短叶十三萝卜中一种双链rna病毒研究

分类号 密级UDC论文答辩日期 2012年3月7日答辩 论文评阅 杜志答辩成 陈集国家自然科学基金 )摘我们前期从一点红萝卜中总共分离、克隆获得了三种潜隐性的dsRNA，分别命名为RasV1、RasV2、RasV3。其中RasV1与RasV2的组分别由3条dsRNA片段组成，最大的dsRNA片段编码的RdRp，另外两条dsRNA片段编码的CP。RasV3的组由两条dsRNA片段组成，最大的dsRNA片段编码的RdRp，另外一条dsRNA片段编码的CP。基于一点红萝卜的研究，我们选取短叶十三、南畔洲、特大青头、大青皮、春秋四季红以及一点红等6sNA行诊断分析，初步探讨6个萝卜品种中携带sNA的情况。此对短叶十三萝卜中普遍携带的大小在3000p-4000p的可能构成同一的3条sNA(-ST法)获得了条sNA片段对应的DNA。示3条sNA片的大小分别为3638p3517p3299pRasV1-1R3。核苷酸序列比对分析显示RaCV1R1、2、3的5'UTR与'-UTR都具有高度的序列相似性，保守序列分别为5'端-GUAAAA-3与3'端5-AUAUAUUUGUC-3aCV1-中包含一个单独的OR(107t-3523)19aa131kDa，ASP搜索结果显示，该编码蛋白与hrysovrde科编码的RRp菌sNARRp中8个高度保守的oif；2中包含一个3306p的O，编码02aa的蛋白，分子量大小为124kD，编码蛋白BASP与hrysovrde科编码的P具有较高的序列与Chrysvrdae科P的N端区域存在高度的保守区域；aCV1R3包含一个单独的O(135t–3122)，编码96aa的蛋白，分子量大小为109kDa，ASP检索显示与hrysordae科编码的OTUOTU蛋白的4个保守的ofasV1-1、2、R3的遗传进化分析显示与红掌花叶(AmaV)可能构成Crsoirdae科的一个新的侵染植物的分类单元。利用氯化铯密度梯度离心法从萝卜叶片组织中提取样粒子，在氯化铯度梯度中的范围为1.35-1.40gcm-3，电镜观察粒子为球状，直径约为35nm粒子中提取组与从叶片组织中提取的dsRNA条带大小相一致，基RT-PCRNorthern3dsRNA片段的来源。另外对结构蛋白的分段现象做了初步的分析讨论。总之，本研究首次了从生长的植物中分离到一种新的科的全组序列，并对该可能的分类地位进行了讨论：萝卜，双链RNA，产黄青霉科Previously,wehavebeenisolatedandclonedthreecrypticdsRNAeswhichwerecomposedofeightdsRNAsegmentsfromR.sativuscv.Yidianhong,namedRaphanussativuscryptic 1(RasV1),Raphanussativuscryptic 2(RasV2)andRaphanussativuscryptic3(RasV3)respectively.RasV1andRasV2havethegenomecomposedofthreedsRNAsegmentsrespectively,withthelargestdsRNAsegmentencodingRNA-dependentRNApolymeraseandtheothertwoencodingcoatproteins.ThegenomeofRasV3consistsoftwodsRNAsegmentswiththelargestdsRNAsegmentencodingRNA-dependentRNApolymeraseandtheotherencodingcoatprotein.BasedontheresearchofR.sativuscv.Yidianhong,wehavecultivatedsixvarietiesofR.sativuscv.Duanyeshisan,Nanpanzhou,Tedaqingtou,Daqingpi,ChunqiusijihongandYidianhonginthegreenhouse.AmassofdsRNAswereisolatedfromtheleaftissuesofsixcultivarsrespectively.ThenthedistributionofdsRNAesinallsixradishcultivarswasdiscussed.ThepurposeofthisinvestigationistoinvestigatethethreedsRNAbandswhichrangefrom3.0to4.0kbandwidelyexistR.sativuscv.Duanye13.ThentheentirelengthofthesethreedsRNAbandswasdeterminedbyusingthemodifiedsingleprimeramplificationtechnique(M-SPAT).SequenceysisrevealedthatthethreedsRNAsegmentshaveuniquesequenceswiththesizesof3638,3517and3299bprespectively,andthennamedRasCV1-R1,R2andR3accordingtotheirdecreasingsizes.Multiplealignmentofthethreenucleotidesequencesrevealedthattheir5-and3-UTRssharedhighlysimilaritiesandhadconservedterminalstretchesofGAUAAAAandAUAUAUUUGUCrespectively.RasCV1-R1cDNAcontainsasingleORFfromntpositions107to3523encodingaproteinwithamolecularmassof131kDa,consistingof1139aminoacid(aa)residues.BLASTPsearchesshowedthatithashighsequencesimilaritywiththeRdRPsencodedbyChryso ,andsharestheeightconservedmotifswhicharecharacteristicsofviralRNA-dependentRNApolymerases(RdRPs)ofmycoes.Thesecondgenomecomponent(R2)ofRasCV1wascomprisedof3517bp,andinonestrandshowed5'-and3'-UTRsof129and82ntrespectively,flankinganORFpotentiallyencodingaproteinof1102aawithacalculatedmolecularmassof124kDa.BLASTPsearchesofthededucedaminoacidsequencesofdsRNA2ORFshowedthatitalsohashighsequencesimilaritieswiththemembersofthefamilyChrysoviridae.MultiplealignmentsofCPsequencesofdsRNA2-encodedandtherelatedmembersofthefamilyChrysoviridaerevealedthatallrelatedsimilaritysequenceswerelimitedtotheN-terminalhalfoftheproteins.Sequence ysisofRasCV1dsRNA3cDNArevealedthatcontainsasingleORFfromntpositions134to3122.Aproteinwithamolecularmassof109kDawascalculatedfrom996aminoacidresiduesencodedbythedsRNA3ORF.BLASTPsearchesofthededucedaminoacidsequencesoftheproteinsencodedbydsRNA3ORFshowedthatithassequencesimilaritieswiththeproteasesequencesofthemembersofthefamilyChrysoviridae,andcontainsthefourconservedmotifswhichareconstitutionsofthesuperfamilyofOTUprotease.ThephylogeneticysisofallavailablechrysoesrevealedthatRasCV1togetherwithAmaCVmayformedanewtaxoninfectingplants,whichiscloselyrelatedtorepresentativechrysoinfectingfungi.