，微生物分离培养工作及基本化学工作顺利进行的基本条件。（二）微生物检验室实验守则在进行微生物检验时要时刻记住：我们实验的许多对象可能是病原微生物，如果不慎发生意外，不仅自身招致感染，而且可能造成病原微生物的传播。···检验实验室必须遵守以下守则：1、包、衣物等勿带入实验室，必须的文具、实验数据、笔记等带入后要远离操作部位。2、进入实验室应穿着工作服，进入无菌室应戴口罩、帽子，换用专用鞋。3、实验室内要保持安静、有秩序，不能高声谈笑，影响实验。实验室内禁止饮食、吸烟或用嘴湿润铅笔、标签、吸管等，也不要用手抚摸头部、面部等。4、样品检验前应登记日期、批号，详细记录样品检验序号，检验日期，检验程序和结果。5、室内应经常保持整洁，样品检验完毕后及时清理桌面。凡是要丢弃的培养物应经高压灭菌后处理，污染的玻璃仪器高压灭菌后再洗刷干净。6、无菌室应备有专用开瓶器、金属勺、镊子、剪刀、接种针、接种环，每次使用前和使用后应在酒精灯火焰上灼烧灭菌。7、无菌室内应备有盛放3％来苏水或5％石炭酸溶液的玻璃缸，内浸纱布数块；备有75％酒精棉球，用于样品表面消毒及意外污染消毒；无菌室每次使用前后，用紫外灯照射。8、吸过菌液的吸管，要投入盛3％来苏水或5％石炭酸溶液的玻璃筒中，不得放在桌子上；菌液流洒桌面，立即用抹布浸沾3％来苏水或5％石炭酸溶液泡在污染部位，经半小时后方可抹去。若手上沾有活菌，也应该在上诉消毒液中浸泡10～20min，再以肥皂及水洗刷。9、遇火险，应立即关闭电门、煤气门，如果酒精、乙醚、汽油等着火，切勿用水，应以沙土等灭火。10、离开实验室前一定要用肥皂将手洗净，脱去工作服、帽、专用鞋。关闭门窗以及水电煤气等开关，认为妥善后方可离开。···几种意外情况的处理：（1）皮肤破伤：先除尽异物，用蒸馏水和生理盐水洗净后，涂以2％碘酒。（2）灼烧伤：涂以凡士林、5％的鞣酸或2％的苦味酸。（3）化学药品腐蚀伤：若为强酸腐蚀，先用大量清水冲洗后，再用50g/L碳酸氢钠或氢氧化铵溶液洗涤中和；若为强碱腐蚀，也先用大量清水冲洗后，再用5％醋酸或5％硼酸溶液洗涤中和。若受伤的是眼部，经过上述处理后，最后滴入橄榄油或液体石蜡1～2滴。（三）无菌室结构与灭菌···杀菌前做好一切准备工作，然后用紫外线杀菌灯进行空气消毒，开灯照射30min后关灯，间隔30min后方可进入室内工作···无菌室的熏蒸消毒主要采用甲醛熏蒸消毒法。氧化熏蒸：甲醛熏蒸后关门密闭应保持12小时以上。···生物安全（Biohazard）一般是指由现代生物技术开发和应用所能造成的对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。实验室的生物安全水平可以分为：基础实验室——一级生物安全水平BSL-1进行试验研究用的物质都是已知的所有特性都已清楚并且已证明不会导致疾病的多种微生物物质。操作人员只需经过基本的实验室实验程序培训并且通常由科研人员指导不需要生物安全柜的存在基础实验室——二级生物安全水平BSL-2进行试验研究用的物质是一些已知的中等程度危险性的并且与人类某些常见疾病相关的物质。操作者必须经过相关研究的操作培训并且由专业科研人员指导。在这些条件下最好使用二级的生物安全柜。如：流感病毒防护实验室——三级生物安全水平BSL-3进行试验研究的物质一般都是本土或者外来的有通过呼吸传染使人们致病或者有生命危险可能的物质。需要保护一切在周围环境中等操作者免于暴露于这些有潜在危险的物质中。通常使用二级或者三级的生物安全柜是必需的。如：炭疽芽孢杆菌、鼠疫杆菌、结核分枝杆菌、最高防护实验室——四级生物安全水平BSL-4进行试验研究的物质是一些极高危险性并且可以致命的有毒物质可以通过空气传播并且现今并没有有效的疫苗或者治疗方法来处理。操作者必须经过熟练的关于进行这种极高危险性物质研究的培训，有非常有经验的科研人员进行指导，严禁独自在4级实验室工作。三级的生物安全柜是必需的。如：埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒一节常用仪器培养箱、水浴箱（亦称水恒温箱，为血清实验常用仪器）、超净工作台、干燥箱（烘箱）、高压蒸汽灭菌锅、离心机二节常用玻璃器皿试管、培养皿、三角瓶、刻度吸管、试剂瓶、玻璃缸、玻璃棒、玻璃珠、滴瓶、玻璃漏斗、载玻片凹玻片及盖玻片、发酵管、注射器及大小针头、量筒、量杯1、试管要求管壁较厚，管直而口平。常用试管有以下几种规格：74mm×10mm，适用于康氏试验用。85mm×15mm，较前者粗短，最适宜凝集反应用。100mm×13mm，适于作生化反应试验、凝集反应及华氏血清试验等用。120mm×16mm，始于作斜面培养基等用。150mm×16mm，较前者稍长，常用于盛培养基。200mm×25mm，用以盛较多量培养基，作倾注平板用2、培养皿主要用于细菌的分离培养。常用培养皿有50mm×10mm，75mm×10mm，90mm×10mm和100mm×10mm等几种规格。活菌计数原则上用90mm×10mm规格。3、三角瓶多用于贮存培养基和生理盐水等溶液，有50mL，100mL，150mL，200mL，250mL，300mL，500mL，1000mL，2000mL等多种规格4、刻度吸管常用的吸管容量有1mL，2mL，5mL，10mL等；做某些血清学试验亦常用0.1mL，0.2mL，0.25mL，0.5mL等容量吸管5、试剂瓶容量30~1000mL不等，有棕色和无色的两种，前者盛贮避光试剂用。9、滴瓶容量有30ml货60ml，贮存染色液用。玻璃器皿的灭菌——干热灭菌器内160℃，2h灭菌。灭菌：杀灭物体中或物体上所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）的繁殖体和芽孢的过程称为灭菌消毒：用物理的、化学的或生物学的方法杀灭病原微生物的过程称为消毒。防腐：防止或抑制微生物生长繁殖的方法称为防腐。无菌：无菌是不含有活的微生物的意思第三节食品微生物检验的一般程序食品微生物检验的一般步骤菌落总数样品保存样品处理结果报告大肠菌群样品采集分离培养染色镜检选择参检验前致病菌纯生化验验考菌群的准备化血清学试验增菌分离培养动物试验2、样品的种类：大样（一整批）；中样（200g）；小样（25g）3、采样的步骤采样前调查→现场观察→确定采样方案→采样→样品封存→开具采样证明检验目的：检验食品的微生物卫生指标是否合格。4、抽样方案国际食品微生物学规范委员会（ICMSF）取样方案；美国FDA微生物学取样方案；世界粮农组织（FAO）取样方案;其他方案。（1）ICMSF的取样方案···ICMSF：国际食品微生物学规范委员会···ICMSF采样方法中包括二级法及三级法两种。二级法只设有n、c及m值，三级法则有n、c、m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。四个代号：n：系指同一批次产品应采集的样品件数。c：最大可允许超出m值的样品数。m：微生物指标可接受水平的限量值。M：微生物指标的最高安全限量值。二级抽样方案:自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。Eg：以生食海产品鱼的副溶血性弧菌为例，n=5，c=0，m=100，n=5即抽样5个，c=0即意味着在该批检样中，不得有超过m值（100）的检样，此批货物为合格品。