CRISPR-Cas英教学讲解课件

CRISPR/Cas9系统及其应用CRISPR/Cas9系统及其应用CRISPR-Cas系统简介CRISPR-Cas系统作用机理CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建载体构建、导入目的生物或细胞系、筛选CRISPR-Cas9系统的应用CRISPR-Cas9系统的不足之处提高打靶特异性的策略小结CRISPR-Cas系统简介1CRISPR-Cas系统简介1.1CRISPR-Cas系统的来源

成簇规律间隔短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）。CRISPR/Cas系统是一种广泛存在于细菌与古细菌中的，由RNA介导的、可遗传的获得性免疫系统。1CRISPR-Cas系统简介1.2

CRISPR-Cas系统的研究历史1987年，日本课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列2005年发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遗传物质的入侵。2007年，Barrangou等首次发现细菌可能利用CRSPR系统抵抗噬菌体入侵；2008年，Marraffini等发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR系统的功能2013年初，MIT

的研究组首次利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞EMX1

和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞Th基因实现了定点突变。同年Mali利用CRISPR/Cas9在人293T细胞和K652细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA修复机制高效介导外源基因定点插入。1.2CRISPR-Cas系统的研究历史1.3

CRISPR-Cas系统的结构CRISPR-CAS系统的组成主要包括:由不连续的重复序列R(repeat)与长度相似的间区序列S(spacers)间隔排列而成的CRISPR簇，前导序列L(leader)以及一系CRISPR相关蛋白基因cas。

1.3CRISPR-Cas系统的结构CRISPR-C

1.4

CRISPR-Cas系统的类型CRISPR/Cas系统有3种类型，其中，产脓链球菌的TypeⅡ型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶，已经在人类细胞、小鼠、斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰，目前被广泛应用于真核细胞的基因组编辑中。Ⅱ型CRISPR/Cas系统包含3个主要基因位点:编码相关蛋白的位点（Cas9、Cas1、Cas2、Csn2），编码含重复片段的小RNA位点（CRISPR位点）和1个辅助小片段RNA(tracrRNA位点)。1.4CRISPR-Cas系统的类型CRISPR/Cas2CRISPR-CAS系统的作用机理2.1适应：间隔序列的获得当外源DNA片段入侵后，CRISPR/Cas识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的PAM（NGG序列），将临近PAM

的序列作为候选protospacer，然后在CRISPR基因座的5'端合成重复序列，再将该DNA的1个片段(约20bp)整合到两个重复序列之间，从而使得菌体拥有“记忆”。2CRISPR-CAS系统的作用机理2.1适应：间隔序2.2表达：表达并加工CRISPR

CRISPR区域首先转录成前体RNA(pre-crRNA)，之后被Cas蛋白剪切成更小的crRNA，即成熟的crRNA，包含1个间隔序列和部分重复序列。同时，tracrRNA

也会被转录并和crRNA形成一种双链的RNA结构，再与Cas9蛋白组成具有DNA内切酶活性的复合物。2.2表达：表达并加工CRISPR

CRISPR区2.3干扰:干扰入侵核酸

复合物在crRNA的引导下，由Cas9

蛋白的核酸结构域对外源DNA分子进行切割。

首先RNA/Cas9复合体沿外源入侵DNA进行扫描，当遇到PAM序列且DNA序列可与crRNA互补配对形成一个R环时，Cas9蛋白将分别利用HNH与RuvC结构域对DNA的互补链与非互补链进行切割，而形成DNA的双链断裂。2.3干扰:干扰入侵核酸

复合物在crRNAPAM（Protospaceradjacentmotif）

在嗜热链球菌中，PAM序列多数为5‘-NGG，而5’-NAG虽然效率低一些，但也可用于靶DNA的定位，可扩展在基因组编辑中靶DNA的选择范围。介导切割效率依次为：NGG>NGA>NAG人类基因组中每8bp就会出现一个PAM在Ⅰ型与Ⅱ型CRISPR/Cas系统中，自身基因组CRISPR序列的下游无PAM序列，从而将自身基因组DNA序列与外源DNA序列区分开，避免自我免疫。PAM（ProtospaceradjacentmotifcrRNA