-likeparticles(VLPs)wereisolatedfromtheleaftissuesofR.sativuscv.Duanye13byusingthemethodofCsCl-densitygradientcentrifugation.Thebuoyantdensitiesofisometricparticles(~35nmdiameter)containingthesethreedsRNAsinCsClrangedfrom1.37to1.40gcm-3.ThegenomeoftheVLPssharesthecommonsizewiththedsRNAsfromtheleaftissues.TheviralgenomicRT-PCRandnorthernhybridizationfurtherconfirmedthatthethreedsRNAswereindeedoriginatedfromthe.ThenthesegmentationphenomenonofCPisfurtherdiscussed.Inconclusion,wefirstreportthecompletenucleotidesequencesofanewchrysowhichwasisolatedfromtheseed-bornplantandfurtherdiscussitspossibletaxonomicstatus.:Raphanussativus,double-strandedRNA,Chrysoviridae,Raphanussativuschryso1摘 第一章文献综 dsRNA整体科(Totiviridae)概 双分科(Partitiviridae)概 双分科研究进 双分科组的三分体现 产黄青霉科(Chrysoviridae)产黄青霉科研究进 产黄青霉科多组分现 获得dsRNA全组序列的方 单引物序列扩增 FLAC 研究背景、内容及目 研究背 研究内 研究目 第二章6个萝卜品种中dsRNA检 材料与方 实验材 酶与试 萝卜种 萝卜叶片组织dsRNA的大量提 DNaseⅠ消化处理 结果与分 萝卜叶片组织中提取dsRNA电泳检 DNaseⅠ消化处理dsRNA结果分 小结与讨 第三章短叶十三萝卜中dsRNA的cDNA克 材料与方 实验材 酶与试 dsRNA纯 M-SPAT合成dsRNA片段对应的 cDNA的克 重组质粒的分 结果与分 dsRNA条带的回收与M-SPAT结 阳性克隆筛选质粒鉴定及酶切鉴定结 序列测 小结与讨 第四 短叶十三萝卜中组分析以及特征鉴 材料与方 实验材 酶与试 序列分 短叶十三萝卜叶组织中样粒子提 样粒子电镜观 SDS检测外壳蛋 从样粒子中提取 RT-PCR检测 组Northern杂交验 结果与分 核苷酸序列分 序列编码蛋白分析 特征鉴 小结与讨 总结与展 参考文 附录：重要溶剂配 第一献综dsRNA自然界中，大分子量的sNA通常以两种形式存在。一种是以的组形式存在，通常称之为sNA，这类的组有的由一条sNA片段组成，有的则是由多条sNA片段组成[]。另外一种是sRNA在寄主体内过程中的(rpiateermedae,I)形式[,3]。近年来人们陆续发现，这种大分子量的sNA在自然界分布跨度大，广泛存在于哺乳动物、无脊椎动、物、菌细菌及生动中[]。目前已知的sNA的划分为9个科属：呼肠孤科(eovrda)、NA科(rnavrda)、减毒科(Hypordae)、囊状噬菌科(ysovrdae)、整体科(vrda)、双分科(arivrdae)(Chrysovrde)和内生NA属(ndorna)以及最近新划分出的小双NA科(icobrnvrade)[,4。其中，呼肠孤科、RNA科、减毒科均可对寄主造成严重的危害[7]。而已报道的整体科、双分科、产黄青霉科和内生NA属以及最近新划分出的小双NA科绝大多数对寄主均表现无明显致病力[14。近年来科研工作者们通过对dsRNA粒子的研究发现，这些颗粒中不仅存在高度保守的RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase，RdRp)，而且还发现颗粒内具有内源性mRNA转录的特性，即利用自身编码的酶类行使转录起始、延伸以及新生mRNA的释放等功能[15-18]。其的一般过程为：在病毒粒子或粒子白中，以dsRNA为模板转录成(+)链RNA分子，(+)链RNA分子从颗粒中释放至寄主细胞质中，并作为mRNA翻译产生的结构和功能蛋白，随后(+)链RNA分子被包被成为新的颗粒或亚粒子；在新生的颗粒或亚粒子中，再以(+)链为模板(-)链形成新的dsRNA[17,19-21]整体科(Totiviridae)概整体科包含四个属，分别为贾第鞭毛虫属 属 )，单分属 )以及 [1,4]。前两个即贾第鞭毛虫属和利什曼原虫属的一般侵染原生动物，后两个属即单分属和cori面在3040m的sRN段组成[]。目前该科组sNA长度在46kp-70kp之间，包含两个单独的开放阅读框(enradngfae,O)ORF编码的NA聚合酶(Rp),较小的OF编码的衣壳蛋白(oatrti,CP)[23-25]目前已的整体科的RNA聚合酶有两种转录机制，一种是通过核糖体的移码(ribosomalframeshifting)机制，形成RdRp和CP的融合蛋白[1,5]。以这种机制进行转录的代表是酿酒酵母L-A(Saccharomyces L-A，ScV-LA)以及侵染原生动物的[20,26,27]。另外一种是核酸内部存在两个大的开放阅读框，单独起始合成RdRp和CP。这种转录机制主要存在于单分属以及长蠕孢霉190S(Helminthosporiumvictoriae190S，Hv190SV)[28-30]中。最道的单分是酿酒酵母-A(Sachamycesceesae-AcA)酵母(Sachamycescevsae)中存在一种能够分泌毒素蛋白抑制或杀死敏感细胞的现象，并从中分离出一种正二十面体的真菌，其组由一段未分段的sNA片段组成，类似组现象在酿酒酵母-BC中也曾分离到[0,27,31]。随后研究者们从玉米植株中分离到大小在3040m之间球形的玉米瘤黑粉菌H1(UsagomaydsH1)粒子，研究其基因组发现由一段未分段的sNA片段组成[,7段sNA组的命名为单分。此外，研究发现编码毒素蛋白的为一小段sNA(-dsNA),该sNA在寄主体内的以及包装形成完整粒子都是依靠单分协助完成的[,9。最早期的研究是通过电镜观察样粒子结构。1974年，Molyneux在白蛉传代的8株草地利什曼原虫(Leishmaniahertigi)中，观察到样粒子VLPs)。而且这些VLPs主要存在于细胞浆内，直径在55-60nm，可长期传代培养，不影响白蛉虫的培养，也不无VLPs的利什曼原虫[9]。此后的研究中，他们又在蓝氏贾第虫(Giardialamblia)中分离到了Giardialamblia 第虫)，此组为7.0kb大小的单分子dsRNA，无蓝氏贾第虫株系，被归类到整体科贾第虫属[10,11]。随后Johnston 虫(Babesiabovis)中发现了组为5.5kb的dsRNA——Babesiabovis(BBV)，研究发现粒子直径约为38nm的球形。之后人们又在较为高等的水生动物体内发现了与整体科关系较近的dsRNA[12,13]。最近,人们陆续地从植物中分离出与单分科非常相近的dsRNA,该类的组组成与单分科类似，主要是通过核糖体的移码突变机制翻译形成RdRp和CP的融合蛋白[14]。