如果c≧0表明该批产品不合格。冷冻生虾的细菌数标准n=5，c=3，m=10，M=100，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果，允许≤3个检样的菌数是在m~M值（10~100）之间，如果有3个以上检样的菌数是在m~M值（10~100）之间或一个检样菌数超过M值（100）者，则判定该批产品为不合格品。I类危害：老人和婴幼儿食品及在食用前可能会增加危害的食品；Ⅱ类危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不变；Ⅲ类危害：食用前经加热处理，危害减小的食品。将检验指标对食品卫生的重要程度分成一般、中等和严重三档在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案，对健康危害低的则建议使用三级抽样方案。（2）美国FDA的取样方案食品药品管理局(FDA)的取样方案与ICMSF的取样方案基本一致，所不同的是严重指标菌所取的15、30、60个样可以分别混合，混合的样品量最大不超过375g。··食物中毒微生物检验的取样检验目的：查找食物中有何病原菌。···人畜共患病病原菌检验的取样检验目的：鉴定畜禽及其产品是否带有人兽共患的病原菌。···采样标签的填写标签内容主要：编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。···.样品的送检要求——要快速运送：不要超过3小时；——若路途遥远，可在1~5℃低温下运送；——要注意防污染、防散漏、防变质；——要填写检验申请单。···致病菌检验参考菌群的选择蛋及蛋制品：沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等水产品海产品：链球菌、副溶血性弧菌乳制品：沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、蜡样芽胞杆菌畜禽肉类：肠道致病菌和致病性球菌米面类：蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母菌、霉菌等罐头：耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌··样品的保留（1）阴性样品：在发出报告可及时处理；（2）阳性样品：在发出报告以后3天才能处理样品；（3）进口食品的阳性样品：要保留6个月才能处理。（4）微生物检验不进行复检··微生物检验流程图1、无菌取样——2、样品均质——3、样液稀释——4、样品接种——5、恒温培养——6、结果观察第三章食品微生物检验基础第一节细菌学检验基础一、无菌技术（一）什么是无菌技术无菌技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。（二）无菌环境无菌室无菌柜超净工作台无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间（三）无菌器材灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等（四）无菌操作目的：（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。二、微生物的接种与分离技术（一）接种接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种常用的接种方法有以下几种：１）划线接种２）三点接种３）穿刺接种４）浇混接种５）涂布接种６）液体接种７）注射接种８）活体接种(二)分离纯化１.倾注平板法２.涂布平板法３.平板划线法（斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法）三、细菌培养方法对气体需求不同细菌培养分为三种，即需氧培养法、CO2培养法、厌氧培养法。(一)需氧培养法：适合于需氧菌及兼性厌氧菌的培养。(二)CO2培养法：CO2培养箱法、烛缸法、化学法(三)厌氧培养法如在液体培养基的表面加盖凡士林或蜡，或在液体培养基中加入碎肉块制成疱肉培养基等。此外，也可以利用物理或化学方法除去培养环境中的氧，以保证厌氧环境。四、细菌的生长现象菌落：细菌经一定时间培养后，在固体培养基表面所形成的，肉眼可见的物体（群落），称为菌落。细菌在鉴定培养基上的特征（1）在血平板上的溶血特征α溶血：在菌落周围出现狭窄的草绿色的半透明区域，而红细胞外形完整。β溶血：在菌落周围出现一个大小不一的完全透明清楚的宽带。γ溶血：看不到溶血带的溶血。双环：菌落周围完全溶解的晕圈外有一部分溶血的圆圈。(2)卵黄琼脂中的反应(3)蛋白水解作用：在菌落周围出现清晰的环。(4)色素：水溶性色素溶在培养基中、脂溶性色素则使细菌菌落着上颜色（5）气味：假单胞菌属细菌——葡萄汁气味；变形杆菌——巧克力烧焦的臭味；链球菌——地窖里的霉臭；梭菌——粪臭、腐败味；产黑色素类杆菌属细菌——辛辣味等。(二)细菌在液体培养基中的生长现象液体中生长特性包括：发育程度、浑浊度、沉淀、液体表面性状、其他(三)细菌在半固体培养基中的生长现象半固体培养基主要用于细菌动力的观察。五、细菌的生化反应检查法在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的PH值变化。在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。生化试验的注意事项1、待检菌应是新鲜培养物。培养18-24h。2、待检菌应是纯种培养物。3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4、应做必要的对照试验。5、提高阳性检出率，至少挑取2-3个待检的疑似菌落分别进行试验。生化试验分类（一）糖类代谢试验（二）氨基酸和蛋白质代谢试验（三）有机酸盐和铵盐代谢试验（四）酶类试验(一)糖类代谢试验1.糖(醇)发酵试验结果：阳性——培养基变为黄色、气泡/气泡阴性——培养基未变色、无气泡产生2.甲基红(MR)试验结果MR阳性：培养物有足够的酸，能使培养基表面甲基红试剂仍保持明显的红色(pH4.4)；MR阴性：培养基表面呈黄色(pH6.0)；延迟反应：橙色，应继续孵育到4天，并重复试验3.伏普试验(V-P试验)二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V-P（+）反应。结果如立即或于数分钟内出现红色反应者为阳性；若为阴性应将试管置37℃中4h后再进行观察4.β-半乳糖苷酶试验β-半乳糖苷酶是一种诱导酶，它对半乳糖苷的作用是特异的不能发酵乳糖的细菌可呈现两种表型之一：一是G-P+，即没有β-半乳糖苷酶(G)，但有渗透酶(P)，因此不能发酵半乳糖苷，但能积累半乳糖苷；二是G+P-，具有β-半乳糖苷酶(G)，但没有渗透酶(P)。结果：如有β-半乳糖苷酶，一般在20～30min即呈现黄色者为阳性；如无此酶则24h不变色。5.