基因诊断和基因治疗3

基因诊断和基因治疗南通大学医学院生化教研室沈勤概念：

基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定DNA序列。基因的改变，会导致各种表型的改变，进而引起疾病的发生。将基因或其组成部分发生异常的疾病统称为基因病。基因病分为三大类：一、单基因病：由单个基因突变引起的一类疾病。如：血友病、地中海贫血等。二、多基因病：由多个基因突变综合作用引起的疾病。如：恶性肿瘤、高血压、动脉硬化、糖尿病、先天畸形等、三、获得性基因病：指外源基因（DNA）侵入，在机体产生疾病，一旦将其清除便可痊愈。如：艾滋病及各种微生物感染病。第一节基因诊断（DNAdiagnosis）一、基因诊断的概念和基本概况临床诊断生化学诊断免疫学诊断临床疾病诊断四种方式：以疾病表型改变为依据。（细胞形态结构变化、代谢产物异常、特定蛋白分子识别差异等）基因诊断对患者基因直接分析基因诊断定义（概念）：

基因诊断是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测患者体内基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断或辅助诊断。基因诊断是在DNA/RNA水平检测分析基因的存在、结构变异和表达状态，与传统诊断方法比较有其特点：基因诊断的特点：1、病因诊断：直接瞄准病理基因，不仅对表型出现的疾病作出诊断，还可能发现潜在的致病因素，如:确定有遗传家族史的人携带致病基因。2、特异性强、灵敏度高：选用特定基因序列作为探针，单拷贝基因采用高度扩增PCR技术。3、稳定性高4、诊断范围广，适应性强目的基因是否处于活化状态均可。样品可长期保存。可检测正在生长的病原体或潜在病原体。（与以疾病表型改变为依据的诊断技术相比）基因诊断的基本概况：伴随分子生物学理论技术的发展而建立和发展。DNA双螺旋遗传密码破译DNA重组癌基因与抑癌基因研究地中海贫血病基因治疗和逆转录病毒载体开发PCR、分子杂交等一系列技术发展二、基因诊断的对象1、病原生物的侵入病原体：病毒、支原体、细菌、寄生虫检查诊断方法：显微镜、免疫学方法、基因诊断等。尤其是当无抗体时，基因诊断成为唯一手段。2、先天遗传性疾病遗传性疾病:发病的原因为特定基因的突变。肿瘤的发生：发病机理尚不请。

初步认为是个别细胞基因突变而引起的细胞无限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突变引起的疾病二、基因诊断的对象（1）用核心顺序的串联重复序列组成探针进行杂交研究，可同时检出具有高度多态性位点。（2）用southern杂交得到DNA指纹图谱个体识别、亲子鉴定、法医物证4、其他二、基因诊断的对象遗传稳定，个体特异，因而用于法医和亲子鉴定。基因诊诊断的的基本本策略略：1、检检测已已知的的能产产生某某种特特定功功能蛋蛋白的的基因因这些基基因根根据其其特定定功能能已被被克隆隆，并并被定定位在在染色色体上上，基基因序序列亦亦被测测定，，致病病时的的基因因改变变亦较较清楚楚。如：已已被克克隆的的病毒毒、细细菌、、霉菌菌和寄寄生虫虫的基基因、、与致病病有关关的癌癌基因因、抗抗癌基基因、、地中海海贫血血、苯苯丙酮酮尿症症等遗遗传病病基因因。2、检检测与与某种种遗传传标志志连锁锁的致致病基基因遗传连连锁－－同同一染染色体体相邻邻的二二个或或二个个以上上的基基因或或限制制性酶酶切位位点，，由于于位置置十分分靠近近，在在遗传传时分分离几几率很很低，，常一一起遗遗传称称连锁。