基因结构与表达的基本策略教材

1基因结构与表达分析的基本策略StrategyforStructureandExpressionAnalysesofGenes分子生物学系22分子生物学的三大核心技术DNA序列分析—DNA测序，1977聚合酶链式反应—DNA扩增，1985DNA重组技术—基因克隆，19733一、DNA序列分析二、核酸分子杂交三、聚合酶链式反应四、基因芯片和微阵列五、Western免疫印迹主要内容4（一）双脱氧末端终止法

(Sanger,1977)一、DNA序列分析（二）DNA自动化序列分析（三）化学降解法(Gilbert,1977)5FrederickSanger1918～

WalterGilbert1932～

TheNobelPrizeinChemistry1980PaulBerg1926～6DNA测序技术基础：高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）技术，可分离差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。

7(一）双脱氧末端终止法

（dideoxychaintermination）8ATP、dATP和ddATP的结构ATPAOHOHHHdATPddATPNTP:核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP的合称；dNTP:脱氧核苷三磷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP；ddNTP:ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP；9掺入N个核苷酸DNA合成反应模式图10DNA单链模板引物掺入ddNTP延伸的新合成链

末端终止111.双脱氧末端终终止法原理DNA合成反应中，，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能与下下一个核苷酸酸的5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二酯键，，导致DNA新链的延伸提提前终止于ddNTP。12ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPAGCT5′T4711GAATGA3′ACGCT132.DNA测序主要步骤骤14A反应管G反应管G反应管T反应管C反应管T反应管1516GATC17●变性聚丙烯酰酰胺凝胶电泳泳●单链DNA模板的制备●DNA模板与测序引引物退火●掺入入法标记反反应●延伸伸-终止反应●放射射自显影●阅读读测序结果果测序步骤18（二）DNA测序自动化化原理采用4种不同的荧荧光分别标标记4种ddNTP终止反应产产物，替代代放射性同同位素标记记是实现DNA测序自动化化的基础。。19ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5′TGAATGA3′ACGCT2021表示一个SNP位点，该位位点出现了了双峰，对对应的核苷苷酸分别为为C和T,因此该位点点为CT杂合型，如如果该位点点只有一个个峰C或者T，则该位点点基因型为为CC或TT纯合型22DNA自动测序步步骤4种不同荧光光染料标记记终止物ddNTPsSanger测序反应反应产物同一泳道电泳分分离激光激发不不同大小DNA片段上的荧荧光分子，，发射出四四种不同波波长的荧光光荧光信号采采集、计算算机分析与与DNA自动排序23DyelabeleddideoxyterminatorsonABI3730capillaries24