七叶苷水解试验七叶素可与培养基中的柠檬酸铁试剂的二价铁离子起反应生成黑色的化合物沉淀，使培养基变黑。结果培养基变黑色者为试验阳性6.石蕊牛乳试验结果产酸：若发酵糖产酸，使石蕊指示剂变为粉红色。产气：若发酵乳糖同时产气者，可冲开覆盖在培养基上的凡士林。凝固：若发酵乳糖产酸甚多，可使酪蛋白凝固。胨化：若将凝固的酪蛋白，继续水解成蛋白胨，此时牛乳培养基的上段则变清。产碱：若不发酵乳糖，分解含氮物质，生成氨及胺，使培养基变碱性，石蕊指示剂变蓝紫色。（二）氨基酸和蛋白质代谢试验1.靛基质（Imdole）试验某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。结果两层液体交界处出现红色为阳性，无色为阴性2.硫化氢试验(1)琼脂穿刺法结果：培养基变黑色为阳性。当产生硫化氢量少时，为了便于观察结果，在穿刺接种培养时，一定要沿培养基管壁进行。(2)醋酸铅试纸法结果：试纸呈黑色为阳性。该法较敏感。3.尿素酶试验结果培养基变红为阳性，不变为阴性。4.明胶液化试验结果半固体培养基不再凝固为阳性。注意事项:明胶在≤20℃时为固体，≥35℃时则为液体。从凝胶(固态)转变为液体大约在28℃。所以，明胶管在≥35℃下孵育时，在决定是否液化以前，必须先放在冰箱或冰浴中冷却一段时间。因细菌在培养基的表面生长引起液化，当明胶管还温热时不要摇动5.苯丙氨酸脱氨酶试验原理某些细菌产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸和游离氨，加入FeCl3试剂与苯丙酮酸螯合后出现绿色产物，随后绿色可褪去。延长时间后，所生成的绿色会较快褪色。结果须在5min内作出判断，出现绿色为阳性。6.氨基酸脱羧酶试验(1)赖氨酸：赖氨酸经过赖氨酸脱羧酶作用生成尸胺和CO2。(2)鸟氨酸：鸟氨酸经鸟氨酸脱羧酶的脱羧作用，产生腐胺和CO2。(3)精氨酸：L-精氨酸经精氨酸脱羧酶的作用，可产生精胺和CO2。结果检测培养基由黄色变紫色为阳性，黄色为阴性，对照(无氨基酸)为黄色。7.精氨酸双水解试验结果指示剂颜色转为碱性时为阳性。即溴甲酚紫转为紫色，酚红转为红色。8.肉渣消化试验肉渣消化试验是测定细菌对蛋白质的另一种分解能力。结果观察管内肉渣的高度有无变化，即可判定肉渣是否已被部分消化。9.凝固血清消化试验原理某些细菌液化凝固血清，系由于这些细菌产生一种胞外蛋白酶的作用所致结果凝固之血清发生液化为阳性(三)有机酸盐和铵盐代谢试验1.柠檬酸盐利用试验结果培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，不变色为阴性。2.马尿酸钠水解试验三氯化铁法原理：B群链球菌具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸与三氯化铁试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀.结果：出现稳定的沉淀物为阳性，轻摇后沉淀物溶解为阴性。茚三酮法原理：马尿酸被细菌分解后，形成苯甲酸及甘氨酸。甘氨酸在茚三酮的作用下，经氧化脱氨基反应，生成氨，CO2和相应的醛，而茚三酮则生成了还原型茚三酮。其中形成的氨和还原型茚三酮，与残留的茚三酮起反应，形成紫色化合物结果：出现紫色为阳性3.丙二酸盐利用试验丙二酸钠可被分解生成碳酸钠，使培养基变碱性。溴麝香草酚蓝：pH6.0(黄)～7.6(蓝)结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。(四)酶类试验1.氧化酶试验(Kovacs试验)对苯二胺氧化，生成红色的醌类化合物。结果：阳性者立即呈现粉红色或红色，颜色逐渐变深至深紫色。2.过氧化氢酶试验(触酶试验)原理过氧化氢酶又称触酶，可使细菌代谢过程中的过氧化氢分解为水和氧。实验时必须用18～24h新鲜培养物。结果30s内有大量气泡产生者为阳性，无气泡产生者为阴性。3.硝酸盐还原试验结果出现红色为阳性，无颜色变化为阴性。4.过氧化物酶试验结果阳性者于2min内呈现蓝色。5.脱氢酶试验若用美蓝（亚甲蓝，Methyleneblue）作为受氢体的话，细菌如有脱氢酶存在，可使美蓝还原成美白(无色)。如果用无色TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）作为受氢体，在有脱氢酶存在的情况下，TTC可以接受氢而成为红色的Formazan（甲臜zā)。结果若第1管变白即为相应作用物的脱氢酶阳性，不变色为阴性。第2管与第3管为对照管，应不变色。6.氧化三苯基四氮唑试验(TTC试验)结果出现红色者为阳性，淡红色者为弱阳性，不变色者为阴性。7.脂酶试验原理：某些细菌产生卵磷脂酶，即α-毒素，在有钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成混浊沉淀状的甘油酯和水溶性的磷酰胆碱结果产生卵磷脂酶的细菌，培养3h后，在菌落周围形成乳白色混浊环，6h后扩散至5～6mm。8.磷酸酶试验用磷酸酚酞为基质，经磷酸酶水解后可释放出酚酞，在碱性环境中可呈红色。结果如有酚酞释出，菌落即变为粉红色9.DNA酶试验在DNA琼脂平皿上加入盐酸后，在菌落周围形成透明环。结果菌落周围产生透明环为阳性，无透明环为阴性。10.血浆凝固酶试验金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，凝固酶可分为两种，一种是与细胞壁结合的凝固酶，可用玻片法测定；另一种是菌体生成后释放于培养基中的游离凝固酶，可用试管法测出。(i)玻片法：血浆中有明显颗粒出现，而生理盐水中无自凝现象为阳性(ii)试管法：待检菌株管和阳性菌株管出现凝固，阴性对照管不出现凝固，为阴性。第二节免疫学基础一、抗原与抗体（一）抗原（Antigen，Ag）完全抗原包括下面两方面的免疫性能：一是免疫原性,指抗原进入体内刺激免疫系统产生抗体或形成致敏淋巴细胞的特性，具有这种能力的物质称为免疫原；二是免疫反应性，指抗原能和对应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的特性，又称为反应原性。半抗原：有些物质，单独存在时只有反应原性而无免疫原性，是非免疫原物质（2）免疫原性一种抗原能否成功地诱导免疫动物（宿主）产生免疫应答取决于以下几个方面的因素：抗原结构和性质、宿主的反应性和免疫方式。在抗原的结构和性质方面，包括抗原的异质性、分子量大小和化学结构等。异质性是指抗原物质和宿主动物本身物质之间的差异。抗原的分子质量大于10ku时，均具有较好的免疫原性，分子质量越大，免疫原性越强宿主的免疫方式，主要包括抗原的进入途径、剂量、次数、间隔时间等。（3）特异性抗原的特异性表现在两个方面：在免疫原性上，一种抗原只能诱发一种特异的免疫应答，结果形成特异性抗体或致敏淋巴细胞；在反应原性上，抗原只能与抗原诱导产生的特异性抗体或致敏淋巴细胞进行反应。抗原的特异性是免疫学技术广泛应用于疾病诊断、鉴别和防治的基础。2、抗原的分类按抗原性质——完全抗原：既具有免疫原性又具有反应原性的物质。——不完全抗原：只有反应原性而没有免疫原性的物质。