医学细胞生物学实验指导

显微镜下可见鸡血细胞为椭圆形，有核。白细胞数量少，为圆形。3.观察平滑肌分离装片低倍镜下观察平滑肌分离装片，可见染成紫红色呈纺锤形点肌细胞，细胞核为椭圆形，位于细胞的中央，着色很深，在细胞质中有淡红色的肌原纤维。低倍镜观察油镜下作业1.思考题为什么使用高倍镜或油镜必须从低倍镜到高倍镜或从低倍镜到油镜的顺序进行?如果高倍镜下找不到物象，应从哪些方面找原因，如何解决?2.绘图截取40×或者油镜100×下鸡红细胞、神经细胞、平滑肌细胞的图。

实验三细胞器的光镜切片观察一、实验目的观察细胞器中光学显微镜下的基本形态结构二、实验内容两种细胞器的光镜切片高尔基复合体的观察脊神经节以硝酸钴固定，再经硝酸银染液浸染制成永久制片。高尔基复合体能与硝酸银作用，并具有还原能力，使硝酸银呈现棕黑色沉淀颜色反应，因而显示高尔基复合体的形态和位置。方法：低倍镜观察：寻找圆形或椭圆形的被染成黄色或淡黄色的细胞；转换高倍镜：中央透亮区为核所在位置，核周围棕褐色扭曲呈线状、颗粒状结构即为高尔基复合体。线粒体的观察原理肝、肾组织细胞富含线粒体，以重铬酸钾固定，再经铁苏木精染色，制成永久制片。线粒体有双层膜结构，蛋白、磷脂含量很高，有大量羧基和磷酸基等阴离子基团，含阳离子的铁苏木精易与其结合，使线粒体显示兰色反应。方法低倍镜观察：可见许多被染成深兰色的细胞，选择颜色清晰，密集程度较低的区域；转换高倍镜：细胞核为1-2圆形的不着色的区域（有深兰色的核仁），核周围分布有许多深兰色颗粒或杆状小体，即线粒体。附：生物学实验绘图方法与要求绘图时生物学实验报告点一种重要形式，其基本要求如下：1.准备好3H铅笔、橡皮、刀、尺子及绘图纸，将绘图纸放在观察物的右边，纸下不要垫书或纸张。2.绘图时，特别注意观察物的形状、各部分点位置、比例和毗邻关系。3.图点位置、大小要适宜，图占报告纸左上方2/3点面积，并考虑注字点位置。4.观察清楚后，选择典型的细胞或者组织，左眼看显微镜，右眼配合左眼，先用铅笔在纸上轻轻描出轮廓，使形态正确，然后再用清晰的线条绘出，线条粗细要均匀不要重复。5.用圆点表示明暗和立体感，点的点大小要均匀，不能涂阴影。6.图绘好后，要在图点右侧注明各部分结构名称，引线要直而平行，长短适度，各引线不能交叉，各线右端上下对齐，注字要用正楷，不能潦草，要自左向右写。7.每一个图下面要注明图的点名称、放大倍数。8.绘图纸上所有注字（包括姓名、实验日期、题目等）均用铅笔书写，不能用其他笔写。作业.绘图截取40×或者油镜100×下高尔基体和线粒体