与末端终止法不同，化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础上。

（三）化学降解法25

将待测DNA片段3′或5′端进行同位素标记，标记的DNA片段分成五个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种（类）碱基处断裂。电泳分离5组DNA混合物，放射自显影检测末端标记的DNA链的电泳区带位置。化学降解法原理26化学降解G反应模式图图硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet27最新测序技技术454技术(Roche)焦磷酸测序序（Pyrosequencing）Solexa测序技术(Illumina)SOLiD技术(ABI)连接法测序28举例：Solexa测序HiSeq200029Solexa测序：在一个个反应中同时时加入4种核苷的标签签，采用边合合成边测序（（SBS－sequencingbysynthesis）。完成人类基因因组草图不同同测序仪的比比较图30二、核酸分子杂交交（NucleicAcidHybridization）（一）Southern印迹杂交：检检测DNA(Southernblothybridization)SouthernEM,1975（二）Northern印迹杂交：检检测RNA(Northernblothybridization)StarkGR，197731核酸分子杂交交原理标记的单链核酸探针针与待检测的靶靶单链DNA或RNA局部互补结合合形成杂交双双链。应用：核酸靶DNA或RNA序列的定性与与定量分析。。323333印迹技术利用各种物理理方法使电泳泳胶中的生物物大分子转移移到NC等各种膜上，，使之成为固固相化分子。。这一技术类似似于用吸墨纸纸吸收纸张上上的墨迹，因因此称之为“blotting”,译为印迹技术术。3434探针技术用放射性核素素、生物素或或荧光染料标标记其末端或或全链的已知知序列的多聚聚核苷酸链被被称为“探针”。探针可以与固固定在NC膜上的核苷酸酸结合，判断断是否有同源源的核酸分子子存在。35Southern印迹杂交原理理将电泳分离的的待测DNA片段结合到一一定的固相支支持物上，然然后与存在于于液相中标记记的核酸探针针进行杂交的的过程。（一）Southern印迹杂交应用：DNA（基因组DNA）分子的定性性或定量分析。361.制备基因组DNA2.用限制性内切切核酸酶消化化基因组DNA3.琼脂糖凝胶电电泳分离DNA酶切片段4.凝胶预处理（如强碱，DNA双链变为单链链）5.Southern印迹转移6.标记核酸探针针、探针与DNA片段杂交7.杂交结果显示示Southern印迹杂交基本本过程37Southern印迹杂交示意意图38将电泳分离的的待测DNA片段结合到一一定的固相支支持物上，然然后与存在于于液相中标记记的核酸探针针进行杂交的的过程。3940地中海贫血的的Southernblot基因诊断（1）仅一条染色色体上的一个个α基因缺失或缺缺陷，则α链的合成部分分受抑制，称称为α+地贫；（2）每条染色体体上的2个α基因均缺失或或缺陷，称为为α0地贫；(3)αα1、α2序列基本一致致；基因不同程程度的缺失可可引起不同类类型的地中海贫血。。α1α2αααα+α+α+αα0α+α0α0α041BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe地中海贫血的的直接基因诊诊断42αα/ααααα/α-ααα/--αα-/-/--正常缺缺1缺2缺3缺414kb10kb43（二）Northern印迹杂交(Northernblothybridization)指将RNA变性及电泳分分离后，并转转移到固相支支持物上，用用杂交反应来来鉴定其中特特定mRNA分子的含量及及其大小。用于mRNA进行定性和定定量分析。44RNA琼脂糖凝胶电电泳3kb0.4kbNt36382604623Northernblothybridization28S18S应用举例45GAPDH0d2d4d6d8dNorthernblot杂交分析析mRNA的表达靶mRNA3-磷酸甘油油醛脱氢氢酶4646三、其他他杂交技技术1.斑点杂交交(dotblothybridization）将RNA或DNA变性后直直接点样样于硝酸酸纤维素素膜或尼尼龙膜上上，用于于基因组组中特定定基因及及其表达达的定性性及定量量研究。。47472.原位杂交交

（insituhybridization）用标记的的核酸探探针与组组织切片片或细胞胞中的待待测核酸酸互补序序列杂交交，可对对核酸进进行定性性、定位位和相对对定量分分析。483．核酸酶酶S1保护分析析法(nucleaseS1protectionassay）单链DNA探针与待测RNA形成DNA/RNA杂交双链链，加入入核酸酶酶S1专一性地地降解未未形成杂杂交体的的DNA或RNA单链，DNA/RNA杂交双链链则受到到保护而而不被降降解。494．RNA酶保护分分析法（RNaseprotectionassay，RPA）50RPA基本程序：：●待测RNA的分离●体外转录标标记RNA探针●待测RNA与探针RNA进行液相杂杂交●RNA酶消化●不同大小杂杂交片段凝凝胶电泳分分离51三、聚合酶酶链式反应应(PolymeraseChainReaction,PCR)（一）PCR技术原理（二）耐热热DNA聚合酶（三）PCR引物及设计计原则（四）PCR条件的优化化（五）PCR改进技术（六）其它它PCR技术52聚合酶链式式反应(PCR):（一）PCR技术原理

Mullis

K.

1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。

TheNobelPrizeinChemistry199353ThereplicationofDNA54原理：PCR是模拟天然然DNA复制过程，，利用DNA聚合酶催化化一对引物物间特异DNA片段合成的的体外扩增增技术。其其主要热热循环过程程为：变性性、退火、、延伸三个个步骤。551.PCR循环由三步步组成：①变性（denaturation）②退火（annealing）③延伸（extension）高温合适温度合适温度5657582.PCR扩增终产物物大小:介于两条退退火引物5′末端之间的的双链DNA片段。循环一59循环二60循环三61一对引物：：正向和反反向