最早发现并这类的是Sabanadzovic等人，他们从温室种植的番茄植株分离出来一段3.5kb的dsRNA片段，命名为南方番茄(STV)。序列分析发现该的组包含两个大的ORF，靠近5'端的第一个ORF编码包含377个氨基酸的未知功能蛋白，ORF2编码的RdRp,序列分析显示该蛋白序列包含3个已的RdRp的保守区域，同时分析显示该可能是通过+1方式的核糖体移码机制转录。遗传进化分析揭示STV与单分科的亲缘关系最近,但构成一个新的分类单元[15]。之后在蚕豆中也有这种类似的，命名为蚕豆潜隐M(Viciacryptic VCV-M),VCV-M全长3434bp，组包含一条未分段的dsRNA，序列分析显示VCV-M具有与STV类似的组成以及通过相同的机制转录，遗传进化分析显示与STV的亲缘关系最近，并构成整体科中一个新的分类单元[16]。的在蓝莓中也发现大量存在的单分科，该对寄主不成任何致病力，即不造成寄主表型的改变，因此命名为蓝莓潜隐(Blueberrylatent,BBLV)。BBLV的组由一条dsRNA组成，全长3431bp,包含两个大的ORF,其机制与STV类似，通过+1方式的核糖体移码机制转录[17]。遗传进化分析表明BBLV与STV、VCV-M构成整体科中一个新的分类单元。又与双分科的亲缘关系最近，遗传进化分析推测双分科可能是由类似BBLV、STV与VCV-M这类进化而来，而且这类构成整体科中一个新的分类单元[17]。双分科(Partitiviridae)概双分科(arivrdea)由三个属组成，即α潜隐属(phacryo)、β潜隐属(eecrypo)和双分属(ari)8]。α潜隐属和β潜隐属成员的自然寄主为植物。两个属的主要区别在于粒子的大小以及组的大小：phacrpo成员的粒子直径约为30m，组为sNA度14kp–20kpeecrypo成员的粒子直径约为38m，组长度在21kp23kp之间[]。双分属的自然寄主是真菌，粒子的特征以及组的大小都与α潜隐属和β潜隐属的相类似。双分科的组通常由两条大小相近的sNA组成，每条sNA都拥有一个单独的开放阅读框，且各自编码一种蛋白。较大的sNA编码的Rp，较小的sNA编码的[9,20。此外，某些除了包含两条完整的组sNA分的efecveNA与卫星NA(saleNA种NA的依赖于组sRNA的协助1,12,45]。此外，有发现某些双分组包含三条大小相近的sRNA，且第三条sNA与efecveNA以及alteNA的基因功能完全不同，有分析认为第三条sNA可能编码CP蛋白，是原P蛋白的一种突变体形式9,16,46条sNA序列可能是由双分科第二条组序列突变而来的[1，具体制尚待深入研究。双分科在寄主中含量低，通常不会引起寄主明显的表型改变等状。该科的寄主主要为植物和真菌，据此分为植物潜隐与真菌[8]。植物潜隐分为α潜隐和β潜隐，这两个属的通常是经由花粉或者母系植株传递给子代[2]。也可以通过在寄主体内的细胞方式进行[3]的行目前为止还没有任何证明这两个属间能通过花粉相互。由于它们在寄主中含量较低，很难通过对汁液提取物进行负染来观察1]，因此对植物潜隐的检测只能依赖于对sNA序列的研究、粒子提取观察以及免疫学等方法。真菌的途径一般不通过自然的媒介，主要通过菌丝的接合和异核化实现横向，通过孢子的成熟释放实现纵向，并且不存在独立于寄主细胞之外的时期18真菌共同复合侵染同一寄主的现象[20]双分科研究进19uen等人从7状究发现这种粒子不能给其它植物，而且始终都存在于甜菜及其后代中[4。197年，Kasans等人提取并纯化了这种粒子并命名为甜菜潜隐(etrypc,BV)[5,26现V在植株中的含量约为1g，为球状，直径大约为30m。随后，ro等人在康乃馨中也发现了这种潜隐性的病该为sNA隐arainrypc,arV)[254病、白三叶草、萝卜、菠菜、蚕豆、梨、红辣椒以及野蔷薇等植物的潜隐研究发现这些的组均为sNA[459三种以上的潜隐[1隐与菌中也发现并分离出类似的潜隐。最道的真菌潜隐是knsoneahypxyonAV)该从丝状真菌knsoneahyoxyon研究发现AV的组由三条sNA片段组成，最大的片段即sRNA1编码的RpsNA2编码P，第三条片段与sNA1和sNA2非常相似，但没有OF，不能编码蛋白，分析很可能是的a lesNA[7。之后Ngawa等人从真菌usarumsoai.sp.obnae隐病毒的组由两条sRNA片段，最大的sRNA片段编码的RRp，另一条较小的片段编码的P为usarumsoai (uoV)28人分其了大量研究[9隐菌出的能物过程中将自身的传染到寄主植物细胞[0隐菌模糊关系还需进一步的研究界定。双分科组的三分体现经典的分科的常是由大小相近的dsRNA段组，每条dsA片都含一个的开放框(OF)且只编种蛋白大的dsNA编码的，较小的dsNA编码的P外，某些除含有两整的组dsRNA外，还有部分组序列的dfeciveRA和RA(sa lieRNA，这两种RA的于组dsNA的协助[18]。近来有发现某些双分科的组由三条大小相近的dsRNA片段组(表1.1)数条dRNA片的长度过了1000，排除了为RA的可能21]而第条片段各自的dsNA1dsRNA2无明显同源性此初步了第三为defetveRNA可能性两条dsRNA片段分码的dRp和，有分现第三条RNA编码的蛋白序列与CP的同源性很高，推测可能是CP的突变体[20]。205年，Guo等人首次从真菌oryonaana(ear)et.(orysiereaers中分离到一种三分体的sNA体分sN172p156p以及132p31]。其中sNA1编码的RRp，sNA2编码P，sNA3与sNA2大小相差仅200p，之间的序列同源性很高，分析可能编码P。此后Taeaks等人首次了在智利草莓中分离到一种三分体的sNA该隐(ragarachoessrypc ，CV[2]。研究发现CV属于双分科，其组包含三条大小相近的sNAsNA1编码的psNA2编码sNA3知功，序显示列的编码是高的。en等从带有黄边症状的一点红萝卜叶片组织中提取到4条大小在15～20kb的sNA条带，克隆后分析显示包含5条大小在1480～1900p的sNA条隆a1(1866)as2(1791p)asR3(1717bp)，RasR4(1521bp)，RasR5(1486bp)[20]。依据组结构分析，推测RasR1与RasR2共同包裹形成一个完整的，即为Raphanussativus1(RasV1)，生物信息分析显示RasR1编码的RdRpRasR2编码的CP。此外推测RasR3、RasR4以及RasR5共同组成另一个完整的，即为Raphanussativus2(asV2)，aR3编码该的Rp，aR4与aR5编码该的P。之后i从一点红萝卜中又分离出来另外一条sNA条带，命名为aR6，该片段长度为1778p,序列分析显示aR6可能编码的P，对aR6与asR1的序列进行同源比较时发现它们的非编码区都存在一定的序列保守性，同时发现asR6与asR2序列非编码区的同源性最高，因此分析aR6与RasR1、aR2共同包裹于同一个中，即共同组成asV[3]。随后aem等人从野蔷薇中具有矮化症状的植株中分离出来一种新的sNA，命名为seutforarypc(CV),序列分析发现CV包含三条序列大小相近的sN段，三条序列分别为sNA1(1762p)sNA2(175p)以及sNA31384p)[4sNA1编码Rp,sNA2编码PsRNA3编码未知功能蛋白。序列比对分析发现三条sNA序列的非编码区相当保守，而且同源性很高，遗传进化分析显示CV与aV2居于同一分类单元35。aanazoic等人从玫瑰中分离出一种三分体的双分，命名为serypc1(R1)，三条sRN段的大小分别为170p、1500p以及100p。最大的片段即sRNA1编码Rp，sNA2与sNA3编码的蛋白序列很相近，分析两者可能共同编码的P。遗传进化分析显示1与aV2、CV居于同一分类单元[0,64,65已分α潜隐属，β潜隐属暂无1]。同时双分中三分体产生的机制还有待于进一步研究，相信这种三分体现象的产生机制可以很好的解释双分的进化过程。表1.1双分组多组分现Tab1.1Thephenomenon ponentsingenomeof 名 缩