不完全抗原（半抗原）：简单半抗原、复合半抗原（2）按化学组成分蛋白质抗原、多糖抗原、类脂抗原（3）按来源分异种抗原(heteroantigen)：与免疫动物不同种属的抗原。同种抗原(Alloantigen)：与免疫动物同种属的抗原，能刺激同种而基因型不同的个体产生免疫应答。自身抗原(Autoantifen)：动物的自身组织细胞、蛋白质在特定条件下形成的抗原，对自身免疫系统具有抗原性。异嗜性抗原(Heterophilantigen)：是指与种属特异性污垢、存在于人、动物、植物及微生物之间性质相同的抗原（交叉抗原）。也叫Fossman抗原（4）按存在部位分细菌抗原：表面抗原[菌体抗原：（O存在于细胞壁、主要成分为脂多糖）为数成；鞭毛抗原：（H）指存在于鞭毛，主要成分为蛋白质。H抗原也有不同菌群特异性；荚膜抗原：主要成分为多肽]深部抗原:指细菌的内部结构所形成的抗原物质（免疫中不起作用）病毒抗原：V抗原：不耐热；S抗原：可溶性（二）抗体抗体主要存在于动物血清中，也存在于动物的其他体液和体外分泌液；抗体还存在于某些细胞，例如B淋巴细胞的膜上。免疫球蛋白（immunoglobin，Ig）：人类的Ig可分为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE五大类IgG是Ig中主要的组成成分，约占血清总蛋白质的15%。应用于免疫学技术中的抗体主要是IgG和IgM，以IgG最为常用。二、常用的免疫学技术据根研究内容的不同，免疫检测技术可以分为细胞免疫检验技术和体液免疫检验技术两大类。（一）抗原－抗体反应可以发生在体内，也可以发生在体外在进行体外免疫学实验时，通常是以存在于血清中的抗体(也是抗体的主要存在形式)为材料进行的，所以体外免疫学反应又称为血清学反应。1、抗原抗体反应的原理抗原与抗体的特异性结合，特性是由抗原和抗体分子的一级结构决定的。抗原抗体分子之间的特异性结合力包括电荷引力、范德华(vanderWaals)力、氢键和疏水作用。2、抗原-抗体反应的特性抗原-抗体反应的最大特点是①特异性②可逆性③比例性常见的血清学反应：凝集反应、沉淀反应、补体结合试验、免疫标记技术１、凝集反应包括：直接凝集反应、间接凝集反应、反向间接凝集反应、协同凝集反应等。2．沉淀反应包括：单向琼脂扩散、双向琼脂扩散、对流免疫电泳、火箭电泳等。对流免疫电泳常用于鉴定血清型。火箭电泳（rocketelectrophoresis）又称电免疫扩散法，主要用于检测标本中某一免疫球蛋白含量。3．免疫标记技术（1）免疫荧光技术：（2）免疫酶技术：（3）放射免疫测定法：(4)免疫印迹法：(5)免疫金标技术：(6)免疫PCR：食品卫生细菌检验常用的微生物检验指标为三项，即细菌总数（主要是菌落总数）、大肠菌群最近似数和致病菌的检测。第一节菌落总数的测定一、菌落总数与食品卫生质量目的：了解食品在生产中，从原料加工到成品包装受外界污染的情况；也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，确定食品的保存期，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。菌落总数的几个概念菌落总数：AerobicPlateCount，食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培基、温度、时间、pH、需氧性质等）所得1mL（g）检样中形成微生物菌落的总数。只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数。菌落总数不等于细菌总数。菌落：Colony，单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见有一定细菌群落。CFU:ColonyFormingUnits，菌落形成单位。细菌数量的表示方法：菌落总数、细菌总数菌落总数意义：食品中菌落总数的多少，直接反映着食品的卫生质量。是判断食品卫生质量的重要依据之一。（1）可以反应食品的新鲜度。（2）可以反应食品被细菌污染的程度。（3）生产过程中食品是否变质。（4）食品生产的一般卫生状况等。如果食品中菌落总数多于10万个，就足以引起细菌性食物中毒；如果人的感官能察觉食品因细菌的繁殖而发生变质时，细菌数大约已达到106-107CFU/g(mL或cm2)。食品中菌落总数的测定对评定食品的新鲜度和卫生质量起着一定的卫生指标作用，但还必须配合大肠菌群的检验和病原菌项目的检验，才能作出比较全面准确评定。说明：国家标准中采用的培养方法是样品处理后倾注平板，36℃，培养48±2小时——实际测定的是嗜中温好氧菌的菌落总数。菌落总数测定是对细菌的无差别培养，不能区分细菌种类，所以有时被称为杂菌数。二、菌落总数的测定方法（重点）GB/T4789.2-2010三、菌落总数测定的方法平板倾注法：平板表面涂布法；平板表面点滴法四、平板倾注法测定菌落总数1、检验步骤(程序)：检样→稀释处理→做平板→培养→菌落计数→报告结果培养条件：普通食品：37℃，48h清凉饮料、调味品、糕点、酒类：37℃，24h水产品：30℃，48h平板菌落计数法测定食品中的菌落总数，一般采用中温培养2）菌落计数和报告到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。平板菌落的选择（1）选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定的标准。一个稀释度使用两个平皿，应选择两个平板的平均数。（2）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。（3）如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。稀释度的选择（1）选取菌落数在30～300之间的平板，若有二个稀释度均在30～300之间时，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则报告其中稀释度较低的平皿菌落数。（2）如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。（3）如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告。（4）如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30～300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告。（5）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。菌落数的报告1）菌落数在1～100时，按实有数字报告。2）如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为缩短零的个数，以10的指数表示。3）固体检样以克（g)为单位报告，4）液体检样以毫升（mL）为单位报告，5）表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。