实验四动物细胞培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养。使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离了生物机体后的—些变化。细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等Ⅰ清洗与灭菌一、实验目的1.了解细胞原代培养、传代培养的基本操作方法；2.掌握细胞培养过程中的无菌操作技术；3.学习倒置显微镜的使用及培养细胞的观察。二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。三、实验材料、用品材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0.22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0.22μm，过滤器(直径25)。药品：70％或75％酒精，0.1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0.5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水[体积分数0.1％的焦炭酸二乙酯。仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。四、实验步骤(一)清洗1.新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。2.使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。(3)浸酸性洗液过夜。(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗10~15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。(5)包装(牛皮纸或一般纸)。(6)高压(15磅20min)或干热(17(7)贮存备用。3.胶塞的处理(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2％NaOH煮沸l0-20min。(2)自来水清洗10次。(3)再用1％稀盐酸浸泡30min。(4)自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。晾干，高压灭菌。旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。（二）消毒1.物理消毒法(1)紫外线消毒用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。(2)干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160℃，保温90~120min。用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5~8h。(3)湿热灭菌此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手动高压灭菌锅操作如下：①首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。②加热高压锅。将放气阀打开，放气5~10min，以排除锅内的冷空气。③待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅(121℃)30min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115℃)20min。调节火力大小保持该压力。④停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。(4)滤过除菌用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径90mm、100mm、142mm……等)，配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径20mm、25mm等)。滤膜孔径有0.60μm、0.45μm、0.35μm、0.22μm、0.10μm等，以0.22μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。①在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0.22μm。②用布包好，湿热灭菌后使用。2.化学消毒法常用的消毒液有如下几种：(1)70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。(2)0.1％新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0.1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。(3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。(4)0.5％过氧乙酸：是强效消毒剂，10min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。(5)乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1—3d。可将空气中漂浮的微生物杀死。(6)37％甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1—3d后方可达到消毒空气的目的。3.煮沸消毒急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15min后使用。五、注意事项1.清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10—15次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效果。2.干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。.3.高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。4.牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等)。5.滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。6.使用化学消毒法时，配制75％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。六、思考题1.哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。2.紫外线消毒的适用范围和目的是什么?II、原代细胞培养与观察一、实验目的1.了解细胞原代培养基本操作方法；2.掌握细胞培养过程中的无菌操作技术；3.学习倒置显微镜的使用及培养细胞的观察。二、实验原理动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将它分散成单个细胞后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。三、实验用品1、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。2、试剂磷酸盐缓冲液(PBS)、无钙、镁溶液、细胞消化液：0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTADMEM液3、材料乳鼠四、实验方法操作步骤方法一：胰酶消化法洗手，用酒精擦手。点燃酒精灯，将所需用品摆放整齐，方便自己操作。取一只乳鼠，浸入75%乙醇中2~3s，然后取出来，放在灭菌好的培养皿中。取材：取出无菌的手术器械，如果乳鼠还没有死亡，用镊子夹其头部处死乳鼠。用镊子提起腹部皮肤，用解剖剪充分剪开腹腔，将肝脏组织取下来，放入一个灭菌好的青霉素瓶中，用无菌吸管吸取3mlHanks液清洗2~3次，直至去掉血污为止。消化：将洗净的组织块移入干净的无菌的青霉素瓶中，将剪刀伸入瓶内反复剪切组织块，直至剪到0.5~1mm3大小的块状为止。加入2ml0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动，去掉胰酶溶液，重新加入3ml胰酶溶液，盖好盖子，放在37℃水浴中消化20~30min，注意每间隔5min振摇一次。视组织块变得疏松，颜色略变白时随即从水浴中取出，放入超净台内，用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞，加入1~2ml培养液终止胰酶消化，静止片刻，让未被消化完的组织自然沉降，然后用吸管将细胞悬液移入无菌青霉素瓶中，盖好盖子。离心：将青霉素瓶做好标记，平衡后以1000r/min离心8min。在超净台内弃上清，加入3ml培养液，吹打混匀后，取1滴去镜检，适当调整细胞密度。细胞培养：取1ml细胞悬液至一干净的培养皿中，再添加1~2ml培养液，盖上盖子后，轻轻摇匀，置37℃培养箱中培养。观察：每天对培养的细胞做常规检查，观察的主要内容是：污染与否、细胞生长状态和pH（培养液颜色变化）等情况。如发现培养液变为柠檬黄又显浑浊，表明可能被污染，细胞也就不易贴壁生长而逐渐死亡。如培养液颜色为橘红色，一般说明细胞生长状态良好。接种24h后，可见到许多细胞贴壁（由圆形悬浮状态的细胞延展成扁平状）。随着培养时间的延长，细胞生长繁殖数量增加，培养液会逐渐变为黄色，这时可进行传代培养。方法二：1~4步骤同胰酶消化法5.将洗净的组织块移入消毒的青霉素瓶中，用眼科剪刀剪切成0.5mm的小块，然后加入1~2滴培养液，轻轻吹打混匀。用吸管分次吸取组织浆块，放入培养瓶壁上散开，然后翻转培养瓶，使贴服组织面朝上，加入3~4ml培养液，加盖，做标记后，放置一段时间后，待组织小块略干燥能牢固贴于瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶（动作一定要轻，减少振动，防止组织块脱落），使组织块浸泡在培养液中静置培养。6.观察：同胰酶消化法。=3\*ROMANIII.传代细胞培养与观察一、实验目的了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。二、实验原理传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。三、实验用品1、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。2、试剂磷酸盐缓冲液(PBS)无钙、镁溶液细胞消化液：0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTADMEM液3、材料鸡胚细胞四、实验方法在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。1.营养液配制:EMEM液