(登录号

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(登录号 Fragariachiloensiscryptic

1792bp,RdRp 1566bp,CP 1566bp,CP? 1734bp, 1465bp, 1479bp,1575bp,1522bp,1575bp,1522bp,1749bp,1485bp,1446bp,1762bp,1475bp,1384bp,Rosecryptic RCV-Rosemultiflora Raphanus 1866bp,1791bp,1778bp,1717bp,1521bp,1485bp,Raphanus 产黄青霉科产黄青霉科目前只包含一个属，即产黄青霉属(Chryso),目前已的该属主要侵染真菌[36]。属内确定成员4个，包括Penicilliumchrysogenum(PcV)、Penicillium pactum(PbV)、Penicilliumcyaneo-fulvum(Pc-fV)和Helminthosporiumvictoriae145S Chryso的粒子为球状，直径35-40nm，在氯化铯密度梯度中的范围为1.37-1.40gcm-3，组由4条单独包裹的dsRNA片段组成，片段大小在2.4～3.6kbp之间，最大的片段即dsRNA1编码的RdRp，dsRNA2编码CP，dsRNA3与dsRNA4的大小相近，编码未知功能蛋白。四条序列的5'非编码区与3'非编码区都是高度保守的。的dsRNA3或者dsRNA4所编码的蛋白与OUT蛋白酶(OvarianTumorprotease)高度同源，此外dsRNA4或者dsRNA3编码的蛋白的N端区域与其对应的dsRNA1编码的RdRp的N端区域是高度保守的[1,4,8,66]。产黄青霉科研究进20年，Jag等人从工业生产青霉素的青霉菌株系中分离出一种sNA病毒，并且第一次在分子水平上对该进行了研究37]。该粒子结构为球形，直径为3540m现的4条单独包裹的sNA片段组成，命名为encumchrysgeum (cV)。4条sNA片段大小分别为3562p、3200p、276p、292p，sNA1编码的RRp，sNA2编码的C,sNA3与sNA4编码的未知功能蛋白，其中sNA3编码的蛋白的N端区域与Rp的N端区域是高度保守的，sNA4编码的蛋白认为是病毒包裹的最小蛋白，该蛋白与OT蛋白酶高度同源，推测该蛋白可能具有蛋白霉科中bV与c-fV在分子水平上进行研究，只是提取粒子观察以及组提取之后电泳检测分析，组均由4条sNA片段组成，但被划分为单分科30]。H145V是从植物致病菌Hemnhospormvcorae发现该对寄主真菌无明显的表型影响，克隆显示组也是由4条单独包裹的sNA条sNA片段编码的蛋白功能与cV分为双分科成员1,13,67。cV的发现为后来的分类奠定了分子基础，因此鉴于H145V与cV特殊的组组成，国际分类将这种多组分的sNA划分为一个新的科，即产黄青霉科[,38。随后vei等人从樱桃植株上具有镍锈斑症状的叶片上提取并分离到一种sNA，命名为erryhorocrutyptasoiaedhryso(CCRSV)和Amayaherryseaeasocaedhrys(AD)现CCSV和CDV之间序列相差不大为同一种[9]该的条sRNA片段组成，最大的序列长度为399p,最大的OF编码的Rp，其余序列大小分别为3125p、233p以及249p，分别编码的P、推定的蛋白酶以及未知功能蛋白。起初vei等人认为的寄主可能为某一种真菌，便试图从病变的植物叶片组织中分离培养这中细菌或者真菌，但始终没有分离出来。最终他们认为植物的病变可能由植物组织中类似于样粒子造成的，最后考虑从植物叶片组织中提取到的组进行研究。结果显示产黄青霉科也可能存在侵染植物的可能。209年，Km等人从真菌ryphneranschkei的四种不同株系中分离出4种产黄青霉科，序列比较分析显示4种不同株系携带的序列之间相似性很高，编码Rp的4条序列以及编码P的序列之间的一致性分别在98100%以及95100%之间，所以推测4种不同的真菌株系携带同一种40。Jaal等人对医院及诊所环境中分离出的390种烟曲霉(spegusumgau)提取sNA61%的烟曲霉普遍携带条sNA其暂命名为spegusumgaushryso (fuV)[1]。其组编码的蛋白与cV以及ADV与cV以及CDV的分类地位相同。200年，Uaama等人从水稻的中分离出一种真菌，该可造成水稻枯萎以及叶片色素沉积。培养鉴定真菌为agnaprheoryze。从agnaprheoryzae中提出4条sNA354p350p374p以及3043p[2段sNA1编码RpsNA2与sNA4编码未知功能蛋白，并且NI中不存与其相似的序列片段，sNA3编码P。此外预测的P蛋白的大小与粒子的D-GE大小完全不同，分析可能是转录后加工所致。但各个组的功能与经典分类的产黄青霉完全不同。基于p的遗传进化分析显示其与之前的spergusyco1816(AV-1816),garcusbspors1(bV1)处于同一分类单元，但与经典的c以及H145V不处于同一进化地位，而是作为一个独立的分类单元存在[2。近来Darissa等人从引起真菌病害的禾谷镰孢菌(fusariumgraminearum)中分离出一种五分体的dsRNA，基于RdRp遗传进化分析显示该属于产黄青霉科[43]。其粒子为球状，直径约为35-40nm，在氯化铯中的密度范围为1.37-1.40gcm-3。该是首次的产黄青霉科的组由5条dsRNA片段组成，并且具有特殊的分类地位，可能作为一个新的分类单元存在。同时Melzer等在红掌中分离出一种三分体的产黄青霉，根据其引起症状命名为红掌花叶(Anthuriummosaic-associated)[44]。红掌花叶的发现进一录组的已经完成，序列分析时发现它的一段mRNA(GeneBank登录号：EZ166880.1)编码的蛋白序列与青霉中PcV以及Hv145SV等的一段OUTmRNA序列可能不是青蒿转录组片段，而是某一种产黄青霉科组的一部分。产黄青霉科多组分现PcV与Hv145SV是产黄青霉科的代表毒，主要侵染真菌，粒子为球状，直径在35-40nm之间。的组由4条单独包裹的dsRNA片段组成，大小范围在2.4-3.6kbp之间[1,36]。近Darissa等在禾谷镰孢菌中分离出来一种产黄青霉(Fusariumgraminearummyco-China9,FgV-ch9)，研究发现FgV-ch9的组由5条dsRNA片段组成，大小分别为3581bp2850bp2830bp、2746bp～3786bp以及2423bp[43]。此外Melzer等在红掌中分离出一种青霉，根据其引起症状命名为红掌花叶(Anthuriummosaic-associated)[44]。该病毒的组组成与前者都不同，主要由3条大小相近的dsRNA片段组成，分析最大的dsRNA片段编码RdRp，另外2条分别编码CP以及OTU蛋白酶。已的产黄青霉科的组信息如表1.2所示。表1.2产黄青霉科组信Tab1.2Thegenomicinformationofthemembersoffamily病毒名 缩 基因组信dsRNA1(NC_007539.1);3562bp;Penicillium

dsRNA2(NC_007540.1);3200bp;dsRNA3(NC_007541.1);2976bp;tentativeproteindsRNA4(NC_007542.1);2902bp;tentativeproteasedsRNA1(NC_005978.1);3612bp;RdRp

Hv-

dsRNA2(NC_005979.1);3134bp;dsRNA3(NC_005980.1);2972bp;tentativeproteasedsRNA4(NC_005981.1);2763bp;tentativeproteindsRNA1(NC_009947.1);3399bp;RdRpAmasyacherrydiseaseassociatedchryso

dsRNA2(NC_009946.1);3128bp;dsRNA3(NC_009945.1);2833bp;tentativeproteasedsRNA4(NC_009944.1);2498bp;tentativeproteindsRNA1(FN178512.1);3560bp;

dsRNA2(FN178513.2);3159bp;dsRNA3(FN178514.1);3006bp;tentativeproteindsRNA4(FN178515.1);2863bp;tentativeproteasedsRNA1(HM004067.2);3594bp;RdRp chryso1

dsRNA2(HM004068.2);3313bp;dsRNA3(HM004069.2);2983bp;tentativeproteindsRNA4(HM004070.2);2932bp;tentativeproteasedsRNA1(GQ290649.2);2978bp;RdRp chryso1bs122

CnV-

dsRNA2(GQ290645.2);2980bp;dsRNA3(HM013825.1);2552bp;tentativeproteindsRNA4(HM013826.1);2960bp;tentativeproteasemosaic-associated

dsRNA1(FJ899675.1);3550bp;RdRpdsRNA2(FJ899676.1);3448bp;CPdsRNA3(FJ899677.1);3244bp;tentative chryso1

dsRNA1(JQ045335);3638bp;RdRpdsRNA2(JQ045336);3517bp;CPdsRNA3(JQ045337);3299bp;tentative chryso1