2、检验注意事项1）对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；2）吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；3）进行稀释时，吸管口不得与稀释液接触;4）为防止细菌增值及形成片状菌落，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min。5）稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。结果表述10-1均数10-2均数描述最终结果25536均在30-300间则按计数公式2.6×103多不可计345各平板均>300，取稀释度最高者报告，余计为多不可数3.5×104122均小于30则取稀释度最低者报告1.2×10233029所有平板均不在30-300CFU且一部分<30或>300者以最接近30或300者报告2.9×10300所有平板均无菌落则记为1乘以最低稀释倍数报告1×10，10第二节食品中大肠菌群的测定一、大肠菌群的定义及范围大肠菌群(coliformbacteria)在一定条件下能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。大肠菌群主要是由肠杆菌科（Enterobacteriaceae）中四个菌属内的一些细菌所组成，即埃希氏菌属（Escherichia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）及肠杆菌属（Enterobacter）。大肠菌群中大肠埃希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、V-P和枸橼酸盐利用四个生化反应分别为“++--”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则被称为非典型大肠杆菌。二、大肠菌群的测定意义1.粪便污染的指标细菌2．粪便污染指标菌的选择作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。①存在于肠道内特有的细菌，才能显示出指标的特异性。②在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出。③在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不再繁殖。④检验方法简便，易于检出和计数大肠菌群都直接或间接来自于人或温血动物的粪便。作为粪便污染的指标细菌还有：分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等。大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处：①饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行。②大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。③在外界环境中，有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。3．大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。大肠菌群的检出，不仅反映检样被粪便污染总的情况，而且在一定程度上也反映了食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况，所以具有广泛的卫生学意义。大肠菌群作为粪便污染指标菌而被列入食品卫生微生物学常规检验项目。如果食品中大肠菌群超过规定的限量，则表示该食品有被粪便污染的可能，而粪便如果是来自肠道致病菌者或者腹泻患者，该食品即有可能污染肠道致病菌。所以，凡是大肠菌群数超过规定限量的食品，即可确定其卫生学上是不合格的，该食品食用是不安全的···大肠菌群的生物学特性形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽孢杆菌。发酵乳糖产酸产气。培养特性：1、在伊红美兰(ＥＭＢ)琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽。2、在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。···大肠菌群数量的表示方法以每100g或100mL检样中大肠菌群最近似数（MPN)来表示。MPN是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值。三、大肠菌群测定的国家标准GB4789.3-2010培养基和试剂：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤1、初发酵试验：蛋白胨提供细菌生长发育所需的氮源、维生素和氨基酸；乳糖提供发酵所需的碳源；磷酸氢二钾维持缓冲体系；月桂基硫酸盐LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵”来促进菌体产气。煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤2、复发酵试验煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）：BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和大肠菌群以外的很多革兰氏阴性细菌，再根据发酵乳糖的情况判断大肠菌群。结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）磷酸盐缓冲液MPN为最大可能数(MostProbableNumber)的简称。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。大肠菌群平板计数的报告例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。第五章食品中致病菌的检验第一节食品中肠道致病杆菌的检验一、沙门氏菌检验·沙门氏菌属是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科中的一个大属·沙门氏菌常作为进出口食品和其他食品的致病菌指标。(一)形态与染色沙门氏菌为革兰氏阴性较为细长的杆菌，除鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌外，其余都具有周身鞭毛，能运动，绝大多数都具有纤毛，(二)命名1．根据所致疾病命名如引起伤寒病的菌型，命名为伤寒沙门氏菌(S.typhi)；引起猪霍乱病的菌型，命名为猪霍乱沙门氏菌(S.cholerae-suis)，引起马流产的菌型，命名为马流产沙门氏菌(S.abortus-equi)等。2．根据首先发现的地区命名3．