90%犊牛血清

10%双抗(1万单位／m1)

加至约100单位／m17.4％NaHCO3

调pH至6.8~7.02.换液:在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液。3.消化与分装在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，轻轻摇动，将溶液倒出。重复上述动作。加入适量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml十o.5％胰蛋白酶液0.2ml）以盖满细胞为宜，置于室温，停留1—2min后，翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层是否出现缝隙(针孔大小的空隙)，如出现缝隙，即可倒去消化液；如末出现缝隙，则可将瓶翻回，继续进行消化，直到出现缝隙为让。此时，可倒去消化液，加入新配制的营养液20m1。4.培养分装好的细胞瓶上，做好标志，注明细胞代号、日期。置于培养架上，轻摇使细胞均匀分布，以免堆积成团。然后置于37℃5.观察(1)观察体外培养细胞的几个问题；细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下：A.首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度B.观察培养姬颜色变化及细胞是否生长。C.如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时可参照(2)的描述进行。D.观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。(2)细胞的生长阶段及其形态特征传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。—般中层培养的细胞，从培养开始，经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将其分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：A.游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数小时。B.吸附期(贴壁)：由于细胞的附壁持性，细胞悬液静置培养一段时间(约7—8h)后，便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。C.繁殖期：培养l2h以后直到72h，细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层)的过程。此期细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。以“十”的多少表示如下：十：细胞占瓶壁有效面积(也就是细胞能生长的瓶壁面积)的25％以内有新生细胞。一般要观察3—5个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。十十：细胞占瓶壁有效面积的25—75％以内具新生细胞。十十十：细胞占瓶壁有效面积的75—95％具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。十十十十：细胞占瓶壁95％以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。从十十一十十十十为细胞的对数增长期(或称为指数增长期)。D.维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。E.衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙，细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。五、思考题1.简述细胞原代与传代培养的操作程序及注意事项。3.细胞培养获得成功的关键要素是什么?3.简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。

实验五ABO血型鉴定与交叉配血一、实验原理与目的血型就是红细胞膜上特异抗原的类型。在ABO血型系统中，红细胞膜上抗原分A和B两种抗原，而血清抗体分抗A和抗B两种抗体。A抗原加抗A抗体或B抗原加抗B抗体，则产生凝集现象。血型鉴定是将受试者的红细胞加入标准A型血清（含有抗B抗体）与标准B型血清（含有抗A抗体）中，观察有无凝集现象，从而测知受试者红细胞膜上有无A或/和B抗原。在ABO血型系统，根据红细胞膜上是否含A、B抗原而分为A、B、AB、O四型。（见下表）ABO血型中的抗原和抗体血型红细胞膜上所含的抗原血清中所含的抗体O无A和B抗A和抗BAA抗BBB抗AABA和B无抗A和抗B