染色体体遗传传连锁锁图－－用用限制制性内内切酶酶酶切切位点点作遗遗传标志，，定位位与之之相连连锁的的正常常基因因与致致病基基因，，建立立相应应的遗遗传连连锁图图谱。。定位性性克隆隆－－根根据遗遗传连连锁图图进行行定位位性克克隆。。比较较正常常和异常常基因因的差差别，，可找找出导导致遗遗传病病的分分子缺缺陷。。定位性性克隆隆策略是是当前前基因因诊断断的重重要基基础。。3、检检测表表型克克隆基基因针对多多基因因病（（如：：重度度肥胖胖、哮哮喘、、高血血压、、癫痫痫、精精神病病、多多种自自身免免疫性性疾病病）。。表型克隆技技术－－是将有有关表型与与基因结构构结合，直直接分离该表型型的相关基基因，并对对疾病相关关的一组基因进行克隆，然后后用作多种种探针，来来诊断多基基因遗传病病。该策略既不不需预先知知道基因的的生化功能能或图谱定定位，也不不受基因数目及及其相互作作用方式的的影响。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和和异常基因因组寻找两者之之间的差异异序列2、基因组组错配筛选选技术：寻找两者的的全同序列列，分离、、鉴定与疾疾病相关的的基因，确确定导致疾疾病的分子子缺陷基因诊断的的基本步骤骤：1、获得待待检样品：：提取核酸酸（PCR提高灵灵敏度)2、制备和和标记核酸酸探针3、基因检检测分析三、基因诊诊断的常用用技术核酸分子杂杂交聚合酶链反反应（PCR）限制性片段段长度多态态性（RELP）扩增片段长长度多态性性（AFLP）等位基因特特异的寡核核苷酸（ASO）单链构象多多态性（SSCP））基因芯片1、核酸分分子杂交原理：利用核酸的的变性、复复性及碱基基互补的性性质，用已已知基因的的核酸序列列作探针，与变性后后的单链基基因组DNA/RNA杂交，，检测核酸酸样品中是是否存在与与探针互补补的同源核核酸序列，，进行DNA或RNA定性定定量分析。。基因检验的的两个必要要条件：1、必需的的特异探针针（标记记的的）2、、必必需需的的基基因因组组DNA核酸酸分分子子杂杂交交－－－－核核酸酸印印迹迹杂杂交交DNA印印迹迹杂杂交交（（Southernblot））RNA印印迹迹杂杂交交（（Nouthernblot））斑点点印印迹迹杂杂交交（（Dot-blot））原位位杂杂交交(situhybridization)核酸酸印印迹迹杂杂交交基基本本过过程程：：提取取DNA或或RNA→→酶酶切切→→凝凝胶胶电电泳泳→→胶胶变变性处处理理（（DNA））→→转转印印核核酸酸片片段段到到NC膜膜上上。。（RNA可可直直接接用用变性性胶胶电电泳泳，转转膜膜））1、、制制备备样样品品：：核酸酸印印迹迹杂杂交交基基本本过过程程：：（2））制制备备探探针针：：探针针：：一一段段能能和和待待检检测测核核酸酸分分子子按按碱碱基基互互补补配配对对原则则而而结结合合的的核核酸酸分分子子片片段段。。探针针需需要要标标记记可可直直接接检检测测的的元元素素或或分分子子。。如：：同同位位素素、、荧荧光光、、生生物物素素等等核酸酸印印迹迹杂杂交交基基本本过过程程：：核酸酸印印迹迹杂杂交交可可检检测测pg水水平平的的靶靶分分子子（4））检检测测：：方方法法依依标标记记的的探探针针而而不不同同*放放射射性性同同位位素素*生生物物素素*地地高高辛辛*荧荧光光素素（3））杂杂交交：：预预杂杂交交－－－－封封闭闭非非特特异异性性结结合合位位点点杂交交－－－－探探针针与与核核酸酸分分子子结结合合核酸酸印印迹迹杂杂交交基基本本过过程程：：2、、聚聚合合酶酶链链反反应应（（PCR)原理：以待扩增DNA为模模板，在互补模模板两端序序列的寡核苷酸引引物介导下，通通过耐高温DNA聚合酶酶催化下，按按半保留复复制机制延延模板链延延伸，快速速、特异地地扩增特定定的DNA。