FoCV-

dsRNA1(EF152346.1);2574bp;RdRpdsRNA2(EF152347.1);648bp;CPdsRNA3(EF152348.1);994bp;tentative

dsRNA1(GU108588.1);2879;dsRNA1(HQ228213.1);3581bp; myco-China9

FgV-

dsRNA2(HQ228214.1);2850bp;tentativeCP?dsRNA3(HQ228215.1);2830bp;tentativeCPdsRNA4(HQ228216.1);2746bp;unknowfunctiondsRNA5(HQ228217.1);2423bp;unknow dsRNA1(NC_014462.1);3554bp; dsRNA2(NC_014465.1);3250bp;tentativeproteindsRNA3(NC_014463.1);3074bp;tentativeCP?dsRNA4(NC_014464.1);3043bp;tentativeCPdsRNA1,L1(X94361.1);3396bp;RdRpAgaricus

dsRNA2,L3(D10830.1);2778bp;tentativeCPdsRNA3,L5(X94362.1);2455bp;unknowfunctiondsRNA4,M2(D10828.1);1307bp;unknowfunctiondsRNA3(FR750563.1);3485bp;RdRp

dsRNA4;~3400bpdsRNA5;~3200bpdsRNA6;~3100dsRNA1(EU289896.1);3440bp;