交叉配血是将受血者的红细胞与血清分别同供血者的血清与红细胞混合，观察有无凝集现象。输血时，一般主要考虑供血者的红细胞不要被受血者的血清所凝集；其次才考虑受血者的红细胞不被供血者的血清所凝集。前者叫交叉配血试验的主侧（也叫直接配血），后者叫交叉配血的次侧（也叫间接配血）。只有主侧和次侧均无凝集，称为“配血相合”，才能进行输血；如果主侧凝集，称为“配血不合”或“配血禁忌”，绝对不能输血；如果主侧不凝集，而次侧凝集，可以认为“基本相合”，但输血要特别谨慎，不宜过快过多，密切注视有无输血反应。本实验的目的是学习ABO血型鉴定的原理、方法以及交叉配血方法。二、实验对象学生三、实验器材和药品1．仪器显微镜，离心机。2．器械采血针，消毒注射器，双凹玻片，小试管，竹签，棉球，腊笔。3．药品标准A血清，标准B血清，生理盐水，75％酒精，碘酒。四、实验步骤和观察指标交叉配血示意图（一）ABO血型鉴定1.玻片法（1）取双凹玻片一块，用干净纱布轻拭使之洁净，在玻片两端用腊笔标明A及B，并分别各滴入A及B标准血清一滴。（2）细胞悬液制备从指尖或耳垂取血一滴，加入含1ml生理盐水的小试管内，混匀，即得约5％红细胞悬液。采血时应注意先用75％酒精消毒指尖或耳垂。（3）用滴管吸取红细胞悬液，分别各滴一滴于玻片两端的血清上，注意勿使滴管与血清相接触。（4）竹签两头分别混合，搅匀。（5）10～30min后观察结果。如有凝集反应可见到呈红色点状或小片状凝集块浮起。先用肉眼看有无凝集现象，肉眼不易分辨时，则在低倍显微镜下观察，如有凝集反应，可见红细胞聚集成团。（6）判断血型根据被试者红细胞是否被A，B型标准血清所凝集，判断其血型。玻片法鉴定ABO血型2.试管法（1）取试管2只，分别标明A，B字样，分别加入相应标准血清2滴，各管加入受试者的红细胞悬液1~2滴摇匀。（2）将上述二试管用1000转/分离心1min。（3）取出小试管，轻弹底部，如沉淀物呈团块状浮起为凝集，呈散在烟雾状上浮进而恢复原混悬状为无凝集。（二）交叉配血1.玻片法（1）用碘酒，75%酒精棉球消毒皮肤后，用消毒干燥注射器抽取受血者及供血者静脉血各2ml，各用一滴制备红细胞悬液，分别标明供血者与受血者。余下血分别注入干净小试管，也标明供血者与受血者，待其凝固后析出血清备用。（2）左两凹玻片左侧标上“主”（即主侧）；右侧标上“次”（即次侧）。主侧滴入供血者红细胞悬液一滴和受血者血清一滴；次则滴入受血者红细胞悬液一滴和供血者血清一滴。分别用竹签混匀。（3）15～30min后，观察结果。如两侧均无凝集现象，可多量输血；如主侧无凝集而次侧有凝集只可考虑少量输血；如主侧凝集则不能输血。2.试管法取二试管，分别注明“主”、“次”字样，管内所加内容物同玻片法，混匀后1000rpm离心1min，取出观察结果。注意事项1.所用双凹玻片的试管实验前必须清洗干净，以免出现假凝集现象。2.A及B标准血清绝对不能相混，所用滴管上贴橡皮膏标明A及B、红细胞悬液滴管头不能接触标准血清液面，竹签一端去混匀一侧就不能去接触另一侧。思考题1.在无标准血清情况下已如某人为A或B型，能否用其血去检查未知血型？如何作？2.交叉配血时为何主侧不凝集而次侧凝集时，可以少量输血？还需注意些什么？