一种体外模模拟自然DNA复制制过程的核核酸扩增技技术。（无细胞分分子克隆技技术）。耐高温DNA聚合酶酶－－－Taq酶寡核苷酸引引物：设计引物和和确定退火火温度是PCR成功的关键键。PCR的基基本过程：：（循环程程序）变性（95℃）→退退火（55℃－65℃℃）→延伸（（72℃）3～5分40’’～1分100bp/1分源自水栖高高温菌，最最适反应温温度为72℃，且经经90℃以上上加温后仍仍可在温度度恢复后复复性。（呈2n扩增速度））PCR基本本过程和原原理特点：特异异性强灵敏度高样品可以是是：毛发、血痕痕单细胞、病原体、肿瘤残留物物、犯罪现场遗遗留物基因诊断中中常用的PCR技术术：（1）、DNAPCR：（2）、RT-PCR：以DNA为为模板，扩扩增特定核核苷酸序列列。用于检检测特定基因片段段的存在，，分析鉴定定基因突变变。以总RNA或mRNA为模板板，逆转录录为cDNA后扩增增。用于检测特定定基因表达达水平的主主要方法之之一。（3）、PCR-SSCP：：检测基因未未知突变的的常用技术术。简单、、快捷、灵灵敏。（4）、多多重PCR：指在一次PCR反应应中加入多多对引物，，同时扩增增DNA序列上不同同序列片段段的一种PCR技术术。用于一一些“超大大”基因中大片片段缺失分分析。（5）、原原位PCR：直接用组织织切片和细细胞进行PCR或RT-PCR，在组组织、细胞原位检检测单拷贝贝或低拷贝贝的特点基基因序列。。（6）、实实时定量PCR：：借助特异性性结合DNA的荧光光染料，实实时动态检检测PCR扩增的DNA量的变变化。其他重要的的PCR衍衍生技术反向PCR（IPCR）标记引物PCR（labelledprimersPCR））锚定PCR（anchoredPCR）差异展示PCR（DD-PCR）（见书“分子子生物学技术术”章节）3、限制性片片段长度多态态性（RFLP）检出方法：Southern印印迹概念：用同一限制性性内切酶完全全切割同一物物种的不同个个体的基因组组DNA，出出现分子质量量不同的同源源片段，这种种由限制性内内切酶酶切位位点变化导致致的DNA片片段差异，称称限制性片段段长度多态性性（RFLP）。人类基因组中中由中性突变导致个体间核核苷酸的差异称－－－DNA多态性性RFLP类型型：2、由于链内内发生较大片片段的缺失、、重复、插入入和重排导导致DNA顺顺序的变化，，因而酶切片片段改变－－－－序列多态性。1、单个碱基基的突变引起起酶切位点的的变化－－－点多态性致病基因附近近或内部一般般存在RFLP,可用于于连锁分析的基因诊诊断。（四）扩增片片段长度多态态性（AFLP）应用于基因突突变性质不明明的连锁分析析。AFLP－－－串联重复的的短片段的长长度多态性通通过PCR扩扩增,经限制制性内切酶酶酶切后电泳,产生显示扩扩增片段多态态性。AFLP原理理：首先利用可产产生粘性末端的限制性内切切酶酶切研究究对象的基因因组序列，产产生不同长度度的酶切片段段。然后，将将这些酶切片片段与含有与与其有共同粘粘性末段的人工接头连接接，形成模板。为达到选择性扩增的目的，，再在模板末末端添加具有有选择性核苷酸酸（1～3个个）的不同引引物，然后PCR扩增，结果果只有那些两两端序列与选选择性核苷酸酸配对的酶切切片段被扩增增。