成熟crRNA可分为5’手柄、3’发卡结构和间隔序列，5’手柄具有保守性，3’发卡是核酸内切酶识别位点，5’端重复序列均质性较3’端好，其与PAMs一起保护自身CRISPR序列不被误切。crRNA末端还含有一段起“种子区”作用的序列，它决定着寻找靶基因的效率，该区域仅需1个位点发生突变即极可能无法正确识别靶基因，但在种子区外发生少量突变则不容易导致识别功能失效。CRISPR/Cas9对靶点的识别需要PAM(NGG)和靠近PAM的11bp的种子序列完全保守，14bp(PAM+种子序列)序列中的任何一个碱基突变之后CRISPR/Cas9的切割效率基本降至零。crRNA

成熟crRNA可分为5’手柄、3’发卡结构和间

tracrRNA(trans-activatingcrRNA)指导RNaseⅢ和Cas9完成前体crRNA的成熟。tracrRNA对靶点的识别和切割是必需的，tracrRNA的5'端与成熟的crRNA3'端有部分序列(约13bp)能够配对进而形成茎环结构，对维持crRNA与靶点的配对可能十分重要。

tracrRNA(trans-activatingcrRCas9蛋白

900-1600个氨基酸组成的多结构域蛋白

Cas9REC--在REC识别区中的一个富含精氨酸的α-螺旋负责与RNA-DNA异源二聚体的3‘端8～12个核苷酸的结合HNH结构域--在crRNA互补链PAM元件上游3nt处切割。位于HNH结构域的H840A突变体可导致HNH结构域的失活RuvC结构域--在非互补链PAM元件上游的3～8nt处切割。位于RuvC结构域中的D10A突变体可导致RuvC结构域的失活。（RuvC则分为3个亚结构域:RuvCⅠ位于蛋白的N端，RuvCⅡ/Ⅲ分别位于HNH结构域的两侧）PAM结合区Cas9蛋白

900-1600个氨基酸组成的多结构域蛋白

CRISPR-Cas英教学讲解课件3CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建

3.1sgRNA设计目前，大多数研究将与靶DNA互补的crRNA与tracrRNA融合为一条单独的引导RNA(singleguideRNA，sgRNA).将sgRNA设计为100nt左右，包含位于5'端20nt的DNA互补区、crRNA以及位于3'端70～80nt的tracrRNA。通常设计的sgRNA具有二级发卡结构和1条3'端尾，设计的sgRNA与靶基因有1～3个碱基错配并不影响编辑效率，但是，靠近PAM元件的12个碱基要严格配对.3CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建

3.1sgRcrRNA/tracrRNA/Cas9sgRNA/Cas9crRNA/tracrRNA/Cas9sgRNA/Cas9目前(2014.10)报道的CRISPR/Cas系统中使用的gRNA有2种结构，一种是M.Jinek等最先提出的，将一部分重复序列和一部分tracrRNA的序列直接拼接到一起形成的嵌合RNA结构。目前(2014.10)报道的CRISPR/Cas系统中使用的另一种与第一种基本相同，只是3‘端更长，添加了完整的tracrRNA序列.关于2种结构的优劣，麻省理工学院张峰研究团队做了细致的研究，他们发现，3’端越长，gRNA表达丰度越高，相应的打靶效率也越高。为了保证足够的打靶活性，推荐gRNA的3’端长度不低于67nt为好，而长度为85nt时效率最高.另一种与第一种基本相同，只是3‘端更长，添加了完整的trac在设计Guide序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果您选取的Guide序列的第一个碱基不是G，需要自行加上一个G，因为这个G对于起始转录非常重要。在线工具设计：麻省理工学院的CRISPRDesign：/德国癌症研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr在设计Guide序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果3.2NLSCas9蛋白来源于细菌，因此要让Cas9蛋白高效地转运到哺乳动物细胞核内，需要在Cas9蛋白的N端或是C端加上真核细胞的核定位信号。对于添加NLS信号的位置，目前尚存在争议。L.CONG的研究发现，在Cas9蛋白的N端和C端同时添加NLS信号最能有效的指导Cas9蛋白入核。而P.Mali等在Cas9蛋白的C端添加１个NLS信号构建的CRISPR/Cas9基因编辑系统在人类的细胞中最高可以达到25%的敲除效率，表明在C端添加１个NLS信号是足以引导Cas9蛋白进入核中的。但是南京大学的研究人员却发现，无论是在Cas9蛋白的N端添加3个还是在N端、C端同时添加SV40核定位信号均不能使Cas9蛋白进入293T细胞的细胞核中，只有在N端添加核定位信号并且在核定位信号和Cas9蛋白之间加上32个氨基酸残基的接头才能指导Cas9蛋白入核。这些不一致的结果有可能是由于各个研究中FLAG标签添加位置的不同引起的，但同时也说明Cas9蛋白在折叠过程中可能干扰了NLS信号识别。3.2NLSCas9蛋白来源于细菌，因此要让Cas9蛋4载体构建、导入目的生物或细胞系、筛选