实验六血涂片的制作与读片一．涂片（一）血液涂片的制作（1）需载玻片2张，分别称为玻片1和玻片2（推片）。（2）用玻片1一端接约3mm直径的血滴，将此玻片1保持水平。（3）取另一边缘平整的载玻片2（推片），将其前端放在血滴前，与片1保持30°角并稍向后移与血滴接触，即见血液沿片2（推片）下缘散开，使血液展开并充满整个推片的宽度。（4）立刻将推片与载玻片呈30°角，边轻压推片边将血液按下图的箭头方向推动涂抹，至血液铺完血膜为止。（5）挥动片1使血膜吹干，用蜡笔将血膜边缘圈画备染色。（6）每只动物涂片一张。（7）一张良好的血片，要求厚薄适宜，头、体、尾分明。（8）置30min～1h后较利于观察红细胞的形态。注意事项：如标本本身太短，可观察的部分会受局限，故以在离开载玻片另一端2cm地方涂抹为宜。载玻片、推片的角度越小、血液越薄；涂抹速度越慢、也越薄。在涂抹贫血病人的血液时，将推片稍竖起（不是30°而是35°～40°左右），以较快的速度推比较好，而对红细胞增高的病人则相反。如用力过猛白细胞容易破损。二．染色血液涂片的染色（1）将待染涂片平放于染色架上。（2）用滴管将染液滴于涂片上，覆盖整张涂片，放置1～3分钟。（3）加入等量的磷酸缓冲液或蒸馏水，与染液混匀，可以用滴管从一端吸入，另一端放出，混匀为止，或用嘴来回轻轻吹之，使之混匀，室温下染色5～10分钟（白细胞数多或骨髓标本时间应长一些，如20～30min）。（4）染色结束时，先用蒸馏水或缓冲液洗将涂片上的染液直接冲掉。（5）再将片子用自来水温和冲洗，至血液膜呈淡红色。（6）甩干或晾干玻片。（7）封片。血涂片的观察方法1．肉眼观察在观察染色标本时，首先用肉眼对颜色进行观察。如果是正常的末梢血液则呈粉红色，白血病时白细胞高度增加或骨髓瘤的高γ球蛋白血症等情况下，血涂片会带有蓝色，此时应意识到为异常标本。2．高倍镜下观察首先观察血涂片制备和染色是否良好、细胞分布是否均匀，同时可估计白细胞数量增减情况。最后对血涂片的体尾交界的区域进行观察，选择细胞分布均匀不重叠、标本不太厚容易观察的地方进行油镜观察。3．油镜下观察边移动视野边观察下列各项：1）染色是否良好：如果血涂片染色确实不好，应重新染色。2）观察红细胞形态：（1）有无人为造成的变形，此外有时载玻片上的碱性物质的溶出（玻璃效应）会导致红细胞呈严重的棘形红细胞。如固定不良（固定液中含有水分时）会导致呈面包圈形红细胞，从而无法观察红细胞的形态。（2）大小如何，是大细胞还是小细胞，有无红细胞大小不一。（3）形态如何，注意有无畸形红细胞、球形红细胞、椭圆新红细胞、靶形红细胞、口形红细胞（唇形红细胞）、中心淡染色红细胞、棘形红细胞、胆状红细胞、皱缩红细胞、泪滴状红细胞、破碎红细胞及镰状红细胞等。（4）是否有染色性的变化，有无嗜多色性红细胞，中心淡染红细胞。（5）红细胞内有无异常。观察是否有嗜碱性点彩、豪-乔小体、卡波环状体红细胞、幼红细胞、帕彭海姆氏小体和疟原虫的出现。（6）有关大小不一，畸形和嗜多色性，可分为轻度±、中度++、高度三个级别。3）观察白细胞形态（1）与红细胞比较，判断白细胞数是否正常，是否增加或减少。红细胞数/白细胞数约为500：1。（2）有关白细胞的种类，要观察大量的白细胞后才可判断是否异常，然后计算白细胞的百分率。在日常检查中，一般只计算100个，但是发现异常或白细胞有增加时，尽量增加到200个。计算的白细胞数越多，白细胞百分率的可信度越高。4）观察血小板形态（1）通过与红细胞的比较，判断血小板数量是否正常，是增加或减少。正常情况下每15～20个红细胞中有1个血小板。（2）注意大小的变化。（3）观察未加抗凝剂而直接从毛细血管采集的标本时，要注意血小板的凝集性（观察由若干血小板凝集的现象。如果呈散在状，则怀疑为血小板无力症）。（4）观察有无寄生虫，当白细胞减低或白细胞分类中单核细胞增多时，应注意观察红细胞内有无疟原虫。各种典型血细胞的照片（油镜下）1．血小板2．红细胞3．正常白细胞实验结果1．数码拍照（1）依次在低倍（×10）、高倍（×40）、油镜（×100）下观察红细胞、白细胞以及血小板正常与异常的变化。（2）用数码相机拍摄不同倍数下的细胞照片。（3）输入电脑，比较分析各组间的差异。红细胞呈桔红色，白细胞核紫色，嗜酸颗粒细胞鲜红色，嗜碱颗粒细胞蓝紫色，中性颗粒细胞紫或紫红色，淋巴细胞及单核细胞浆蓝灰色，血小板紫色。2．注意事项：1．染色涂片水冲洗后，应在空气中自然干燥或风干，不可用火烤干。2．染液量要充足，勿使染液蒸发干燥。3．细胞染色过浅或过深，待标本干燥后，立即用瑞氏染液或甲醇重新染色数秒或数分钟。4．保存过久的细胞涂片，细胞染色会退色，可重新染色。5．新鲜涂片应立即染色。作业绘图：红细胞及各种白细胞。

