FDNB法测定氨基酸含量课件

FDNB法测定氨基酸含量主讲教师: 王英武电话: 5619955电子信箱: wyw@FDNB法测定氨基酸含量主讲教师: 王英武实验目的熟悉色谱仪器的组成及原理了解色谱分离的原理.重点介绍反相色谱柱(以C18为例)定量分析的方法(外标法)梯度洗脱实验及氨基酸衍生化实验(FDNB法)实验目的熟悉色谱仪器的组成及原理2色谱仪器的组成及原理IHPLC组成

脱气系统(在线与离线)氦气脱气真空脱气超声脱气流动相传输系统(色谱泵)一元二元三元四元多元评价指标:压力限制,流速范围及精度冲程大小等进样系统(手动与自动进样器)评价指标:精度重现性死体积速度可控性(温度及各种其他功能)色谱仪器的组成及原理IHPLC组成3柱温箱 功能:维持流动相与固定相的温度恒定 评价指标:温度范围升温或降温的速度温度 维持的精度死体积大小检测系统 紫外视差检测质谱检测电化学检测 荧光检测DAD检测蒸发光色散检测等数据采集系统 软件的可操作性,采集速率,文件存储能力色谱仪器的组成及原理II柱温箱色谱仪器的组成及原理II4色谱分离的原理色谱分离的基本原理是不同化合物在色谱柱上的差速迁移导致的色谱分离分离方式多种多样色谱分离的原理色谱分离的基本原理是不同化合物在色谱柱上的差速5min00.511.522.53mAU0204060801.939

分流对紫外检测的影响min00.511.522.53mAU020406086黄色 0.5mL/min白色 1.0mL/min红色 2.0mL/minmin0123456789mAU-20020406080100120140Area:2028High:1427.65

3.911.94Area:1021High:110Area:544High:85流速对保留时间及峰面积的影响黄色 0.5mL/minmin0123456789mA7有机相比例对出峰时间和峰面积的影响

有机相比例对出峰时间和峰面积的影响

8HPLC条件的优化洗脱方式一般采取等梯度洗脱，这样分析速度快但有时也会采取梯度洗脱如分析多肽类化合物一般采取梯度洗脱，此时的信号会比等梯度洗脱时强很多，而且可以加大进样量。是提高灵敏度的一种措施，但是分析时间较长。需要有平衡的时间。HPLC条件的优化洗脱方式90500100015002000250030003500400045000123456time(min)peakheight梯度洗脱05001000150020002500300035004010HPLC条件的优化柱温对色谱行为的影响依那普利HPLC条件的优化柱温对色谱行为的影响11色谱柱色谱柱的规格填料颗粒粒径孔径厂商流动相组成洗脱方式柱温检测方式及具体条件流动相的组成对分离度的影响流速对色谱行为的影响柱温对色谱行为的影响溶剂对色谱的影响pH值离子强度缓冲液离子对等其他因素的影响色谱柱色谱柱的规格填料颗粒粒径孔径厂商12FDNB法测定氨基酸含量课件13FDNB法测定氨基酸含量课件14FDNB法测定氨基酸含量课件15定量分析的方法(外标法)2.63.0Time,min0%50%100%Rel.Int.(%)定量分析的方法(外标法)16定量分析的方法(内标法)2.63.0Time,min0%50%100%Rel.Int.(%)定量分析的方法(内标法)17

氨基酸衍生化实验(FDNB法)FDNB法的原理2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB）也叫做Sanger试剂。DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitrophenylaminoacid,DNP氨基酸）

氨基酸衍生化实验(FDNB法)FDNB法的原理181仪器：四元泵waters；柱温箱无；紫外可变双波长检测器2487;手动进样器;Millennia工作站色谱柱：ZorbaxExclipseXDB1504.6mm5mm一仪器与试剂1仪器：四元泵waters；一仪器与试剂19仪器与试剂保护柱： XDBC184.6x12.5mm GuardfittingKit化学试剂：氨基酸标样250，500，1000pmol/mL

1%FDBN（大连化物所可购） 磷酸二氢钾，碳酸氢钠，氢氧化钾， 乙腈，重蒸水辅助品： 2mL棕色小瓶，pH试纸，恒温水浴箱， 溶剂过滤器，样品过滤器， 可变量程微量移液器(10-00mL)。仪器与试剂保护柱： XDBC184.6x12.5mm20二实验步骤

衍生化：于2mL棕色瓶里精确加入30mL不同浓度的AA标样，30mL0.5NNaHCO3(pH=9)和1%FDBN10mL，于60C暗处加热60min。放置室温，加1mL（0.01N,pH=7.0）KH2PO4，摇匀，待HPLC分析。HPLC条件：流动相A：0.04NKH2PO4pH=7.2