4.1载体构建Cas9蛋白和gRNA的表达框可以分开放到2个载体上，也可以直接构建在同1个载体上，方便Cas9蛋白和gRNA的协同表达。

这2种策略各有好处。比如，构建在同一载体上有利于Cas9蛋白和gRNA的协同表达，这一点非常适合于难转染的细胞。而分开放在2个表达载体上则能更方便快速的对候选的gRNA进行打靶效率和脱靶情况的检测。构建gRNA时，只要基因的序列连接到gRNA骨架上，或者直接合成带有靶序列的gRNA再连接到表达载体上即可。4载体构建、导入目的生物或细胞系、筛选

4.1载体构4.2导入目的生物或细胞系在人工培养的哺乳细胞中，可通过电穿孔(electroporation)、核转染(nucleofection)与脂质体介导转染等方法将非自主复制的质粒DNA导入细胞中，使Cas9与sgＲNA可进行瞬时表达。慢性病毒载体(lentiviralvectors)也已用于在人类或小鼠细胞中组成型表达Cas9与sgＲNA。体外转录的ＲNA也可直接注射导入斑马鱼、果蝇或小鼠的胚胎细胞中质粒越大，成功率越低4.2导入目的生物或细胞系4.3筛选

将Cas9、引导ＲNA以及一条含有突变位点的靶DNA的同源重组修复模板共同转化到目的菌株中。若在Cas9对基因组靶DNA序列产生DNA双链断裂后，可利用导入的同源重组修复模板进行DNA修复，由于修复模板在识别互补区或PAM位点中存在突变位点而不能被Cas9再次切割，因而可存活;而未能进行同源重组修复的基因组则由于Cas9的切割降解，无法存活。利用该方法可明显提高基因组编辑后的筛选效率，且在基因组中不残留筛选标记。4.3筛选5CRISPR-Cas9系统的应用基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。通过修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因5.1CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术5CRISPR-Cas9系统的应用基因组编辑技术是一种可以例子：基因敲除的实验过程1.在靶基因序列中寻找NGG序列获得其附近20多个碱基的序列，设计出sgRNA并合成该序列2.将sgRNA及cas9基因连入载体3.转化感受态，质粒小提，测序验证4.细胞培养与细胞转染5.敲除效果检测6.建立稳定敲除的细胞株例子：基因敲除的实验过程1.在靶基因序列中寻找NGG序列获得5.2CRISPR-Cas9介导的转录抑制与转录激活

抑制：在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系统中将Cas9中的切割域突变，会使Cas9蛋白失去对ＤＮＡ的切割活性，但不影响其与ＤＮＡ结合的能力。这种失去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名为DeadＣas9。将ｄCas9与gRNA在细胞中共表达，则gRNA可以介导ｄCas9蛋白与ＤＮＡ结合。如果ｄCas9结合到靶基因的阅读框内，可阻断RNA聚合酶的延伸作用；如果ｄCas9结合到靶基因的启动子区域则可阻止基因转录的起始.5.2CRISPR-Cas9介导的转录抑制与转录激活

抑制激活：将dCas蛋白与具有转录激活的蛋白质功能域融合则可构建具有转录激活活性的CRISPR-on系统。CRISPR转录激活系统的靶序列位置对激活效率有重要影响。当靶序列与启动子的距离合适时，激活效率较高；靶序列处于启动子上游较远位置激活效率相对下降；当靶序列与启动子距离过近，或处于开放阅读框内时则会产生抑制效应。也就是说使用相同的CRISPR-on系统，不同的crRNA既可以对靶基因激活，也可以抑制靶基因表达。真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子ＶＰ16结合获得。CRISPR-Cas英教学讲解课件5.3单切口酶Cas9也可以改造成为单切口酶,只被一个Cas9n（Cas9n为D10A突变的突变体，只能切割与sgRNA直接互补的DNA单链）切割产生的单链缺口会被高保真性的碱基切除修复途径(baseexcisionrepair,BER)修复，不会在基因组DNA上造成突变。5.3单切口酶Cas9也可以改造成为单切口酶,只被一个Ca5.4利用多个引导RNA序列可同时进行基因组上多个不同位点的编辑.5.5将CRISPR/Cas9技术与成像技术结合，利用dCas9的基因组定位功能，使小鼠或人的基因组的元件可视化，用于监测活体中各元件的动态变化基因组规模的功能筛选、特定染色体位点的标记等5.4利用多个引导RNA序列可同时进行基因组上多6CRISPR-Cas9系统的不足之处脱靶效应：早期研究认为crRNA的间隔序列(spacer)与外源DNA的靶位点完全互补配对对于切割是必需的，后来的研究证明spacer与protospacer部分互补配对时切割也可以发生。CRISPR/Cas系统对打靶位点距离PAM区较远的5’区的识别特异性较低，当出现几个碱基的错配时，Cas9蛋白仍然会将序列切开，造成脱靶效应。