最后将被被扩增的片段段在高分辨率率的测序凝胶胶上电泳，这这样其多态性性即根据扩增增片段的长度度与数量的不不同而被分开开。PCR扩增产产物即等位片片段之间差别只有几个个bp。5、等位基因因特异的寡核核苷酸（ASO）方法：1、合成两种种探针：①已知突变变位点的核苷苷酸序列（M）②正常基因因碱基序列（（N）2、杂交实验验结果：M+N-受受检者者是突变基因因的纯合子M-N+受受检者者是不存在突突变基因M-N-受受检者者的缺陷基因因可能是一种种新的突变类类型M+N+受受检者是是突变基因的的杂合子原理：已知基因突变变部位和性质质，合成基因因特异的核苷苷酸探针（20bp），，标记后与受受检者DNA杂交诊断。。（可与PCR联用：：PCR-ASO）6、单链构象象多态性（SSCP）日本Orita等研究发发现，单链DNA片段呈呈复杂的空间折叠叠构象，，当有一一个碱基基发生改改变时，，会或多或少少地影响响其空间间构象，，使构象象发生改改变，空间构象象有差异异的单链链DNA分子在在聚丙烯烯酰胺凝胶中受受排阻大大小不同同.因此此，通过过非变性聚聚丙烯酰胺凝凝胶电泳泳(PAGE)，可以非常常敏锐锐地将构构象上有差差异的分分子分离离开.PCR-SSCPPCR-SSCP基本本过程①PCR扩增靶靶DNA②将特异异的PCR扩增增产物变变性后快快速复性性;③将单链链DNA进行行非变性性聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳;④通过放放射性自自显影、、银染或或溴化乙乙锭显色色分析析结果.若发现现单链DNA带带迁移率率与正常常对照的的相比发发生改变变，就可可以判定定该链构构象发生生改变，，进而推推断该DNA片片段中有有碱基突突变.7、基因因芯片将指大量量寡核苷苷酸分子子固定于于支持物物上，然然后与标标记的样样品进行行杂交，，通过检检测根据据杂交分分子和未未杂交分分子信号号的强弱弱进而判判断样品品中靶分分子的数数量。基本原理理：（生物集集成模片片、DNA阵列列、或寡寡核苷酸酸微芯片片）基因芯片片技术：：目的：检检测外源源性基因因的侵入入目标：1、微生生物2、病毒毒如如：HIV（致艾艾滋病AIDS）3、寄生生虫、4、不易易体外培培养的病病原体（（毒性大大肠杆菌菌、麻风风分枝杆菌）5、实验验室培养养的病原原体（克克立氏体体）四、基因因诊断的的临床床应用:1、在感感染性疾疾病检测测中应用用艾滋病与与HIV病毒艾滋病由由HIV通过接接触、血血液、血血制品及及母婴传传播感染染所致。。HIV特异地地侵犯辅辅助性T细胞（（CD4），引引起人体体细胞免免疫严重重缺陷，，导致顽顽固的机机会性感感染，恶恶性肿瘤瘤和神经经系统损损伤。HIV感感染后后，95%感染染者5个个月可检检出抗体体（也有有3-4年仍不不能检出出抗体））。有必必要进行行PCR技术检检测。艾滋病与与HIV病毒检测技术术：巢式-PCR、、Southern、、DNA序列分分析引物的设设计：应在保保守区（（基因：：pol,env,gag,tat)病毒特点点：HIV病病毒由两两条单链链RNA组成，，9.7k/RNA，主要基因因结构和和组成形形成与其其他逆转转录病毒毒相同，，但较之复杂，，故称复复杂反转转录病毒毒HIV属属反转录录病毒－－－－即即单链RNA反反转录成成双链DNA，，进入宿主主细胞染染色体。。非典型性性肺炎（（SARS）由一种新新型冠状状病毒（（SARS-CoV））引起，，多种途径传播播，传染染性强、、高致死死率的急急性疾病病。