根据人名命名(三)培养特性沙门氏菌最适生长温度为35℃～37℃，10h～42h能生长，最适生长pH为7.2～7.4沙门氏菌属按其生化特性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五个亚属，其中亚属Ⅲ又称为亚利桑那菌，它们在亚硫酸铅琼脂、DHL琼脂、HE琼脂和SS琼脂平板上培养特性各不相同。亚硫酸铋琼脂(BS)：产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。DHL琼脂：无色半透明：产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色。亚利桑那菌乳糖阳性菌株是粉色。HE琼脂：蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色。亚利桑那菌乳糖阳性菌株是黄色。 SS琼脂 ：无色半透明：产硫化氢菌株有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明显。亚利桑那菌乳糖阳性菌株是粉色。XLD琼脂培养基：多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色。生化特性1）发酵葡萄糖，甘露醇，山梨醇产酸产气（鸡伤寒沙门氏菌少数不产气）。2）不发酵乳糖，蔗糖，侧金盏花醇。3）V—P试验（-），多数产生H2S（+），不产靛基质（-），不分解尿素（-），苯丙氨酸脱氨酶试验（-）。(四)抗原结构沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般可分为四种：菌体抗原，又称为Ｏ抗原；鞭毛抗原，又称为H抗原；表面抗原又称K抗原；以及菌毛抗原。1）O抗原：也称菌体抗原，细胞壁最外层的多糖-类脂-蛋白质复合物。耐热，100℃2.5h不被破坏。可将菌体进行分群或组。（A、B、…Z；O1、O2、…)，引起人类疾病的主要在A-F群，且此几个群包含了95%以上的沙门氏菌。2）H抗原：也称鞭毛抗原，鞭毛蛋白。不耐热，60℃15min可破坏。每群（组）沙门氏菌根据H抗原进行分型或种。（分为两相；第一相（特异相）（a、b、…z，z1,z2,…z55），第二相（非特异相）（1、2、…）3）Vi抗原：也称表面抗原（荚膜抗原），糖脂，具有阻抑O抗原发生凝集的现象，极少数菌含有。不耐热，60℃30min或100℃5min即可破坏。1、菌体抗原(O抗原)沙门氏菌的Ｏ抗原主要存在于细菌细胞壁的最外层，是多糖—类脂—蛋白质的复合物，简称脂多糖，也就是本属细菌的内毒素。O抗原很稳定，能耐热100℃达数小时。O抗原含有许多不同的多糖成分，分别以1，2，3…等阿拉伯数字表示，O抗原与抗Ｏ血清混合后，在56℃经4h～12h或37℃过夜，出现颗粒状不易摇散的Ｏ凝集现象。2、鞭毛抗原(H抗原)沙门氏菌的H抗原存在于鞭毛上，化学成分为蛋白质H抗原与抗H血清经56℃2h后，可出现疏松易于摇散的絮状凝集，称为H凝集。H抗原可分为两相，第1相为特异相，用英文小写字母表示；第2相为非特异性相，用阿拉伯数字表示，但少数也有用英文字母来表示的。具有两相鞭毛抗原的细菌称为双相菌，仅具有一相鞭毛抗原的细菌称为单相菌。如甲型副伤寒沙门氏菌只具有1相抗原a。3、表面抗原(K抗原)主要包括Vi抗原和M抗原。（1）Vi抗原（微荚膜抗原，virulence）具有Vi抗原的细菌有抗吞噬作用和保护细菌避免相应抗体在补体参与下的溶菌作用，故毒力较强。Vi抗原由多糖所组成，很不稳定，不耐热Vi抗原位于菌体的最表层，罩在O抗原的表面。Vi抗原对鉴定伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌很重要。（2）M抗原黏多糖成分，M抗原能耐热60℃1h，加热100℃2h后，其可凝集性及抗体产生能力即被破坏，而凝集素结合能力仍然保存。经甲醛处理或60℃处理1h后的活菌抗原，能刺激机体产生M凝集素。在菌型鉴定上无特殊意义。4、菌毛抗原（F抗原）沙门氏菌的菌毛有抗原性，用其免疫能获得高效价的血清。(五)抗原变异1、H－O变异H－O变异指有动力的菌株(H型)丧失H抗原而成为无动力的变种(O型)，这些变种性质十分稳定，一般不能逆转。2、S－T—R变异这是指丧失O抗原，由光滑型(S型)过渡到T(transient)型或粗糙型(R型)的一种变异。T型菌含有一种新的对热稳定的抗原，称为T抗原。T型菌不含有正常的O抗原，是介于S—R型间的过渡形体，其形态光滑，与S型无法鉴别，但不被O血清凝集。3、型体变异型体变异指菌体抗原含量的改变，包括O型变异和V－W型变异。（1）O变异（2）V－W变异这是指失去Vi抗原的变异。初次从患者分离到的具有Vi抗原的菌株称V菌株。4、位相变异位相变异是鞭毛抗原的一种质的改变。(六)抵抗力对热、消毒药及外界环境的抵抗力不强，不耐热，60℃，20－30min即被杀死。冷冻对于沙门氏菌无杀灭作用，即使在-25℃低温环境中仍可存活10个月左右。沙门氏菌对热及外界环境的抵抗力属于中等。60℃20min～30min即被杀死；在普通水中虽不易繁殖，但可存活2周～3周；在自然环境的粪便可生存1～2个月；在冰箱中可生存3～4个月；在-25℃可存活10个月左右；在干燥的垫草中可存活8周～20周。当水煮或油炸大块鱼、肉、香肠、肉饼时，若食品内部温度达不到足以杀死细菌的情况下，就会有细菌残留。对化学药品的抵抗力较弱。如以5％苯酚或1︰500升汞处理，5min可杀死；胆盐、煌绿及孔雀绿等对本属细菌的抑制作用较大肠杆菌为小。常可用以制备选择性培养基；对氯霉素敏感(目前发现，许多菌株都能抵抗一定浓度的硫胺类、土霉素和链霉素等药品)。（七）沙门氏菌食物中毒沙门氏菌能引起人和动物的疾病，主要是通过消化道传染。沙门氏菌食物中毒的症状是：急性胃肠炎，如呕吐、腹痛、腹泻和因细菌毒素引起的中枢神经系统症状（如发烧、头痛、有时有痉挛）。有的血清型专对人致病，如伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌为人类的伤寒和副伤寒病原菌；有些血清型专对动物致病，如马流产和羊流产沙门氏菌为马和羊的病原菌。有些血清型的沙门氏菌对人和动物都有致病性，它们的宿主特异性较弱。如肠炎沙门氏菌、都柏林沙门氏菌为牛伤寒的病原菌等沙门氏菌污染食物的主要原因为：①病畜或病禽的肉制成食品；②病畜或病禽的粪便污染了食物；③带菌人在制作食物的过程中污染了食物；④生熟食品未分开而造成的交叉污染。预防①加强食品卫生管理，防止污染：主要应采取积极措施控制感染沙门氏菌的病畜肉类流入市场。②控制繁殖：沙门氏菌的最适繁殖温度为37℃，但在20℃以上即能大量繁殖。因此低温贮存食品是一项重要预防措施。③杀灭病原菌：加热杀灭病原微生物也是预防食物中毒的重要措施。（八）沙门氏菌检验程序GB/T4789.4-2010BPW（碱性蛋白胨水）：用于修复受损伤的沙门氏菌，但由于其不具有选择性，因此增菌时间过长会导致杂菌生长过多干扰鉴定结果，故建议最好控制在4h为好。