dsRNA2;~2000bp~3400bpdsRNA3;~2000bp~3400bpdsRNA4;~2000bp~3400获得dsRNA全组序列的方自然界中大部分的组都是以dsRNA的形式存在，而且自然界中所有的ssRNA在的过程中也会产生dsRNA的。因此通过提取分析dsRNA来诊断和研究新，从而为研究的机制奠定基础。目前以dsRNA为模板获得未知RNA的组全序列的前提是如何获得该病毒序列cDNA。目前用的最广泛的有以下几种方法：随机引物PCR随机引物R是指利用随机的引物以DNA或NA为模板进行R扩增获得目的片段的方法。该方法最早用于构建DNA文库，随后在随机引物的设计上进行了改进，用于sNA以及sNA序列的扩增[649]rousard等利用改进的机引物R方法扩增组NArier1rmer1的3'端添加了一段随机的六聚体引物，以sRNA为模板，反转录获得DNA第一链，接着进行Keow反应合成DNA第二链，最后在rier1以及DNA聚合酶的作用下R扩增出真个片段。该方法灵敏度很高，可以扩增浓度低至1g此后arquxz等人利用随机引物R的方法扩增出sNA的全组，从而证明了该方法的实用性。单引物序列扩增单引物序列扩增法，即ST(ngermermpifcaonhiue)。SPT方法最早是在添加oy(A)尾方法的基础上进行改进的，即先在sRNA的3OH端加上一段3端被氨基封闭了的DNA寡核苷酸接头(rmerA)DNA寡核苷酸序列rierB进行反转录，获得DNA-NA的杂合双链；多条杂合双链同时进行变性、复性、延伸，可获得两条互补的双链DNA；接着以此双链DNA为模板，rmerB为引物，进行单引物CR扩增获得DNA产物，将扩增获得的DNA产物连接到适宜的载体上，进行克隆45,46。该方法最早由abdenT方法最适宜扩增的序列长度为2–25k[0,5254rde等对T3kb的sNA片段，但是效率不高[7。但是该方法依然是目前最常用的获得sNA全组的方法之一。FLACAC，即u-leghapfcainfDNAogeer等人提出的，基于ST方法的基础上，设计了一个acorrier引物，该引物的3'端被氨基5'T4NA连接酶的作用下将该引物连接到sN的3OH端48,49DNADNAcoRI,maIXaI以及amHI酶切位点的引物进行DNA法基(MOH)或者二甲基亚砜(DSO)降低变形温度，防止片段因温度过高而断裂。此外R扩增过程中使用保证性聚合酶也是很关键的。此方法可以扩增长度为4-20kb研究背景、内容及研究背本2005年首先发现杭州市郊的一点红萝卜叶片普遍表现黄边症状，并从黄边叶片中提取分离到两种双分Raphanussativus 1（RasV1）和Raphanussatvus （Ras）图1.2)的均可能三条sRN，分别为RaR1RaphanussativusNA，1866bp)，RsR21791bp，RasR6bp)RasR31717bp)，RasR41521bp)，RasR51486bp)[2134] 图 一点红萝卜中RasV1和RasV2的组以及dsRNA图Fig.1.1PatternofdsRNAandthediagramofgenomicstructuresforRasV1andRasV25%polyacrylamidegelswasused,(a)LaneM:1kbDNAladder;Lane1:dsRNAsextractedfromleaftissuesofR.sativuscv.Yidianhong;(b)GeneorganizationofRasR1-6小约为1500bp左右的单一dsRNA条带，暂定名为RasV3(Raphanussativus3)，序列分析显示RasV3属于双分科[50]。其组结构如图1.3所示。 图1.2一点红萝卜中RasV3组结Fig.1.2PatternofdsRNAandthediagramofgenomicstructuresfor1%agarosegelelectrophoresiswasused,(a)LaneM:1kbDNAladder;LaneRasV3:dsRNAsextractedfromleaftissuesofR.sativuscv.Yidianhong;(b)ThegeneorganizationofRasR7and研究内6个萝卜品种在温室种植，并对其中一个品种中携带的~3500bp的dsRNA进行分子生物学研究。选取6个萝卜品种在温室种植，从叶片组织中提取dsRNA，初步分析比较dsRNASPAT方法克隆短叶十三萝卜中~3500bpdsRNAcDNA并随之分析。提取短叶十三萝卜叶片组织中的样粒子，电镜观察粒子形状，同时从粒子中提取组进行RT-PCR验证。以粒子中提取的组为模板进行Northern杂交验证利用生物信息学软件及网上数据库对序列进行分析、比较，预测的 研究目通过dsRNA诊断技术初步探索萝卜中dsRNA的生态分布情况；选取短叶十三萝卜中~3500bp的3条dsRNA条带进行研究，鉴定该dsRNA的序列。探讨分析该dsRNA的产生以及进化过程，初步确定的分类地位。第二章6个萝卜品种中dsRNA检未知sNA的检测方法主要是利用-11纤维素能在一定的浓度下特异性吸附sNA199年由orrs和Ddds等人建立起来的，并且首次从感染NA的植物和真菌组织内提取到了的sNA[1]。正常的植物组织中一般不存在大分子的sN段，研究发现提取到的sN段序列信息与NA的组信息是完全吻合的，而且这些sNA的理化性质非常稳定，同时对酶也具有一定的抗性[]。所以目前主要通过提取植物组织中的sNA来检测植物NA。目前随着sRNA的大量研究，已经建立了很多关于sNA大量提取的方法。Aukrza等人在-11纤维素亲和吸附的基础上进行了一些改进，主要减少试剂危害，尝试通过添加聚乙烯聚吡咯烷酮(VP-40)代替苯酚和氯仿抽提方法，最后成功地从植物以及真菌体内提取到sNA[2]Kapi等人重组构建了一种结合sNA的蛋白(GD4)这种方法成功地从烟草(coanabenhman)以及昆诺藜(henoodmqun)中分离出稳定存在的sN段53,54]。