诊断依靠靠：流流行病学学、临床床表现、、放射诊诊断、血清学（（荧光免免疫、ELISA）PCR作作为一种种灵敏的的早期病病原学诊诊断必不不可少（关键是是引物的的合成））2、在遗遗传病检检测中的的应用产前诊断断检测妊娠娠8－12周的的绒毛DNA或或羊水细细胞PCR诊诊断一系系列遗传传疾病镰刀状细细胞贫血血的诊断断方法：－－RFLP诊断MstⅡ酶切识识别序列列：CCTNAGG切割正常常β链序列：：CCTGAGG不切割突突变序列列：CCTGTGG－ASO探探针诊断断3、在肿肿瘤检测测中的应应用原癌基因因生物正常常细胞基基因中编编码关键键性调控控蛋白的的癌基因抑癌基因因一类抑制制细胞增增殖的基基因，其其失活可可引起细细胞转化。。两类基因因协同调调控，使使细胞生生长处于于平衡状状态。癌基因激激活变化化及检测测：1、基因因扩增：：即染色色体某区区段基因因拷贝数数增加，，或癌基基因的扩增增。检测方法法：Southern杂杂交定定量量PCR2、基基因的的过量量表达达：包包括基基因扩扩增基基础上上的过过量表表达及及非DNA水平平的过过量表表达。。检测方方法：：Northern杂杂交RT-PCR3、点突变：：检测方方法为各种基基于PCR的的方法。抑癌基因的检检测：SouthernPCR大片段的缺失失、和点突变变*两个等位抑抑癌基因突变变才能引起肿肿瘤，需检出两个等位抑抑癌基因。方法：RFLP结合PCR，进行缺缺失检测点突变主要采采用PCR肿瘤标志物：：指特征性存在在于恶性肿瘤瘤或由恶性肿肿瘤细胞异常产生的的物质或宿主主对肿瘤反应应而产生的物质。（1）酶类肿肿瘤标志物（2）激素类类标志物（3）胚胎抗抗原（4）特殊蛋蛋白标志物（5）糖蛋白白类抗原（6）血中癌癌基因蛋白（7）唾液酸酸和唾液酸酰酰基转移酶（8）多胺免疫组化筛选选提高检出率率法医学鉴定针对人类DNA遗传差差异进行的个个体识别和亲亲子鉴定。常用技术:DNA指纹分分析（VNTR）短串联重复序序列（STR）遗传特征征分析PCR-扩增增片段长度多多态性（AmP-FLP)PCR-mtDNA技术术根据可变串联重复复序列（小卫星DNA）多态性性高度的个体特特异性DNA指纹（（图谱）分析析：⑴、选择核心心序列作探针针，选在核心心序列上无切切割位点的限制性性内切酶，酶酶解样品，Southernblot得到到DNA指纹图图谱。针对可变串联联重复序列（（VNTR））（VNTR是是判断个体的的遗传标志））⑵、针对VNTR侧翼保守区序列设计探针针，用PCR对该区扩增，，电泳得到个个体之间长度度不同的条带图谱。（VNTR片段段较长PCR不易扩增））。第二节基基因治疗（genetherapuy)概念：将外源正常基基因导入靶细细胞，以纠正正或补偿因缺缺陷和异常基基因引起的疾疾病，达到治治疗目的。导入的基因可可以与缺陷基基因对应、在在体内表达具具有特异功能能的同源基因因、也可以是是与缺陷基因因无关的治疗疗基因。概念的扩展：：凡是采用分子子生物学方法法原理，将某某种遗传物质质转移到患者细胞内内，使其在体体内发挥作用用，达到治疗疗目的的方法，都可可称为基因治治疗。基因治疗策略略:总原则：－－直接补替替缺陷基因－－抑制非正正常基因产物物表达－－间接调节节机体本身免免疫系统的抗抗病能力。－－利用外源源基因对病变变细胞造成特特异性杀伤1、基因矫正正－－将致病病基因的碱基基进行纠正，，而正常部分分予以保留。。2、基因置换换－－用正常常基因通过体体内基因同源源重组，原位位置换病变细细胞内的致病基基因，使细胞胞内的DNA完全恢复正正常3、基因增补补－－将目的的基因导入病病变细胞或其其它细胞，不不去除异常基因，而是通通过目的基因因的非定点整整合，使其表表达产物补偿缺陷陷基因的功能能或使原有功功能得以加强强。