限制制了PCR扩增的片段段的范围5/——5/—3/3/—5/——5/—3/3/—625′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGCAGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCGAGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG3′GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT3.引物设计计实例63Y=A（1+E）nY:扩增产物物的量A:最初靶DNA分子数E:PCR扩增效率率n:循环次数数3.PCR产量当E＝100％,A=1时Y=2n>>2n(引物延伸产物物的量）64（二）平台期期与平台效应应1.平台效应（plateaueffect）：PCR经过一定数量量的循环后，，DNA片段不再呈指指数累积，而而是进入线性性增长期或静静止期，即平台效应。影响因素：①引物及及dNTP底物浓度降低低。②酶与模模板比例下降降。65PCR平台效应66（二）耐热DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（实现了PCR自动化）从嗜热水生菌菌thermusaquaticsYT-1株中直接分离离出来。●95℃的半衰期:40min●最适温度:72℃℃～80℃●催化反应速率:150～300核苷酸/秒/酶分子6768TaqDNA聚合酶特性：：●5′→3′聚合酶活性；；●5′→3′外切酶活性；；●较弱的的非模板依赖赖性；●缺乏3′→5′外切酶活性。。69PCRthermalcycler70PCR产物的琼脂糖凝胶电泳泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR产物71无机离子及抑抑制剂的影响响TaqDNA聚合酶的活性性对Mg2+浓度和单价离离子（K+或NH4+）的性质和浓浓度较敏感。。最适Mg2+浓度：2mmol/LK+浓度：50mmol/L72几种高保真的的耐热DNA聚合酶1.TthDNA聚合合酶酶2.VentDNA聚合合酶酶3.PfuDNA聚合合酶酶73（三三））PCR引物物设设计计原原则则引物物的的化化学学本本质质是是什什么么？？单链链寡寡核核苷苷酸酸DNA或RNA片段段。。DNA复制制引引物物：：单单链链RNA片段段PCR引物物：：单单链链DNA片段段74PCR引物物设设计计原原则则：1.引物物与与模模板板的的序序列列要要完完全全互互补补2.引物物与与引引物物之之间间避避免免形形成成稳稳定定的的二二聚聚体体或或发发夹夹结结构构3.引物不能在模模板的非目的的位点引发DNA聚合反应应(错配)755′CACTGAACGTAGGCCT3′3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′特异扩增增5′CACTGAACGTAGGCCT3′3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′错误引发发1.引物与模模板的序序列要紧紧密互补补2.引物不能能在模板板的非目目的位点点引发DNA聚合反应应(错配)76引物之间间应避免免3′端互补3.引物与引引物之间间避免形形成稳定定的二聚聚体或发发夹结构构77引物自身身不应形形成发夹夹结构784.其它原则则:①引物长度度:10～30nt②碱基分布布:A、T、G、C随机分布布③G+C含量：40～60%Tm=4(G+C)+2(A+T)④引物3′末端碱基基：最好选选T、C、G，不选A避免出现现3个以上的的连续碱碱基，如如GGG或CCC⑤引物5′末端碱基基可不与与模板DNA互补791A260oligoDNA≈33μgN:引物碱基数X：合成的的oligoDNAA260单位Y：引物物的pmol数106Y（pmol）=X·33××───330.NX=───××105N2.引物用用量计计算80模板引物TaqDNA聚合酶酶dNTPMg2+退火变性延伸PCR反应81（四））PCR条件的的优化化1.TaqDNA聚合酶酶浓度度：1.0～2.5U/100μμl反应液液2.dNTP浓度：：20～200μμmol/L3.Mg2+浓度：：0.5～2.5mmol/L4.引物浓浓度：：0.1～0.5μμmol/L82（五））PCR改进技技术1.RT-PCR(reversetranscriptionPCR)以mRNA为模板板逆转转录合合成cDNA，再以以此cDNA为模板板进行行PCR反应。83RT-PCR原理84逆转录录酶①AMV（avianmyeloblastosisvirus）酶活性性最适适温度度42℃℃②MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：最最适温温度37℃℃852.定量RT-PCR（QRT-PCR）半定量量RT-PCR以样本本mRNA为模板板逆转转录合合成cDNA，在不不同引引物对对引导导下共共同PCR扩增“看家家”基基因和目的基因cDNA。86①选择内对照照基因组织中普遍遍表达、表表达量比较较恒定的““看家”基基因mRNA。如GAPDH和β-actinmRNA等。②半定量标准准计算PCR产物：靶cDNA/GAPDHcDNA87③KPNA2在正常生生理状态东东方田鼠和和小鼠体内内表达分析析88893.实时荧光定定量RT-PCR