流动相B：乙腈/水=55/45(v/v)梯度：B：14%4min---10min/40%----20min/80%---21min,100%,流速：1mL/min检测波长：360nm；柱温：40C；进样量：10mL二实验步骤衍生化：21二实验步骤根据得到的数据，求算未知样品浓度完成实验报告思考题为什么要保持反应溶液的碱性环境为什么要对氨基酸进行衍生化处理保护柱的作用是什么反相色谱分离的原理是什么实验中有哪些注意事项二实验步骤根据得到的数据，求算未知样品浓度22min0510152025mAU020406080ASPGLUDNP-OHSERHISARGGLYTHRPROALAVALMETCYS-SIIELEUPHELYSTYR实验结果

min0510152025mAU020406080A23FDNB法测定氨基酸含量主讲教师: 王英武电话: 5619955电子信箱: wyw@FDNB法测定氨基酸含量主讲教师: 王英武实验目的熟悉色谱仪器的组成及原理了解色谱分离的原理.重点介绍反相色谱柱(以C18为例)定量分析的方法(外标法)梯度洗脱实验及氨基酸衍生化实验(FDNB法)实验目的熟悉色谱仪器的组成及原理25色谱仪器的组成及原理IHPLC组成

脱气系统(在线与离线)氦气脱气真空脱气超声脱气流动相传输系统(色谱泵)一元二元三元四元多元评价指标:压力限制,流速范围及精度冲程大小等进样系统(手动与自动进样器)评价指标:精度重现性死体积速度可控性(温度及各种其他功能)色谱仪器的组成及原理IHPLC组成26柱温箱 功能:维持流动相与固定相的温度恒定 评价指标:温度范围升温或降温的速度温度 维持的精度死体积大小检测系统 紫外视差检测质谱检测电化学检测 荧光检测DAD检测蒸发光色散检测等数据采集系统 软件的可操作性,采集速率,文件存储能力色谱仪器的组成及原理II柱温箱色谱仪器的组成及原理II27色谱分离的原理色谱分离的基本原理是不同化合物在色谱柱上的差速迁移导致的色谱分离分离方式多种多样色谱分离的原理色谱分离的基本原理是不同化合物在色谱柱上的差速28min00.511.522.53mAU0204060801.939

分流对紫外检测的影响min00.511.522.53mAU0204060829黄色 0.5mL/min白色 1.0mL/min红色 2.0mL/minmin0123456789mAU-20020406080100120140Area:2028High:1427.65

3.911.94Area:1021High:110Area:544High:85流速对保留时间及峰面积的影响黄色 0.5mL/minmin0123456789mA30有机相比例对出峰时间和峰面积的影响

有机相比例对出峰时间和峰面积的影响

31HPLC条件的优化洗脱方式一般采取等梯度洗脱，这样分析速度快但有时也会采取梯度洗脱如分析多肽类化合物一般采取梯度洗脱，此时的信号会比等梯度洗脱时强很多，而且可以加大进样量。是提高灵敏度的一种措施，但是分析时间较长。需要有平衡的时间。HPLC条件的优化洗脱方式320500100015002000250030003500400045000123456time(min)peakheight梯度洗脱05001000150020002500300035004033HPLC条件的优化柱温对色谱行为的影响依那普利HPLC条件的优化柱温对色谱行为的影响34色谱柱色谱柱的规格填料颗粒粒径孔径厂商流动相组成洗脱方式柱温检测方式及具体条件流动相的组成对分离度的影响流速对色谱行为的影响柱温对色谱行为的影响溶剂对色谱的影响pH值离子强度缓冲液离子对等其他因素的影响色谱柱色谱柱的规格填料颗粒粒径孔径厂商35FDNB法测定氨基酸含量课件36FDNB法测定氨基酸含量课件37FDNB法测定氨基酸含量课件38定量分析的方法(外标法)2.63.0Time,min0%50%100%Rel.Int.(%)定量分析的方法(外标法)39定量分析的方法(内标法)2.63.0Time,min0%50%100%Rel.Int.(%)定量分析的方法(内标法)40

氨基酸衍生化实验(FDNB法)FDNB法的原理2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB）也叫做Sanger试剂。DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitrophenylaminoacid,DNP氨基酸）

氨基酸衍生化实验(FDNB法)FDNB法的原理411仪器：四元泵waters；柱温箱无；紫外可变双波长检测器2487;手动进样器;Millennia工作站色谱柱：ZorbaxExclipseXDB1504.6mm5mm一仪器与试剂1仪器：四元泵waters；一仪器与试剂42仪器与试剂保护柱： XDBC184.6x12.5mm GuardfittingKit化学试剂：氨基酸标样250，500，1000pmol/mL

1%FDBN（大连化物所可购） 磷酸二氢钾，碳酸氢钠，氢氧化钾， 乙腈，重蒸水辅助品： 2mL棕色小瓶，pH试纸，恒温水浴箱， 溶剂过滤器，样品过滤器， 可变量程微量移液器(10-00mL)。仪器与试剂保护柱： XDBC184.6x12.5mm43二实验步骤

衍生化：于2mL棕色瓶里精确加入30mL不同浓度的AA标样，30mL0