4、基因失活活－－利用反反义技术特异异封闭基因表表达，抑制有有害基因的表达。5、免疫调节节－－将抗体体、抗原或细细胞因子的基基因导入病人人体内，改变变病病人人免免疫疫状状态态，，达达到到预预防防和和治治疗疗的的目目的的。。基因因治治疗疗的的策策略略：：6、、调调节节性性基基因因治治疗疗：：导导入入编编码码调调控控蛋蛋白白的的基基因因，，治治疗疗基因因表表答答异异常常的的疾疾病病7、、化化疗疗保保护护性性基基因因治治疗疗：：导导入入单单相相或或多多相相细细胞胞毒毒性性药药物的的抗抗性性基基因因，，使使正正常常细细胞胞耐耐受受化化疗疗药药物物的的能能力力大大大提提高高。。8、、特特异异性性细细胞胞杀杀伤伤性性基基因因治治疗疗：：利利用用DNA重重组组技技术术构构建建特异异性性杀杀伤伤靶靶细细胞胞为为目目标标的的““奇奇异异弹弹头头””，，““弹弹头头””部部分分是是分子重重组的的各种种生物物细胞胞毒素素，它它们以以酶催催化方方式发发挥抑制蛋蛋白合合成作作用，，造成成细胞胞杀伤伤。9、生生殖细细胞基基因治治疗：：生殖殖细胞胞或胚胚胎干干细胞胞补偿偿性治治疗基因治治疗基基本程程序;方法：：1、体体外法法（exvivo):2、体体内法法(invivo):将受体体细胞胞在体体外培培养，，转入入外源源基因因，经经适当当选择择系统统，将将重组组的受受体细细胞胞回输输患者者体内内，以以改善善症状状。（（普遍遍采用用）直接将将外源源基因因导入入体内内有关关的组组织器器官,使其其进入入相应应的细细胞并并转录录、表表达而而发挥挥治疗疗作用用。基本程程序：：选择目目的基基因选择基基因载载体选择靶靶细胞胞基因转转移外源基基因表表达及及检测测回输体体内治疗基基因的的来源源：1、野野生型型基因因：单基基因缺缺陷遗遗传病病基因因反义义核酸酸封闭闭活化化的原原癌基基因转入入相关关的抑抑癌基基因，，抑制制肿瘤瘤2、重重组DNA和分分子克克隆技技术，，人工工合成成特异异基因。。1、选选择治治疗的的目的的基因因用于基基因治治疗的的基因因应满满足以以下条条件：：（1））体内内仅少少量表表达就就可显显著改改善症症状。。（2））该基基因的的过量量表达达不会会对机机体造造成危危害、、（3））在抗抗病毒毒和抗抗病原原体的的基因因治疗疗中，，所选选择的靶靶基因因应在在病毒毒和病病原体体的生生活史史中起重要要作用用，并并且该该序列列是特特异的的。理想的的载体体具有有以下下特征征：1、容容易生生产商商业化化生产产，广广泛应应用，，易运运输，，易保保存2、持持续表表达一一旦转转入体体内，，应能能在一一定时时间内内持续续表达达基因因产物，或或能通通过某某种方方法精精细调调节其其表达达。3、弱弱免疫疫源转转入后后不应应引起起免疫疫反应应。4、组组织靶靶向性性定定向向输入入某种种细胞胞。5、包装容容量载体对对转染基因因的大小应应没有限制制。6、复制、、分裂和整整合能力：：特异性定定位整合，，或以游离离基因形式式存在于细胞胞核内。7、能感染染分裂期细细胞和未分分裂期细胞胞2、选择基基因载体：：基因载体：非病毒载体（裸DNA、、脂质体）病毒载体（反转录病毒毒、腺病毒、、腺相关病毒毒）分类：优点：大量量生产，毒性性小，低免疫疫性缺点：效率低低。优点：多数病病毒可感染特特异细胞，不不易降解，RNA病毒能能整合到宿主主染色体，表表达水平高等。