基因工程重组体克隆的筛选与鉴定

第六章重组体克隆的筛选与鉴定由DNA分子的体外重组，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主，会得到大量的重组体细胞或噬菌体。在这些众多的重组体中，会有多种类型的DNA分子，包括：不带任何外源DNA插入片段，仅由线性载体分子自身连接形成的环状DNA分子；由一个载体分子和一个或数个外源DNA片段构成的重组体DNA分子；单纯由数个外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子。对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法，包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性探针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。

6.1利用表型特征选择（遗传检测法）

表型是指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序列提供的，前者应用较多。

6.1.1利用载体提供的表型特征选择重组体分子

1.抗药性标记插入失活选择法检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插入失活效应。例如在pBR322质粒的DNA序列上，编码有四环素抗性基因(Tetr)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，且在Tetr基因内有BamHI和SalI两种限制酶的单一切点。在这两个识别位点中的任何插入作用，都会导致Tetr基因出现功能性失活，因而根据AmprTets表型即可筛选出在Tetr基因内带有插入DNA片段的重组体细胞。利用环丝氨酸富集法可以简化这种插入失活检测法的程序，该法可以使那些只带有原来质粒载体的细菌致死，从而抑制不含有插入DNA片段的载体分子形成转化子。例如：当外源DNA插入在pBR322质粒的四环素抗性基因(Tetr)上，该基因便会立即失去它的功能作用，而另一种抗菌素抗性基因氨苄青霉素基因(Ampr)，则仍然是完整的。将转化的细菌培养物移至含有氨苄青霉素的培养基中生长，经过这样的选择作用而得以存活下来的所有细胞，都应该带上了pBR322质粒分子。在这些pBR322质粒分子中，有一部分是在其Tetr基因序列内具有DNA插入片段的重组质粒。把这种富集了的培养物作适当的稀释后，转接到含有四环素的培养基中生长，于是在其pBR322质粒分子的Tetr基因序列中带有DNA插入片段的所有细胞，都将停止生长（注意：四环素不会使细胞死亡，只是抑制细胞的生长）。最后加入环丝氨酸，就会促使所有正在生长着的细胞发生溶胞反应，那些没有发生溶胞反应而存活下来的细胞，大约有90~100%都带有pBR322重组质粒，且在其Tetr基因上都含有一个插入的外源DNA片段，这些细胞可通过离心作用收集起来。此外，在pBR322质粒的Ampr基因序列中，也有一个PstI限制酶的唯一识别位点。Ampr基因正常情况下表达产生-内酰胺酶，在其作用下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指示液（30%I2，1.5%KI，5%青霉素G，0.05M的pH6.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失活后，AmpsTetr菌落在碘-青霉素指示液中不褪色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜色的改变与否，很容易鉴别出重组体菌落。这种种方方法法的的优优点点是是无无需需把把每每一一个个转转化化子子接接种种在在Amp和和Tet平平板板上上，，直直接接在在转转化化平平板板上上即即可可鉴鉴定定。。其其缺缺点点是是由由于于把把指指示示液液直直接接加加入入选选择择平平板板内内，，极极易易超超成成菌菌落落之之间间的的相相互互污污染染，，给给其其后后的的鉴鉴定定带带来来困困难难。。