实验七细胞有丝分裂标本的制备与形态观察一、实验目的通过标本制备和观察了解生物体细胞的无丝分裂、有丝分裂形态特征及生殖细胞的减数分裂过程。二、实验用品1、材料和标本洋葱根尖压片。2、器材和仪器显微镜、擦镜纸、解剖针、眼科镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、培养皿、冰箱。3、试剂70％乙醇、改良碱性品红染液。三、实验内容细胞分裂对生物的个体发育和生存，对种族绵延有着十分重要的意义，高等生物体内细胞的分裂方式有三种：无丝分裂、有丝分裂和减数分裂。一、动物细胞无丝分裂的观察一蛙血涂片(一)原理无丝分裂不仅是原核生物增殖的方式，而且雷马克(Remak)于1841年最早在鸡胚血细胞中也发现此现象，因为此过程没有出现纺锤丝和染色体的变化，故称无丝分裂(Ami—tosis)。其后无丝分裂又在各种动植物中陆续发现，尤其在分裂旺盛的细胞中更多见，但遗传物质平均分配否?及其分裂的机制尚不十分清楚。蛙红细胞体积较大、数多，而且有核，是观察无丝分裂的较好材料。(二)观察与结果在高倍镜下，可见到处于不同阶段分裂过程中的蛙红细胞，核仁先行分裂，向核的两端移动，细胞核伸长呈杆状；进而，在核的中部从一面或两面向内凹陷，使核成肾形或哑铃形改变；最后，从细胞中部直接收缩成两个相似的子细胞；子细胞较成熟的红细胞小。二、细胞有丝分裂的观察一马蛔虫子宫切片、洋葱根尖压片(一)原理细胞有丝分裂(Mitosis)的现象是分别由弗勒明(Flemming，1882)在动物细胞和施特拉斯布格(Strasburger，1880)在植物细胞中发现。有丝分裂过程包括一系列复杂的核变化，染包体和纺锤体的出现，以及它们平均分配到每个子细胞的过程。马蛔虫受精卵细胞中只有6条染色体，而洋葱体细胞的染色体为16条，因为它们都具有染色体数目少的特点，所以便于观察和分析。(二)观察1．动物细胞有丝分裂的观察——马蛔虫子宫切片取马蛔虫的子宫切片标本，先在低倍镜下观察，可见马蛔虫子宫腔内有许多椭圆形的受精卵细胞，它们均处在不同的细胞时相。每个卵细胞都包在卵壳之中，卵壳与卵细胞之间的腔，叫卵壳腔。细胞膜的外面或卵壳的内面可见有极体附着。寻找和观察处于分裂间期和有丝分裂不同时期的细胞形态变化，并转换高倍镜仔细观察。马蛔虫受精卵的有丝分裂间期(Interphase)细胞质内有两个近圆形的细胞核，一为雌原核，另一为雄原核。两个原核形态相似不易分辨，核内染色质分布比较均匀，核膜、核仁清楚，细胞核附近可见中心粒存在。分裂期(Mitosis)前期(Prophase)雌、雄原核相互趋近,染色质逐渐浓缩变粗、核仁消失，最后核膜破裂、染色体相互混合，两个中心粒分别向细胞两极移动，纺锤体开始形成。中期(Metaphase)染色体聚集排列在细胞的中央形成赤道板，由于细胞切面不同，此期有侧面观和极面观的两种不同现象，侧面观染色体排列在细胞中央，两极各有一个中心体，中心体之间的纺锤丝与染色体着丝点相连；极面观由于染色体平排于赤道面上，六条染色体清晰可数，此时的染色体已纵裂为二，但尚未分离。洋葱根尖细胞有丝分裂后期(Anaphase)纺锤丝变短，纵裂后的染色体被分离为两组，分别移向细胞两极，细胞膜开始凹陷。末期(Telophase)移向两极的染色体恢复染色质状态，核膜、核仁重新出现，最后细胞膜横缢，两个子细胞形成。2．植物细胞有丝分裂的观察——洋葱根尖切片将洋葱根尖切片标本先在低倍镜下观察，寻找生长区，这部分的细胞分裂旺盛，大多处于分裂状态，细胞形状呈方形。换高倍镜仔细观察不同分裂时期的细胞形态特征．与动物细胞有丝分裂特征比较，找出植物细胞有丝分裂的特点和两者的区别。3.制备蚕豆根尖临时压片水解：取出根尖放在1NHCl中60℃水解8min，蒸馏水水洗3次。染色：把处理好的根尖放在载玻片上，切取乳白色的分生区，用镊子轻轻捣碎，滴上一滴改良苯酚品红染液，染色5～10min后，盖上盖玻片。压片：在盖玻片上面铺上吸水纸，固定好盖玻片，用拇指垂直压片，再用橡皮轻敲击，使材料压成均匀的薄层。镜检观察有丝分裂的各期细胞。实验报告绘图：细胞间期及分裂期图片