病毒介导的基基因转移1、逆转录病病毒：正链RNA病病毒逆转录病毒结结构:基因组组成：：（1）5’－－帽子；3’’－尾巴；（2）每个个单链RNA含6个区：：5’-LTR（长末端重重复序列）Ψ+（组装装所需需的非非编码码序列列）gag（编编码衣衣壳结结构蛋蛋白基基因））pol（编编码反反转录录酶基基因））env（编编码外外壳蛋蛋白基基因））3’-LTR逆转录录病毒毒生活活周期期:1、感感染靶靶细胞胞2、利利用自自身编编码的的逆反反转录录酶，，以RNA为模模板合合成DNA。3、将将病毒毒DNA转转运至至宿主主细胞胞核4、病病毒DNA整合合到宿宿主染染色体体5、以以病毒毒DNA为为模板板转录录RNA6、在在细胞胞中翻翻译Gag、Pol和Env蛋白白7、形形成衣衣壳，，RNA单单链和和反转转录酶酶一起起包装装进衣衣壳。。8、形形成病病毒颗颗粒并并分泌泌到胞胞外。。逆转录录病毒毒病毒RNA宿主细细胞RTRT逆转录录酶cDNA双链插入基因组组DNA逆转录录病毒毒感染染过程程病毒RNA构建逆逆转录录病毒毒载体体：（1））构建建重组野生性性病毒毒：插插入相相关外外源基基因，，改造造成DNA载体体（包包括插插入选选择性性标记记），，替代代病毒毒的编编码基基因。。（2））制备备辅助助细胞胞（293T细细胞）），为为载体体DNA提提供其其丧失失的功功能。。（3））载体体DNA导导入辅辅助细细胞，，产生生病毒毒载体体。（4））用病病毒载载体感感染细细胞，，外源源基因因在宿宿主细细胞中中表达达。逆转转录录病病毒毒载载体体的的缺缺陷陷：：1、只能能转染处处于增殖殖状态的的细胞2、所携携带的外外源基因因不能太太大。3、感染染依赖靶靶细胞表表面受体体的限制制4、理论论上不扩扩散其它它细胞，，但某些些情况会会造成野生型病病毒爆发发。5、有致致细胞癌癌变的可可能。6、逆转录病病毒不能耐受受纯化和浓缩缩过程。腺相关病毒(AVV)一种小的、非非致病的、单单链DNA病病毒。是从属属病毒，需要其他基因才才能复制。结构：rep基基因－－编码码病毒的复制制、整合功能能所需蛋白cap基因－－－编码病毒毒结构组分ITRs序列列－－反向末末端重复，定定义基因的开开始和结束，制约DNA序列大大小，包裹入入衣壳。细胞对AVV病毒的亲和和力高，AVV载体适用用范围广泛。。骨髓细胞、皮皮肤成纤维细细胞、肝细胞胞、血管内皮皮细胞、肌细细胞选择原则:1、较坚固，，耐受处理，，易于由人体体分离，便于于输回体内。2、具有增殖殖优势，生命命周期长，能能存活几个月月或几年，至病人的整个个生命。3、易于受外外源遗传物质质的转化。4、在选用病病毒载体时，，目的基因具具表达最好具具有组织特异异性的细胞3、选择靶细细胞（禁止使用生生殖细胞，只只能用体细胞胞）1、骨髓细胞胞：最被重视视和常用的靶靶细胞。常用细胞：优点：⑴易接受各种处处理、⑵已积积累丰富经验验，⑶多数遗遗传疾病涉及骨髓细胞胞、⑷源自骨骨髓的细胞遍遍布全身。缺点：-骨骨髓干细胞含含量少（占骨骨髓细胞0.1%）-治疗基因在在核骨髓细胞胞表达时间短短（几个月））。-只有部分干干细胞有活性性-造血干细胞胞分化可能导导致基因失活活。-有些遗传疾疾病与骨髓干干细胞无关。。2、肝细胞：：是许多遗传传代谢缺陷的的靶细胞。3、皮肤细胞胞：易于繁殖殖及转化。4、淋巴细胞胞：易采集、、分离，大量量繁殖，连续续多次输入5、癌细胞：：肿瘤治疗常常用细胞。方法：1、物理法：：显微注射法电穿孔法基因枪技术2、化学法：：磷酸钙沉淀法法DEAE-葡葡萄糖法脂质体法3、融合法4、病毒感染染法4、基因的转转移转染细胞后的的筛选：方法：1、标记基因因筛选法：2、基因缺陷陷型受体细胞胞的选择性3、基因共转转染技术4、分子生物物学方法:原位杂交Southern杂交斑点杂交目的基因或标标记基因作为为探针。