Real-timefluorescentquantitative–PCR，FQ-PCRPCR扩增指数期期内极小的的扩增效率率改变会极极大地影响响产量。应用：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分分析。90①荧光染料9192每形成一个个DNA双链，就有有一定数量量的染料结结合上去，，染料一结结合就产生生荧光信号号，信号强度与与DNA分子总数目目成正比。93②TaqManProbe一种水解式式荧光标记记探针。寡寡核苷酸探探针的5′端标记一个个荧光报告告基团（reporter），3′端标记一个个荧光淬灭基团（quencher）。94每产生一条条DNA链，就切断断一条探针针，每切断断一条探针针，就产生生一个单位位信号，信号强度与与结合探针针的DNA分子数成正正比。95。③分子信标探探针（MolecularBeaconProbe）该探针具有有发夹结构构，5′端标记荧光光报告基团团，3′端标记淬灭灭基团。96探针与靶序序列杂交结结合，报告告荧光染料料与淬灭染染料分离，，发出荧光光。97④实时荧光光定量PCR计算原理PCR扩增效率的的差异使相相同的样品品最终产量量有很大差差异9899CT或Tc或Ct值：临界点循环环（Thresholdcycle），即从基基线到指数数增长的拐拐点所对应应的循环数数100101●传染病诊断断、监测与与疗效预后后评估：●揭示疾病发发病机制102⑤荧光定量PCR仪带有激发光光源和荧光光信号检测测系统的PCR仪，配有电电脑系统及及分析软件件。103（六）其它它PCR技术1.反向PCR（inversePCR）原理1042.Alu-PCR1053.原位PCR(in-situPCR)4.巢式PCR（nestedPCR）5.不对称PCR（asymmetricPCR）106DNAChipandMicroarray四、基因芯片和和微阵列●基因芯片上上的阵列是是由有规则则排列的cDNA或寡核苷酸酸等样本所所组成的。。107宏阵列(Macroarray)高密度微阵列(Microarray)举例：HPV诊断芯片108DNA微阵列：●寡核苷苷酸微阵列列（oligomicroarray）●cDNA微阵列（cDNAmicroarray）在一微小的的基片（硅硅片等）表表面集成了了大量分子子识别探针针，能够平平行分析大大量基因转转录表达，，因此又被被称为cDNA芯片。109DNA芯片（cDNA芯片）主要技术流程：样品荧光标记及芯片制备杂交反应及过程控制杂交信号检测信号分析与解读110CBACy5-标记cDNACy3-标记cDNACBACBACBACBACBACBA样品1样品2Cy5/Cy3荧光标标记RNA提取竞争性性杂交交显示示基因表表达量量差异异二种样品竞争性杂交示意图基因表达谱芯片的原理111DNA芯片技技术的的主要要应用用基因组组分析析及发发现新新的基基因基因表表达的的研究究DNA序列分分析基因诊诊断和和基因因药物物设计计112五、Western免疫印印迹Westernblotting原理与与核酸酸分子子杂交交相似似，只只是以以偶联联标记记物的的抗体分子作作为探探针，，检测测转移移到固固相支支持物物上的的蛋白质质分子。。113Western免疫印印迹信信号检检测原原理114蛋白质质样品品制备备SDS分离蛋白质质转膜膜Westernblot程序115抗体与与抗原原杂交交信号检检测分分析116谢谢大大家！！9、静夜四四无邻，，荒居旧旧业贫。。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黄黄叶树，，灯下白白头人。。。06:10:0806:10:0806:1012/23/20226:10:08AM11、以我我独沈沈久，，愧君君相见见频。。。12月月-2206:10:0806:10Dec-2223-Dec-2212、故人人江海海别，，几度度隔山山川。。。06:10:0806:10:0806:10Friday,December23,202213、乍见翻疑梦梦，相悲各问问年。。12月-2212月-2206:10:0806:10:08December23,202214、他乡生白白发，旧国国见青山。。。23十二二月20226:10:08上上午06:10:0812月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月226:10上上午12月-2206:10December23,202216、行动出成果果，工作出财财富。。2022/12/236:10:0806:10:0823December202217、做前，能够够环视四周；；做时，你只只能或者最好好沿着以脚为为起点的射线线向前。。6:10:08上午6:10上上午06:10:0812月-229、没有失败，，只有暂时停停止成功！。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、很多事情努努力了未必有有结果，但是是不努力却什什么改变也没没有。。06:10:0806:10:0806:1012/23/20226:10:08AM11、成功就是是日复一日日那一点点点小小努力力的积累。。。12月-2206:10:0806:10Dec-2223-Dec-2212、世间成事事，不求其其绝对圆满满，留一份份不足，可可得无限完完美。。06:10:0806:10:0806:10Friday,December23,202213、不不知知香香积积寺寺，，数数里里入入云云峰峰。。。。12月月-2212月月-2206:10:0806:10:08December23,202214、意意志志坚坚强强的的人人能能把把世世界界放放在在手手中中像像泥泥块块一一样样任任意意揉揉捏捏