目目前前使使用用纸纸片片法法使使这这一一方方法法得得到到了了改改善善：：预预先先将将一一定定大大小小的的纸纸片片浸浸泡泡在在指指示示液液中中，，干干燥燥后后密密闭闭保保存存，，使使用用时时只只要要将将纸纸片片覆覆盖盖在在转转化化平平板板上上，，数数分分钟钟内内就就可可以以观观察察到到结结果果。。2.-半乳糖苷酶酶显色反应选选择法将pUC质粒粒转化的细胞胞，培养在补补加有X-gal和乳糖糖诱导物IPTG的培养养基中时，由由于基因内互互补作用形成成的有功能的的半乳糖苷酶酶，会把培养养基中无色的的X-gal切割成半乳乳糖和深蓝色色的底物，使使菌落呈现出出蓝色反应。。当pUC质粒粒载体的lacZ序列插入了外外源DNA片片段时，会阻阻断读码结构构，使其编码码的肽失去活性，，结果产生出出白色的菌落落。因此，根根据这种-半乳糖苷酶酶的显色反应应，便可以检检测出含有外外源DNA插插入序列的重重组体克隆。。利利用插入序序列提供的表表型特征选择择重组体分子子这种选择法要要求所克隆的的DNA片段段是一个完整整的序列，而而且能够在大大肠杆菌中实实现功能的表表达。其依据据的基本原理理是：转化进进来的外源DNA编码的的基因，能够够对大肠杆菌菌寄主菌株所所具有的突变变发生体内抑抑制或互补效效应，从而使使被转化的寄寄主细胞表现现出外源基因因编码的表型型特征。例如如小鼠的二氢氢叶酸还原酶酶（DHFR）的分离：：先将含有DHFR-mRNA的小鼠鼠总mRNA制剂反转录录成cDNA拷贝，构建建cDNA基基因文库。根根据小鼠DNFR对于药药物三甲氧苄苄二氨嘧啶呈呈现抗性这种种性状特征，，将转化的细细菌生长在含含有三甲氧苄苄二氨嘧啶的的培养基中（（其含量水平平为可以抑制制大肠杆菌的的DHFR的的活性），选选择转化子。。这样分离出出来的抗性克克隆，显然都都是由于具有有小鼠DHFR基因的克克隆片段，赋赋予寄主细胞胞新的抗性表表型所致。利利用噬菌斑斑形态选择重重组体分子把DNA包装装成有活性的的噬菌体颗粒粒，主要取决决于两个因素素：一是要具具有能被噬菌体包装蛋蛋白和头部前前体所识别的的区域，即cos区；二二是DNA的的长度，只有有重组体DNA是野生型型DNA的75~105%的长度时，，才能在培养养平板上形成成清晰的噬菌菌斑，而单一一的载体DNA是不会包包装成活的噬噬菌体颗粒的的。经体外包装，，转导后能否否形成清晰噬噬菌斑，尤其其是对替换型型载体，本身就就是一种可利利用的选择标标记。另外cI基因插入入失活后，会会诱发溶源性细菌的的原噬菌体进入溶菌周期期，根据产生生噬菌斑的清清晰与混浊，，也可以进行行选择。6.2利用用核酸杂交筛筛选从基因文库中中筛选带有目目的基因插入入序列的克隆隆，最广泛使使用的一种方方法是核酸分分子杂交技术术。它所依据据的原理是放放射性同位素素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针进行行DNA-DNA或DNA-RNA杂交，利用用同源DNA碱基配对的的原则检测特特定的重组克克隆。核酸杂交筛选选法的最大优优点是它可以以普遍广泛地地应用，尤其其适合于大量量群体的筛选选，只要有现现成可用的特特异性探针，，就可以有效效地检测任何何一种插入的的外源DNA序列，而不不以这种序列列能否在大肠肠杆菌中实现现基因表达为为前提。原原位杂交筛筛选生长在培养基基平板上的菌菌落或噬菌斑斑，按照其原原来的位置不不变地影印在在硝酸纤维素素滤膜上，并并在原位发生生溶菌、DNA变性和杂杂交作用，而而将母板很好好地保存起来来。因为变性性DNA同硝硝酸纤维素滤滤膜有很强的的亲和力，便便在膜上形成成DNA的印印迹，在80℃下烘烤滤膜，，使DNA牢牢固地固定下下来。用放射性同位位素标记的RNA或DNA为探针同同滤膜上的菌菌落所释放的的变性DNA杂交，并用用放射自显影影技术进行检检测，凡是含含有与探针互互补序列的菌菌落DNA，，就会在X光光胶片上出现现曝光点。根根据曝光点的的位置，便可可以从保留的的母板上相应应位置挑出所所需要的阳性性菌落或噬菌菌斑，这就是是所需要的含含有目的基因因插入片段的的重组体克隆隆。