近来Atno等人对-11纤维素亲和吸附(orysCnere)以及酿酒酵母(Scchromycscerevsa)中大量提取sRNAsNA[5sNA基于具有黄边症状的一点红萝卜的研究背景，我们在温室选择种植了三、南畔洲、特大青头、大青皮、春秋四季红以及一点红等6种萝卜品种，观察萝卜叶片的症状表现，同时从叶片中提取sNA进行分析，初步探讨6种萝卜品种中sNA材料与方实验材短叶十三(Raphanussativuscv.Duanye13)、南畔洲(Raphanussativuscv.Nanpanzhou)、特大青头(Raphanussativuscv.Tedaqingtou)、大青皮(Raphanussativuscv.Daqingpi)、春秋四季红(Raphanussativuscv.Chunqiusijihong)一点红(Raphanussativuscv.Yidianhong)均购自于杭州市公司。酶与试NaCl、SDS、Tris-饱和酚、三氯甲烷、纤维素（CF-11，Sigma、无水乙醇、异丙醇、EDTA、β-巯基乙醇、DNaseⅠ、DNAMarkerSM0311购自Fermentas公萝卜种从杭州市公司短叶十三、南畔洲、特大青头、大青皮、春秋四季红以及一点红等萝卜，每个品种随机挑选十个于十月中下旬播种与温室中，温室的温度保持在10-30C之间，相对湿度为50-75之间。待萝卜生长到2个月大时，新鲜叶片组织提取sNA。萝卜叶片dsRNA的大量提根据dsRNA在17%乙醇浓度下与纤维素具有良好的吸附性这一特点，本文采用纤维素吸附法提取萝卜也组织中的dsRNA。具体操作步骤如下：称取5g10ml2×STEpH8.0)，1.4ml10SDS，300μlß-巯基乙醇，6ml饱和酚(pH﹥7.5)，4ml1050ml的摇管中，37304℃，15000g15min上清用无水乙醇调至含乙醇17%3g纤维素(CF-11，Sigma)，加入含17%(V/V)1×STE30372hr50ml4100ml17%1×STE420ml1×STE5ml洗脱液中加入等体积的异丙醇，混匀后-20℃沉淀304℃，15000g15min5700μl1×STE1.5ml4℃，15000g3min上清液中加入等体积异丙醇，-20℃沉淀304℃，15000g15min700μl75%乙醇洗沉淀，4℃，15000g离心5min，弃上清，真空干燥530μlddH2O5μl1%DNaseⅠ消化处理 在200μl的PCR管中加入以下反应液，体系为6 5DNaseI(RNase-free,5U/μL)0.3μlRNaseInhibitor(40U/μL)0.1μl10×DNaseI 0.6总体 6反应混合物轻微涡旋混匀后，低速离心，37℃反应30结果与分萝卜叶片组织中提取dsRNA电泳检个萝卜品种，分别从叶片组织中提取出sNA条带，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测分析各株萝卜携带sNA情况。根据对短叶十三(9株)(1株)(10株)(8株)季红(10株)以及一点红(10株)等萝卜中提取的sNA条带的琼脂糖凝胶电泳分析，所有已检测的萝卜品种中95%以上都携带带型不同的sRNA。根据电泳的初步分析，在短叶十三萝卜中主要携带~3000p-400p的sRNA条带，而且已检测的植株中75%的萝卜同时携带~1500p以及更小的sNA条带(图21a)。春秋四季红萝卜中已检测的10株中有4株同时携带~3000bp-4000bp以及~2000bp的dsRNA条带，其余已检测的6株萝卜中只携带~1500bp-2000bp的dsRNA条带(图2.1b)。大青皮萝卜中已检测的8株中有6株同时携带~3000bp-4000bp以及~1500bp-2000bp的dsRNA条带，另外2株仅携带~1500bp-2000bp的dsRNA条带(图2.2a)。南畔洲~3000bp4000bp以及~1500bp2000bp的dsRNA条带(图2.2b)。特大青头与一点红萝卜中只携带~1500bp-2000bp处的多条dsRNA条带(图2.3)。图2.1短叶十三萝卜与春秋四季红萝卜中dsRNA电泳检测结(a)短叶十三萝卜dsRNA提取电泳检测(1-9)；(b)dsRNAFig.2.1ElectrophoresisresultsofdsRNAsextractedfromtworadishcultivarsofDuanye13andChunqiusijihong.ElectrophoresisresultsofdsRNAsextractedfromRaphanussativuscv.Duanye13(lane1-ElectrophoresisresultsofdsRNAsextractedfromRaphanussativuscv.Chunqiusijihong(lane1-10).M:theDNAmolecularweightmarkerof10kb.2.2大青皮萝卜以及南畔洲萝卜中dsRNA电泳检测大青皮萝卜中dsRNA电泳检测(1-8)；(b)南畔洲萝卜中dsRNA提取电泳检测(1-10)。10kbDNAFig.2.2ElectrophoresisresultsofdsRNAsextractedfromRaphanussativuscv.DaqingpiandNanpanzhou.(a)ElectrophoresisresultsofdsRNAsextractedfromRaphanussativuscv.Daqingpi(lane1-8);(b)ElectrophoresisresultsofdsRNAsextractedfromRaphanussativuscv.Nanpanzhou(lane1-theDNAmolecularweightmarkerof102.3特大青头萝卜以及一点红萝卜dsRNA电泳检测(a)特大青头萝卜dsRNA提取电泳检测(1-9)；(b)一点红萝卜dsRNA提取电泳检测(1-10)M：10kbDNAFig.2.3ElectrophoresisresultsofdsRNAsextractedfromRaphanussativuscv.TedaqingtouandYidianhong(b).(a)ElectrophoresisresultsofdsRNAsextractedfromRaphanussativuscv.Tedaqingtou1-10);(b)ElectrophoresisresultsofdsRNAsextractedfromRaphanussativuscv.Yidianhong(lane1-10).M:theDNAmolecularweightmarkerof10kb.2.4短叶十三萝卜中dsRNA电泳检测结M：10kbDNA分子量；泳道1-6为短叶十三萝卜中提取dsRNA经6小时琼脂糖凝胶电泳结果。