常用选择性培养基比较SC（亚硒酸盐胱氨酸增菌液）TTB（四硫磺酸钠煌绿增菌液）MM亚硒酸盐抑菌胱氨酸促生长四硫酸钠和煌绿抑菌氯化镁和孔雀绿抑菌适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长，37℃适合其他沙门菌生长，42℃，18-24h为防漏检宜SC+TTB/MM初步生化试验做三糖铁(TSI)试验，三糖铁试验主要是测定细菌对葡萄糖、乳糖、蔗糖的分解、产气和产硫化氢情况，三糖铁培养基成分除牛肉膏、蛋白胨外，主要有葡萄糖(1g/L)、乳糖(10g/L)、蔗糖(10g/L)、二价铁盐、酚红等，pH为7.4。培养基做好后，摆成高层斜面，培养基颜色为砖红色。使用时先将待检菌株穿刺接种，然后再将待检菌株划线接种于高层斜面上，36℃培养18～24h国标中采用靛基质、尿素、氰化钾和赖氨酸四项生化试验。若硫化氢＋、靛基质－、尿素－、氰化钾－、赖氨酸＋，可判断为沙门氏菌属，这是典型沙门氏菌的反应。玻片凝集法原理步骤：先多价后单价，先常见的后不常见的，先O后H，根据结果查表得到鉴定菌种第二节食品中致病性球菌的检验一、金黄色葡萄球菌的检验金黄色葡萄球菌可以产生肠毒素，食后能引起食物中毒（一）形态与染色致病性葡萄球菌一般较非致病性菌小，且各个菌体的大小及排列也较整齐。细菌繁殖时呈多个平面的不规则分裂，堆积成为葡萄串状排列。葡萄球菌无鞭毛及芽胞，一般不形成荚膜，易被碱性染料着色，G+，当衰老、死亡或被白细胞吞噬后常转为革兰氏阴性，对青霉素有抗药性的菌株也为革兰氏阴性。(二)分类葡萄球菌属于微球菌的葡萄球菌属，以往的分类方法是以菌落色素将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌三种。很不稳定。据《伯杰氏鉴定细菌学手册》第八版，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌三种。其中金黄色葡萄球菌多为致病性菌，表皮葡萄球菌偶尔致病，腐生葡萄球菌一般为非致病菌。60％-70％的金黄色葡萄球菌可被相应的噬菌体裂解，故可用噬菌体进行分型。通常使用的基本分型噬菌体有22型，根据它们对菌株的裂解反应，可将金黄色葡萄球菌分成以下几群：I群：29、25、52A、79、80；II群：3A、3B、3C、55、71；III群：6、7、42E、47、53、54、75、77、83A；IV群：42D。(三)培养特性可产生不同色素，因不溶于水，故色素只限于培养物，而不外渗至培养基中。色素的形成依培养条件而异：通常在22℃产生色素较多；于37℃培养后，再置室温1d-2d，色素产生明显；在固体培养基中含有碳水化合物、牛乳或血清等，色素形成最好，有O2及CO2环境下易形成色素，而在无O2环境中不形成色素。耐盐性强，在含5％-10％的氯化钠培养基中能生长，在含有20％-30％二氧化碳的环境中培养，可产生大量的毒素。在血琼脂平板上，形成的菌落较大，多数致病性菌株可产生溶血毒素，使菌落周围产生透明的溶血圈(β溶血)。(四)生化特性本属细菌大多数不能分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖。产酸不产气。致病菌株能分解甘露醇，产酸。甲基红阳性，V—P为弱阳性，多数菌株能分解尿素产氨，还原硝酸盐，不产生吲哚。(五)毒素与酶葡萄球菌的致病力决定于细菌产生的毒素和酶的能力。1、溶血毒素溶血毒素是一种外毒素，根据其对动物细胞的溶血范围、抗原性、溶血时所需温度等不同可分为α、β、γ、δ四种，其中以β溶血素为主。2、杀白血球毒素3、肠毒素引起急性肠胃炎，为一种可溶性蛋白质，耐热，经l00℃煮沸30min不被破坏肠毒素共分6型(A、B、C1．C2、D、E)，各型具有不同的血清学特性，其中以A型引起的食物中毒最多，B型和C型次之。4、血浆凝固酶是一种能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的兔或人血浆发生凝固的酶。凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。5、溶纤维蛋白酶可使人、犬、豚鼠及家兔的已经凝固的纤维蛋白溶解。6、透明质酸酶是机体结缔组织中基质的主要成分。又称为扩散因子7、脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸能够增加组织渗出物的粘性有人认为脱氧核糖核酸酶是鉴定葡萄球菌毒力的又一指标。(六)抗原结构葡萄球菌经水解后，用沉淀法分析，可得到两种抗原成分：蛋白质抗原多糖类抗原1．蛋白质抗原主要为葡萄球菌A蛋白(SPA)，能抑制吞噬细胞的吞噬作用，对T、B细胞是良好的促分裂原2、多糖类抗原为半抗原，存在于细胞壁上，具有型特异性。其抗原决定簇为磷壁酸的核糖醇单位。此抗原可用于葡萄球菌的分型。(七)抵抗力葡萄球菌抵抗力较强，为不形成芽胞的细菌中最强者(八)葡萄球菌的致病性葡萄球菌能引起的疾患主要有化脓性感染（如毛囊炎、疖、痈、伤口化脓、气管炎、肺炎、中耳炎、脑膜炎、心包炎等)；全身感染(如败血症、脓毒血症等)；食物中毒等等。·鼻腔是葡萄球菌的繁殖场所，也是身体各部位的传染源。·葡萄球菌是常见的化脓性球菌之一，化脓部位常成为传染源。患乳房炎的奶牛产的奶、·有化脓症的宰畜肉尸常带有致病性葡萄球菌。·葡萄球菌在不同食物、不同温度和pH值的条件下，产生的肠毒素是不同的。在pH值低于5的条件下很少产生肠毒素，当pH值高于9.8时，无论何型葡萄球菌肠毒素都不能产生。·引起葡萄球菌肠毒素中毒的食品，主要为肉、奶、鱼、蛋类及其制品等动物性食品。·葡萄球菌在空气中氧较低时较易产生肠毒素·食品污染了葡萄球菌并同时污染了其他微生物时，葡萄球菌的繁殖则受到抑制·葡萄球菌引起的食物中毒在常发生于夏秋季节(九)发病机理A型肠毒素的毒力最强，摄入1µg即能引起中毒，而B型肠毒素摄入25µg才能引起中毒。（十)检验原理金黄色葡萄球菌耐盐性强，在l00-150g/L的氯化钠培养基中能生长，适宜生长的盐浓度为5％-7.5％，可以利用这个特性对金黄色葡萄球菌增菌，抑制杂菌。金黄色葡萄球菌还可产生凝固酶，这是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标，是不是致病的金黄色葡萄球菌主要看它是否产生凝固酶。（十一）检验程序GB/T4789.10-2010第三节溶血性链球菌的检验按其在血平板上溶血能力分类，可分为甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、丙型溶血性链球菌和亚甲型溶血性链球菌。人类疾病有关的大多属于乙型溶血性链球菌，其血清型90%属于A族链球菌，常可引起皮肤和皮下组织的化脓性炎症及呼吸道感染，还可通过食品引起猩红热、流行性咽炎的爆发性流行（一）形态与染色：革兰氏染色阳性，衰老培养物常成阴性（二）培养特性对营养要求高，普通培养基不能良好生长，（需加血清液、腹水等）最适温度37℃，pH7.4-7.6，含M蛋白，革兰氏染色阳性。在液体培养基中，溶血菌株，呈絮状或颗粒状沉淀生长（上清下浊）；不溶血菌球，均匀浑浊生长，如粪链菌。链激酶：αβγδ四种溶血。(三)生化特性1、均分解葡萄糖产酸，产酸不产气。2、对乳糖、甘露醇、水杨苷等的分解因菌株而异。3、能使牛奶产酸而不凝固，不液化明胶4、A群菌对杆菌肽敏感5、一般不分解菊糖，不被胆汁或1%去氧胆酸钠所溶解。这两种特性用来鉴定甲型溶血型链球菌和肺炎球菌。