核核酸杂交检检测的探针进行核酸分子子杂交的前提提是要有特定定的DNA或或RNA作探探针。具有一一定已知序列列的核酸片段段，再带上一一定的探测标标记，就构成成了核酸探针针。它可以通通过分子杂交交与待测基因因的DNA序序列结合，产产生杂交信号号，从而把待待测基因的质质和量显示出出来。1.放射性性探针广泛使用的探探针，多是以以32PdNTP为标标记前体，通通过缺口平移移的方法，把把天然DNA或RNA片片段标记上放放射性同位素素。此外还可以化化学合成DNA探针，只只要已知目的的基因产物的的部分氨基酸酸序列，就可可以从这个信信息中，反推推出基因编码码区可能的核核苷酸排列顺顺序。选择一一小段含有独独特密码子（（Met和Try）或简简并性最小的的密码子（Cys、His、Phe和Tyr等等）的氨基酸酸序列，用化化学法合成出出相当于这些些密码子序列列的寡核苷酸酸片段（10~20个碱碱基）混和物物；然后利用用多核苷酸激激酶，将32PdNTP转移移到合成的DNA的5’’-OH末端端（称为末端标记），即成为标标记好的探针针。一个密码子：：Met（甲硫硫氨酸）AUGTry（色色氨酸）UGG二个密码子：：Cys（半胱胱氨酸）His（组组氨酸）Phe（（苯丙氨酸））Try（（酪氨酸）Lys（（赖氨酸）2.非放射射性探针由于32P放射性同位位素半衰期只只有14.3天，不易保保存，且对人人体有一定的的损害，因而而近年来又研研制了非放射射性物质标记记核酸的方法法，如糖基化化探针、生物物素探针、毛毛地黄苷标记记等。用生物素标记记DNA形成成探针是目前前用得较多的的一种，它可可以采用酶促促或光促生物物素来标记核核酸。酶促法法是利用缺口口转移的方法法，但标记前前体不是32PdTTP，而而是用嘧啶环环C5位连接接了生物素的的dTTP（（或dUTP），它可可以有效地掺掺入DNA中中形成生物素素探针。光促法使用的的试剂为光敏敏生物素乙酸酸盐，它是由由光敏基团、、连接臂和生生物素组成的的。光敏基团团可在光照下下活化，与核核酸的碱基结结合，连接臂臂可以降低生生物素基团对对核酸杂交的的空间位阻；；生物素用做做标记物。将将待标记的核核酸（DNA或RNA））与光敏生物物素乙酸盐混混合，在近紫紫外的光源（（如高压汞灯灯、碘钨灯））下照射15~20分钟钟，就可将生生物素标记在在单链或双链链的DNA或或RNA上，，形成稳定的的共价结合。。标记好的生物物素探针，可可用于核酸的的杂交反应，，然后用亲和和素-酶系统统来显示。亲亲和素可以特特异地与生物物素结合，酶酶可与底物反反应进行显色色或化学发光光，这就相当当于放射性同同位素探针杂杂交后的放射射自显影。最最常用的工具具酶是辣根过过氧化物酶（（HRP）和和碱性磷酸酶酶（AP）。。非放射性方法法进行核酸杂杂交，其灵敏敏度不如放射射性方法高，，但非放射性性探针具有安安全、稳定、、使用方便等等优点，是一一种正在发展展很有前途的的方法。6.3利用用免疫学方法法筛选免疫学方法专专一性很强、、灵敏度很高高，其基本原原理是：以目目的基因在宿宿主细胞中的的表达产物（（多肽）作抗抗原，以该基基因产物的免免疫血清作抗抗体，通过抗抗原抗体反应应将目的基因因克隆检出。。免疫学学方法法可以以分为为两种种：即即放射射性抗抗体测测定法法和免免疫沉沉淀测测定法法。这这些方方法最最突出出的优优点是是，它它们直直接检检测重重组克克隆所所表达达的蛋蛋白产产物，，能够够检测测无任任何可可供选选择的的表型型特征征的重重组克克隆。。当然然这种种方法法必须须具备备有效效的特特异性性抗体体。放放射性性抗体体测定定法这一方方法所所依据据的原原理为为：(1)一一种免免疫血血清含含有好好几种种特异异性抗抗体（（IgG）），它它们识识别抗抗原分分子上上的不不同定定子，，并分分别同同各自自识别别的抗抗原定定子相相结合合；(2)抗抗体分分子或或抗体体的F(ab)部分分，能能够十十分牢牢固地地吸附附在固固体基基质（（如聚聚乙烯烯等塑塑料制制品））上，，而不不会被被洗脱脱掉；；(3)通通过体体外碘碘化作作用，，IgG抗抗体便便会迅迅速地地被放放射性性同位位素125I标记记上。。