Fig.2.4ElectrophoresisresultsofdsRNAsextractingfromRaphanussativuscv.DuanyeshisanM:theDNAmolecularweightmarkerof10kb.Lane1-6:ElectrophoresisresultsofdsRNAsextractingfromRaphanussativuscv.Duanyeshisanaftersixhours'selectrophoresis.DNaseⅠ消化处理dsRNA结果分2.5DNaseI消化处理之后电泳结M10kbDNA分子量；1、3、5为处理之前的dsRNA，2、4、6为消化处理之后结果；78分别为消化之前的cDNA与消化之后结果Fig.2.5ElectrophoresisresultsofdsRNAsdigestedwithDNaseM:theDNAmolecularweightmarker.Lane1,3and5areundigesteddsRNAs;lane2,4and6aredsRNAsdigestedwithDNaseI.Lane7israwcDNAandlane8iscDNAdigestedwithDNaseI.对萝卜中提取的sNA用DNaeI进行消化处理，主要分析确定sRNA的性质，同时分析sNA是否存在被DNaeI消化的结果。135为DNaeI消化处理的sNA24分别为1对应的经DNaeI消化的sNA电泳图，只有sNA提取液中的植物组被消化。泳道7是扩增之后的原始DNA产物，泳道8是DNA经DNaeI消化之后的电泳结果，全部被DNaeI消化。分析以上现象显示DNaeI只消化DNA，对sNA成分没有影响。同时表明植物组中不存在类似sNA的成分。小结与讨本章主要是对6种不同萝卜品种中提取到的dsRNA电泳初步检测分析以及DNaseI消化处理分析，初步探讨萝卜植株中携带dsRNA的大致情况，为随后的通过对6种不同萝卜品种(57株)中提取的sNA电泳检测发现所有已检测的萝卜中95%以上都携带sNAsNA带型，有的植株甚至携带种以上不同的sNA~350p的sNA条带，另外春秋四季红、大青皮以及南畔洲萝卜中也携带~350p的sNA条带，但是没有短叶十三萝卜中普遍。另外在春秋四季红、大青皮以及南畔洲萝卜中除携带~350p的sNA~200p的多条sNA条带，初步分析发现这些萝卜中可能携带3种以上不同的sNA。特大青头萝卜中只携带~200p的多条sNA条带，与一点红萝卜比较发现，特大青头萝卜中可能携带不同于一点红萝卜的两种以上不同，根据sRNA条带的大小分析可能为分科。初叶三中取的3000-400p处的sNA条带电泳发现只包含两条明显的sNA条带，随后通过延长琼脂糖电泳的时间至6个3条sNA条带(图25)。根据序列的大小判断可能不是双分病毒科[8，所以引起我们进一步研究的。第三章短叶十三萝卜中dsRNAcDNA对短叶十三萝卜中的~3500bp的3条dsRNA片段进行克隆，并对获得的cDNA进序分析。本研究主要采用陈亮经过修改的SPAT方法即M-SPAT法扩增获得全长的cDNA片段。首先，合成一段20bp的单链寡核苷酸接头，其称为primerA，其序列如下：5-PO4-TCTTCGGGTGTCCTTCCTCG-NH2-3。此接头的特点是5端被磷酸化，3端被氨基化；它的序列来源于马铃薯纺锤形块茎类（potatospindletuberviroid,PSTVd）的组。这样设计有以下两个目的：1）primerA的5端primerA5dsRNA3端羟基结合；primerA的3端氨基化使得它的3端无法与模板链结合，也无法与自身结合。2rierA的序列来源于STd，且除了STd之外，没有任何已知序列与它有同源性，这样就排除了扩增目的序列时引物与非目的序列错配的可能性，从而保证了目的序列的高效特异性扩增[5,47。PrimerAT4RNA连接酶与T4DNA连接酶的作用下连接到dsRNA片段的3末端。其后DNA聚合酶将模板dsRNA的末端补平，然后在反应体系中加入DMSO99℃使dsRNAprimerA序列互补的primerB即（5-CGAGGAAGGACACCCGAAGA-3）primerB为下游引物，RT合成DNA-RNA的杂合体；再以primerB为上下游引物，以DNA-RNA杂合体中的DNA链为模板进行PCR反应，至此完成目的序列cDNA扩增产物的，将扩增产物连接于pGEMT-easy载体上。经氨苄抗性以及蓝白斑初筛得到的阳性克隆采用通用引物进行PCR鉴定。材料与方实验材 酶与试T4RNAligase、T4DNAligasepGEM-TeasyVector载体试剂盒购自Promerga公司；M-MLVReverseTranscriptase、LATaqpolymerase、rTaqpolymerase、感受态细胞DH5α(部分自己)、EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶购自TaKaRa公司；PCR产物清洁试剂盒和DNA凝胶回收试剂Axygen公司；氨苄青霉素(Amp)购自生物工程公司。dsRNA纯将短叶十三萝卜中提取到的~3500bp的3条dsRNA片段割胶回收，将两条较大的dsRNA片段一起割胶回收，另外最小的一条dsRNA片段单独回收纯化。回收纯化操作参见AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒使用说明书，具体步骤如下：紫外灯下切取含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶,置于1.5ml的离心管(预(100mg＝100µl)；3倍体积的DE-A溶液，756-8min,中间每2min混合一次，加入1/2体积DE-A溶液的DE-B将上述混合溶液转移入DNA管(置于2ml离心管中)中，12000离心1min,弃溶将DNA管再次置入2ml离心管中，加入500µL的W1溶液rpm离心1min，弃溶液将管放回离心管，加入700µl的W2溶液，120