实验八蝗虫精巢减数分裂压片标本的制备与观察一、实验目的通过标本制备和观察了解生殖细胞的减数分裂过程。二、实验用品1、材料和标本蝗虫精巢。2、器材和仪器显微镜、擦镜纸、解剖针、眼科镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、培养皿、冰箱。三、实验试剂70％乙醇、改良碱性品红染液。四、实验内容(一)原理减数分裂(Meiosis)是配子发生过程中的一种特殊有丝分裂，即染色体复制一次，而细胞连续分裂两次，结果使染色体数日减半的过程。减数分裂过程中体现了遗传三定律，所以说减数分裂在稳定种的遗传性状和繁殖中均起着重要作用。蝗虫精巢取材方便，标本制备方法简单，染色体数日较少，例如，蝗虫初级精母细胞染色体数2n=22+X，经过减数分裂形成四个精细胞，每个精细胞的染色体数为n=ll+X或n=11(注：蝗虫的性别决定与人类不同，雌性有两条X染色体、雄性为XO，即只有一条X染色体，没有Y染色体)，一般多采用它来研究观察减数分裂染色体形态变化。(二)蝗虫精巢压片标本的制备l．采集采集到各期分裂相的标本是实验成功的关键，解决这一关键要把握两点(1)时间：湖北地区采集，一般在7月15至25日为宜；(2)虫体特征：雄虫翘膀长到刚好盖住腹部一半时，正好是雄虫精子发生的峰季，采集最适。在公园、田埂、河边、路旁的草丛中均可采到。2．取材将采到的雄虫，用大头针固定在木板或纸盒上，沿腹部背中线剪开体壁，见消化管背侧的浅黄色结构即是精巢，用镊子分离出来。3．固定把取出的精巢立即放入Carnoy固定液中，固定1小时，在期间用大头针小心分离精细管，加速固定，促进脂肪溶解。固定后移入70％乙醇中存放于4℃4．染色取固定好的精细管2～3条，置于干净载玻片中央，用45％醋酸处理5分钟，用吸水纸吸干后，加1～2滴醋酸洋红染色15分钟。5．压片在染色材料上盖上盖玻片，再在盖玻片上放一块吸水纸，用大拇指垂直在盖玻片上适力下压(压片时不要滑动盖片)使精细管破裂细胞平展开，吸去溢出的染液，即可观察。(三)蝗虫精子发生过程减数分裂的镜下观察(参照照片)蝗虫精巢是由多条圆柱形的精细管组成，每条精细管由于生殖细胞发育阶段的差别可分成若干区，良好压片可见到从游离的顶端起始依次为精原细胞、精母细胞、精细胞及精子等各发育阶段的区域。1．精原细胞(Spermatogonia)位于精细管的游离端，胞体较小，由有丝分裂来增殖，其染色体较粗短、染色较浓。2．减数分裂I(MeioticdivisionI)减数分裂Il是从初级精母细胞到次级精母细胞的一次分裂。(1)前期I(ProphaseI)在减数分裂中，以前期I最有特征性、核的变化复杂，依染色体变化，又可分为下列各期：细线期(Leptotenestage)染色体呈细长的丝，称为染色线。弯曲绕成一团，排列无规则，染色线上有大小不一的染色粒，形似念珠，核仁清楚。偶线期（zygotenestage）同源染色体开始配对，同时出现极化现象，各以一端聚集于细胞核的一侧，另一端则散开，形成花束状。粗线期（Pachytenestage）每对同源染色体联合完成，缩短成较粗的线状，称为双价染色体，因其由四条染单体组成，又叫四分体。双线期(Diplotenestage)染色体缩的更短些，同源染色体开始有彼此分开的趋势，但因两者相互绞缠，有多点交叉，所以这时的染色体呈现麻花状。终变期(Diakinesis)染色体更为粗短，形成Y、V、O等形状，终变期末核膜、核仁消失。(2)中期I(MetaphaseI)核膜和核仁消失，纺锤体形成，双价染色体排列于赤道面，着丝点与纺锤丝相连。这时的染色体组居细胞中央，侧面观呈板状，极面观呈空心花状。(3)后期I(AnaphaseI)由于纺锤丝的解聚变短，同源的两条染色体彼此分开，分别向两极移动。但每条染色体的着丝粒尚未分裂，故两条姐妹染色单体仍连在一起同去一极。(4)末期I(TelophaseI>移动到两极的染色体，呈聚合状态，并解旋，同时核膜形成，胞质也均分为二，即形成两个次级精母细胞，这时每个新核所含染色体的数目只是原来的一半。到此减数分裂I结束。3．减数分裂Ⅱ(MeioticdivisisonⅡ)减数分裂Ⅱ类似一般的有丝分裂，但从细胞形态上看，可见胞体明显变小，染色体数目少。(1)前期Ⅱ(ProphaseⅡ)末期I的细胞进入前期Ⅱ状态，每条染色体的两个单体显示分开的趋势，染色体象花瓣状排列，使前期Ⅱ的细胞呈实心花状。(2)中期Ⅱ(MetaphaseⅡ)纺锤体再次出现，染色体排列于赤道面。(3)后期Ⅱ(AnaphaseⅡ)着丝粒纵裂，每条染色体的两条单体彼此分离，各成一子染色体，分别移向两极。(4)末期Ⅱ(TelophaseⅡ)移到两极的染色体分别组成新核，新细胞的核具单倍数(n)的染色体组，胞质再次分裂，这样，通过减数分裂每个初级精母细胞就形成了四个精细胞。4．精子形成在两次精母细胞分裂过程中，各种细胞器，如，线粒体、高尔基体等也大致平均地分到四个精细胞中，精细胞经一系列的分化成熟为精子。镜下精子头部呈梭形，由细胞核及顶体共同组成，尾部细长呈线状。实验报告小结有丝分裂与减数分裂过程的异同点。绘图：减数分裂I中前期I的各个时期。