6、链球菌与葡萄球菌不同，不产生过氧化氢酶。（四）致病性链球菌可产生的毒素和酶1、溶血素2、致热外毒素3、透明质酸酶4、链激酶5、脂磷壁酸6、链道酶7、杀白细胞素1、链球菌溶血素：有溶解红细胞，杀死白细胞及毒害心脏的作用，主要有“O”和“S”两种。2、致热外毒素：是人类猩红热的主要毒性物质，可分为A、B、C三种不同抗原性的毒素。无交叉保护作用3、透明质酸酶：又称扩散因子4、链激酶：又称链球菌纤维蛋白溶酶，该酶耐热，100℃50分钟仍可保持活性。5、脂磷壁酸（LTA）：6、链道酶：又称链球菌DNA酶，能使脓液稀薄，促进病菌扩散。主要由A、C、G族链球菌产生。用链激酶、链道酶制剂进行皮肤试验作为测定机体细胞免疫的一种方法。7、杀白细胞素（M蛋白）：M蛋白有抗原性，刺激机体产生型特异性抗体，并与变态反应疾病有关。（五）抗原结构链球菌的抗原构造较复杂，主要有三种：（1）核蛋白抗原或称P抗原，无特异性，各种链球菌均相同，与葡萄球菌有交叉。（2）多糖抗原或称C抗原，系群特异性抗原，是细胞壁的多糖组分，可用稀盐酸等提取。（3）蛋白质抗原或称表面抗原，具有型特异性，位于C抗原外层，其中可分为M、T、R、S四种不同性质的抗原成分，与致病性有关的是M抗原。（六）链球菌分类1、按溶血能力分类：（1）甲型（α）溶血性链球菌（2）乙型（β）溶血性链球菌（3）丙型（γ）溶血性链球菌（4）亚甲型溶血性链球菌与人类疾病有关的大多属于乙型溶血性链球菌。2．根据抗原结构分类C抗原不同可分类A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V等20个群。对人致病的大多属于A群。A群又称为化脓性链球菌（Pyogenicstreptococcus）。3.对氧的需要分类按照是否需要氧，可分为需氧链球菌、厌氧链球菌、微嗜氧链球菌。其中厌氧链球菌常寄生于口腔、肠道和阴道中，可致病的有消化链球菌属。（七）抵抗力抵抗力不强，60℃3分钟可杀死大部分链球菌，对一般消毒剂敏感，在干燥尘埃中可存活数日；乙型链球菌对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、磺胺均敏感。(八)流行病学与致病性一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品：1、食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染；2、食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包装不善而使食品受到污染。溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。(九)检验原理1、增菌溶血性链球菌对营养要求比较高，增菌一般用匹克氏肉汤或葡萄糖肉浸液肉汤。2、分离培养利用溶血性链球菌在血平板上所形成的特殊菌落分离、纯化3、验证试验分类：链激酶实验短杆菌肽敏感实验观察血平板溶血情况革兰氏染色（十）检验程序GB/T4789.11-2003操作步骤1.样品处理3.培养特性4.链激酶试验5.杆菌肽敏感试验第四节志贺氏菌检验志贺氏菌属(Shigella)的细菌通称为痢疾杆菌，是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原微生物很多，如志贺氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、艾希氏菌属等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏菌作为指标。志贺氏菌属是由四个亚群组成，即A、B、C、D四个亚群。A群:痢疾志贺氏菌，有10个抗原组成各不相同的血清型，其中包括最知名的志贺氏杆菌(1型痢疾志贺氏菌)和舒密次杆菌(2型痢疾志贺氏菌)。B群:福氏志贺氏菌，有6个血清型，其中的1～5又可分为两个亚型，还有x、y两个变种。C群:鲍氏志贺氏菌，有15个血清型，其中有的血清型有甘露醇阴性的变种。D群:宋内氏志贺氏菌，只有一个种(血清型)，它具有I相(光滑型)和Ⅱ相(粗糙型)的变异。(一)形态与染色为革兰氏阴性短杆菌无荚膜、无鞭毛、不形成芽胞，无动力，是与沙门氏菌不同之处。(三)生化特性志贺氏菌属的细菌发酵糖类和醇类的能力远比艾希氏菌属弱，但都能发酵葡萄糖，对侧金盏花醇、肌醇和水杨苷均不发酵，对其他糖类多为少数发酵：如宋内氏志贺氏菌对乳糖能迟缓发酵，鲍氏志贺氏菌9型的一些培养物能发酵，痢疾志贺氏菌I型少数培养物能迟缓发酵。(四)抗原结构志贺氏杆菌有O抗原和K抗原。1、O抗原脂多糖，耐热，稳定。不同的志贺氏菌O抗原不同。每群志贺氏菌中不同的O抗原用罗马数字表示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ····同一群志贺氏菌中不同菌型所带的O抗原也不同。2、K抗原K抗原包绕于某些新分离的痢疾杆菌表面，不耐热，加热100℃1h即被破坏。此抗原可以阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。(五)抵抗力志贺氏菌属的细菌与沙门氏菌属及其他肠道杆菌相比，对理化因素抵抗力较低。对酸较敏感，必须使用含有缓冲剂的培养基。在外界环境中的生存力，宋内氏志贺氏菌最强、福氏志贺氏菌次之，而痢疾志贺氏菌最弱。日光直射30min可杀死，56℃～60℃只需19min可杀死，1％石炭酸中15min～30min可杀死。(六)变异性1．S—R型变异菌落由光滑型变为粗糙型时，常伴有生化反应，抗原结构和致病性的变异。2、耐药性变异贺氏菌对四环素的耐药率达74％、氯霉素73.6％～97％、链霉素84％～98％、金霉素75％～100％、磺胺类97％～100％，(七)致病性志贺氏菌的致病作用，主要是侵袭力和菌体内毒素，个别菌株能产生外毒素，常使人得痢疾及食物中毒。1、侵袭力对粘膜组织的侵袭力是决定致病力的主要因素。2、内毒素引起一系列毒血症症状，如发热、神志障碍、甚至中毒性休克。典型的痢疾脓血粘液便。3．肠毒素痢疾志贺氏菌I型和II型能产生肠毒素，肠毒素的活性主要在小肠发生，而菌痢的病变主要在大肠。(八)志贺氏菌的食物中毒1、流行病学志贺氏菌食物中毒常称作志贺氏菌痢疾，传染是从人到人，无动物宿主。传染源是病人和带菌者，主要通过消化道传播。病后有一定的免疫力，但是免疫期短，也不稳固。可能因细菌菌型多，各型细菌之间无交叉免疫性之故。2、临床症状志贺氏菌食物中毒引起的细菌性痢疾可分为急性和慢性两大类、6个不同的型。（1）急性细菌性痢疾急性细菌性痢疾又分为急性典型、急性非典型和急性中毒性菌痢三型急性典型痢疾症状典型，有腹痛、腹泻、脓血粘液便、里急、后重、发热等（2）慢性细菌性痢疾慢性菌痢又分为迁延型、慢性隐伏型和急性发作型一般认为福氏志贺氏菌感染的慢性者较多。细菌性痢疾的带菌者有三种类型，即恢复期带菌者、慢性带菌者和健康带菌者。(九)防治措施1．加强饮水卫生严格做到不喝生水。2．注意饮食卫生自觉做到四不吃，即不吃生冷蔬菜、不吃不洁瓜果、不吃腐败变质食物、不吃未经回锅煮透的剩菜剩饭。3．自觉养成卫生习惯4．早期发现病人早期隔离治疗（十）检验原理：1、增