方法：（目目的基因和标标记基因的表表达）原位杂交、Nouthern杂交、RNA点杂交（检测mRNA的转录））免疫组化染色色（检测基因因翻译出的蛋蛋白质)5、外源基因因表达的检测测：6、回输体内内将治疗性基因因修饰的细胞胞通过不同方方式回输入体内，以发发挥治疗效果果。如：-淋巴巴细胞经静脉脉回输入血-造血细胞经经自体骨髓移移植-皮肤成纤纤维细胞经胶胶原包裹后埋埋入皮下组织织1、肝专一性性表达：磷磷酸烯醇式式丙酮酸羧基基酶启动子2、肌肉专一一性表达：肌肌苷激酶的调调控片段3、乳腺专一一性表达：β酪蛋白，乳清清酸蛋白4、黑色素专专一性表达:酪氨酸酸和酪氨酸相相关蛋白（TRP)5、胶质瘤专专一性表达：：鞘磷酸碱性性蛋白基因上上游片段6、肺癌专一一性表达：人人表面活性性蛋白A与目的基因一一起重组入反反转录病毒，，用于基因靶靶向表达。组织专一性表表达的调节片片段:基因治疗的应应用及展望应用治疗：遗传病（学友友病、囊性纤纤维病、家族族性高血压恶性肿瘤心血管疾病感染性疾病（（AIDS、、类风湿等））呈待解决的问问题：外源基因表达达效率外源基因表达达调控遗传性疾病面面临的免疫问问题反转录病毒载载体随机插入入的外源基因因，若插入不不当，可能破破坏另一个基基因的表达或或激活其它基基因（潜在的的危险）。使用巢式引物物进行连续多多轮扩增可以以提高特异性性和灵敏度。。第一轮是15到20个循环的的标准扩增。。将一小部分分起始扩增产产物稀释100到1000倍加加入到第二轮轮扩增中进行行15到20个循环。。或者，也可可以通过凝胶胶纯化将起始始扩增产物进进行大小选择择。在第二轮轮扩增中使用用一套巢式引引物，其可以以同第一套引引物内侧的靶靶序列结合。。巢式PCR的使用降降低了扩增多多个靶位点的的可能性，因因为同两套引引物都互补的的靶序列很少少。而使用同同样的引物对对进行总数相相同的循环（（30到40）会扩增增非特异性靶靶位点。巢式式PCR可可以增加有限限量靶序列（（如稀有mRNA）的灵灵敏度，并且且提高了困难难PCR（如如5'RACE）的特特异性。巢式式PCR9、静夜四无邻邻，荒居旧业业贫。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黄叶树树，灯下白头头人。。06:11:0406:11:0406:1112/23/20226:11:04AM11、以我独沈久久，愧君相见见频。。12月-2206:11:0406:11Dec-2223-Dec-2212、故人江海别别，几度隔山山川。。06:11:0406:11:0406:11Friday,December23,202213、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。12月月-2212月月-2206:11:0406:11:04December23,202214、他他乡乡生生白白发发，，旧旧国国见见青青山山。。。。23十十二二月月20226:11:04上上午午06:11:0412月月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月226:11上上午12月-2206:11December23,202216、行行动动出出成成果果，，工工作作出出财财富富。。。。2022/12/236:11:0506:11:0523December202217、做前，能够够环视四周；；做时，你只只能或者