实验九人外周血染色体制备一、实验原理

人外周血小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。如在培养液中加入植物血凝素（PHA），这种小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，低渗和固定，即可得到大量的有丝分裂细胞。人体的1ml外周血内一般含有约1×106～3×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。

二、实验用品和试剂

1．5ml注射器（7号针尖），培养瓶、刻度吸管，需15磅灭菌20分钟。离心管、吸管、量筒、载玻片，经洗液按常规清洗、烘干备用。

2．超净工作台，恒温培养箱，天平，离心机、显微镜等。

3．试剂：

（1）RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液，并加入NaHCO32.0克/1000ml以缓冲pH。完全溶解后经0.22μm灭菌滤膜抽滤除菌。

（2）肝素钠（肝素）：称取0.2g溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2%，15磅20分钟灭菌。

（3）秋水仙碱（秋水仙素〕，生理盐水配制成10μg/ml浓度，15磅20分钟灭菌，分装，置－20℃。

（4）低渗液：0.35％KCl。

（5）固定液（Carnoy固定液）甲醇∶冰乙酸（3∶l），临时配制。

（6）Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸缓冲液，临时配制。

（7）磷酸缓冲液：1/15MNa2HPO4、1/15MKH2PO4等体积混和。

（8）5%NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。

三、实验操作步骤

（一）细胞培养

1．培养基的配制：

在超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例：

RPMI-1640

84ml

小牛血清

15ml

PHA

3支

肝素钠

1ml

双抗

终浓度为100单位/ml

以5%NaHCO3（无菌）或1mol/LHCl调pH至7.2－7.4。

用刻度吸管将培养液分装入培养瓶（10ml/瓶），4℃备用。

2．采血：酒精消毒皮肤，肘静脉采血0.3—0.5ml，立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向10ml培养基中注入30—40滴全血，轻摇匀后置37℃恒温箱培养。

3．培养：时间为68~72小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。

4．秋水仙素处理：终止培养前2~4小时，在培养液中加入秋水仙碱（用1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.08μg/ml）。

以上步骤均需无菌操作

（二）染色体制备

1．收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8~10分钟，弃上清液。

2．低渗处理：向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml，用滴管混匀，置37℃恒温水浴中低渗15~25分钟。

3．预固定：低渗后加入0.5ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心8~10分钟。

4．一固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。1000rpm离心，弃上清液。

5．二固定、三固定：同一固定。

6．制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。

7．滴片：吸取细胞悬液自10~20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，气干。

8．染色：1:10Giemsa染色5~10分钟，细水洗去多余染液，气干。

9．镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。

四、注意事项

l．培养温度应严格控制在37±0.5℃，培养液最适合pH为7.2~7.4。

2．秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。

3．低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。

4．离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。

5．固定液应在使用前临时配制。

6．载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。

五、问题思考：

1.为什么要在培养基中加入PHA?2.秋水仙素的作用是什么?3.绘制人染色体中期图。

实验十正常人非显带染色体的核型分析一、目的要求

1.熟悉正常人类染色体的数目及形态特征。

2.掌握非显带染色体的核型分析方法。二、实验材料

正常人外周血淋巴细胞染色体制片显微镜三、实验原理

人类非显带染色体核型分析是染色体研究中的基本方法。它