放射性性抗体体测定定的主主要程程序是是：(1)首首先把把转化化的菌菌落涂涂布在在平板板上，，长出出菌落落以后后，再再影印印到另另一块块平板板上继继续培培养，，并保保留原原来的的平板板作为为母板板；(2)待待影印印平板板上的的菌落落长好好后，，置于于含有有氯仿仿饱和和气体体的容容器中中使菌菌落裂裂解，，阳性性菌落落便释释放出出抗原原；(3)将将吸附附了未未标记记IgG抗抗体的的聚乙乙烯薄薄膜覆覆盖在在平板板表面面，如如果抗抗原与与抗体体具有有对应应关系系，则则在薄薄膜上上形成成抗原原-抗抗体复复合物物；(4)取取下聚聚乙烯烯薄膜膜，再再用125I标标记的的IgG处处理，，125I-IgG便会会与结结合在在聚乙乙烯薄薄膜上上的抗抗原决决定簇簇结合合；(5)漂漂洗聚聚乙烯烯膜除除去过过剩的的125I-IgG，干干燥后后进行行放射射性自自显影影判断断结果果，并并从母母板上上获得得相应应的重重组克克隆。。对于能够分泌泌表达产物的的重组体克隆隆，可以省去去影印平板、、裂解菌落等等程序，操作作更为简化。。例如分泌胰胰岛素重组体体克隆的筛选选：在放射免疫分分析法基础上上，最近又发发展了一类非非放射性免疫疫分析技术，，例如荧光免免疫分析、酶酶免疫分析以以及化学发光光免疫分析等等。这些方法法具有和放射射免疫法相同同的灵敏度和和特异性，而而且没有象同同位素那样的的半衰期短和和安全防护问问题，是一类类很有发展前前途的检测技技术。免免疫沉淀测测定法相对于放射性性免疫法，该该方法灵敏度度要低，而且且易受干扰，，但它的价值值在于实验简简便易行。其其做法是：在在生长菌落的的琼脂培养基基中，加入专专门抗这种蛋蛋白质分子的的特异性抗体体。如果有些些菌落的细菌菌会分泌出某某种蛋白质，，那么在它的的周围就会出出现一条叫做做沉淀素的抗抗体-抗原沉沉淀物所形成成的白色的圆圆圈。上述方法的缺缺点是只能检检测分泌出细细胞的蛋白质质；经两项轻轻微的改良后后，也可以用用来检测非分分泌的蛋白质质。第一种改良良方法是：：采用对cI857噬菌体溶溶源性的大大肠杆菌细细胞作寄主主，它含有有在42℃下会发生生热失活的的热敏感阻阻遏物。把把生长着待待检测菌落落的原培养养基平板，，影印到加加有抗体的的琼脂平板板上，等到到影印平板板中的菌落落长到肉眼眼可以辨认认的大小时时，将培养养温度上升升到42℃℃，经过1h之后后，平板中中就会有许许多细胞被被热诱导发发生溶菌作作用。于是是细胞的内内含物便被被释放出来来，分布在在周围的培培养基中，，其中目的的基因编码码的蛋白质质就会同加加在培养基基中的抗体体发生反应应，并在菌菌落的周围围形成一圈圈沉淀素带带。第二种改良良方法是：：将补加有有抗体和溶溶菌酶的琼琼脂，小心心地倾注到到菌落的上上面，并使使之凝固。。在溶菌酶酶的作用下下，处于菌菌落表面的的细胞发生生溶菌反应应，逐步地地释放出细细胞内部的的蛋白质。。如果有某某些菌落的的细胞能够够分泌出目目的基因编编码的蛋白白质，它们们就会同包包含在琼脂脂培养基中中的抗体发发生反应，，形成沉淀淀素圈。6.4转转译筛筛选法法转译筛筛选法法可分分为杂杂交阻阻断转转译法法（HART））和杂杂交释释放转转译法法（HRT）两两种不不同的的筛选选策略略。它它们的的突出出优点点是，，能够够将克克隆的的DNA同同所编编码的的蛋白白质产产物之之间的的关系系对应应起来来。这这两种种方法法都要要通过过无细细胞转转译系系统检检测经经处理理后的的mRNA的生生物学学功能能，常常用的的有麦麦胚提提取物物系统统、网网织红红细胞胞提取取物系系统。。杂杂交阻阻断转转译法法（HART））这种方方法又又称杂杂交抑抑制的的转译译筛选选法，，其依依据的的原理理是：：在体体外无无细胞胞的转转译体体系中中，mRNA一一旦同同DNA分分子杂杂交之之后，，就不不能够够再指指导蛋蛋白质质多肽肽的合合成，，即mRNA的的转译译被抑抑制了了。在高浓浓度甲甲酰胺胺溶液液的条条件下下（这这种溶溶液既既有利利于DNA-RNA的杂杂交，，同时时又能能抑制制质粒粒DNA的的再联联合）），将将从转转化的的大肠肠杆菌菌菌落落群体体或噬噬菌体体群体体中制制备来来的带带有目目的基基因的的重组组质粒粒DNA，，变性性后同同未分分部的的总mRNA进进行杂杂交。。从杂杂交交混混合合物物中中回回收收的的核核酸酸，，加加入入到到无无细细胞胞转转译译体体系系进进行行体体外外转转译译，，由由于于其其中中加加有有35S标标记记的的甲甲硫硫氨氨酸酸，，因因此此转转译译合合成成的的多多肽肽蛋蛋白白质质，，可可以以通通过过聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳和和放放射射自自显显影影进进行行分分析析。。并并把把其其结结果果同同未未经经杂杂交交的的mRNA的的转转译译产产物物作作比比较较，，从从中中便便可可以以找找到到一一种种其其转转录录合合成成被被抑抑制制了了的的mRNA，，这这就就是是同同目目的的基基因因变变性性DNA互互补补而而彼彼此此杂杂交交的的那那种种mRNA。。根根据据这这种种目目的的基基因因编编码码的的蛋蛋白白质质转转译译抑抑制制作作用用，，就就可可筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的重重组组体体质质粒粒的的大大肠肠杆杆菌菌菌菌落落群群体体或或噬噬菌菌体体群群体体。。阻断转转译杂杂交法法是一一种很很有效效的检检测手手段，，它能能从总总mRNA逆转转录产产生的的cDNA群体体中检检出所所需要要的目目的cDNA，，因而而特别别适用用于那那些高高丰度度的mRNA。。杂杂交释释放转转译法法（HRT）这种方方法又又称杂杂交选选择的的转译译筛选选法，，是一一种更更为敏敏感的的方法法，而而且可可以检检出低低丰度度的mRNA（（占总总mRNA的1‰）），它它与阻阻断转转译杂杂交的的原理理相似似。其主要要程序序是：：首先先将克克隆DNA结合合到硝硝酸纤纤维素素滤膜膜上，，再与与未经经分离离纯化化的mRNA或或细胞胞的总总RNA杂杂交；；然后后漂洗洗滤膜膜，在在低盐盐缓冲冲液或或甲酰酰胺的的缓冲冲液中中加热热，把把杂交交的mRNA洗洗脱下下来（（即把把mRNA释放放出来来）；；再用用回收收的mRNA进进行体体外转转译试试验，，用聚聚丙烯烯酰胺胺凝胶胶电泳泳和放放射自自显影影分析析鉴定定转译译产物物，同同时亦亦可测测定蛋蛋白产产物的的生物物活性性，以以达到到筛选选所需需基因因的目目的。。6.5物物理筛筛选法法凝凝胶电电泳筛筛选法法带有插插入片片段的的重组组体在在分子子量上上会有有所增增加，，因而而一种种直截截了当当的方方法是是分离离质粒粒的DNA并测测定其其分子子长度度。对对此，，电子子显微微镜是是有效效的方方法，，但过过于繁繁琐，，通常常用操操作程程序比比较简简单的的凝胶胶电泳泳法进进行检检测。。由于于质粒粒DNA的的电泳泳迁移移率是是与其其分子子量大大小成成比例例的，，根据据在凝凝胶中中迁移移速度度的差差别，，即可可鉴定定出含含有外外源DNA插入入序列列的重重组体体菌落落。有些假假阳性性转化化菌落落（如如自我我连接接载体体、缺缺失连连接载载体、、未消消化载载体、、两个个互相相连接接的载载体，，以及及两个个外源源片段段插入入的载载体等等转化化的菌菌落）），用用平板板法筛筛选是是无法法鉴别别的，，但可可以被被电泳泳法淘淘汰。。因为为由这这些转转化菌菌落分分离的的质粒粒DNA分分子的的大小小各不不相同同：和和真正正的阳阳性重重组体体DNA比比较，，前三三种重重组DNA分子子较小小，在在电泳泳时的的泳动动率较较快，，其DNA带的的位置置跑在在阳性性重组组DNA带带的前前面；；后两两种重重组DNA分子子较大大，泳泳动率率较慢慢，其其DNA带带的位位置跑跑在阳阳性重重组DNA带的的后面面。所所以电电泳法法能筛筛选出出有插插入片片段的的阳性性重组组体。。如果插插入片片段是是大小小相近近的非非目的的基因因片段段，对对于这这样的的假阳阳性重重组体体，电电泳法法仍不不能鉴鉴别，，只有有进一一步用用Southernblot杂杂交，，即以以目的的基因因片段段制备备的放放射性性探针针和电电泳筛筛选出出的重重组体体DNA杂杂交，，才能能最终终确定定真阳阳性重重组体体。Southernblot：：由E.southern于于1975年年创创立立的的杂杂交交方方法法：：将将琼琼脂脂