V.Pattanayak等的研究显示，CRISPR/Cas复合体的浓度也与脱靶效应紧密相关。当CRISPR/Cas复合体的浓度较高时，即使错配发生在PAM区内部或者靠近PAM区的位置，DNA切割也仍然会进行，而这种现象在低浓度时则不会发生。6CRISPR-Cas9系统的不足之处脱靶效应：早期研究局限性：

CRISPR/Cas9对目的序列的识别与结合必须有PAM的存在。这就使得该系统对基因组的靶向识别位点被限制在平均每8个碱基一个位点。局限性：问题CRISPR/Cas9来源于细菌，它是否会对哺乳动物细胞或个体产生毒性或是否会诱发哺乳动物细胞或个体的免疫反应？CRISPR/Cas系统是依赖ＤＮＡ复制或者转录过程将ＤＮＡ解螺旋还是本身就具有ＤＮＡ解旋能力？CRISPR/Cas9系统如何导入受体并保证CRISPR系统的组份能准确地到达DNA靶序列？如何突破PAM序列的限制、如何建立对Cas9特异性(脱靶效应)的全面评价体系、如何构建不同物种中可通用的Cas9与sgRNA导入与表达系统以及如何更有效的激活同源重组修复等。问题7提高打靶特异性的策略降低sgRNA与Cas9的浓度。这一方法的效果还有待讨论。有研究表明该方法可显著降低脱靶突变/打靶突变的比例，但也有研究称该方法将同时降低脱靶突变与打靶突变的发生。利用Cas9的切口酶突变体产生DNA单链断裂。因为与DNA双链断裂相比，DNA单链断裂将诱导保真性更高的碱基切除修复。7提高打靶特异性的策略降低sgRNA与Cas9的浓度。麻省理工学院张峰实验室的一种提高CRISPR/Cas系统特异性的新思路。他们开创性的提出，将突变的只能在双链DNA上形成缺口的Cas9n蛋白（Cas9n为D10A突变的突变体，只能切割与sgRNA直接互补的DNA单链）配对使用，同时切割双链DNA的正负链，形成５′端突出的双链缺口。这一方法可以降低脱靶率50～1500倍，同时不影响基因敲除效率。麻省理工学院张峰实验室的一种提高CRISPR/Cas系统特异8小结设计和构建方法简单快捷，成本低廉。基因编辑效率优于ＺＦＮｓ和ＴＡＬＥＮｓ系统。可同时实现多个基因的打靶。可以方便快捷的改造为基因表达调控工具。

8小结设计和构建方法简单快捷，成本低廉。CRISPR/Cas9系统及其应用CRISPR/Cas9系统及其应用CRISPR-Cas系统简介CRISPR-Cas系统作用机理CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建载体构建、导入目的生物或细胞系、筛选CRISPR-Cas9系统的应用CRISPR-Cas9系统的不足之处提高打靶特异性的策略小结CRISPR-Cas系统简介1CRISPR-Cas系统简介1.1CRISPR-Cas系统的来源

成簇规律间隔短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）。CRISPR/Cas系统是一种广泛存在于细菌与古细菌中的，由RNA介导的、可遗传的获得性免疫系统。1CRISPR-Cas系统简介1.2

CRISPR-Cas系统的研究历史1987年，日本课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列2005年发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遗传物质的入侵。2007年，Barrangou等首次发现细菌可能利用CRSPR系统抵抗噬菌体入侵；2008年，Marraffini等发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR系统的功能2013年初，MIT

的研究组首次利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞EMX1

和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞Th基因实现了定点突变。同年Mali利用CRISPR/Cas9在人293T细胞和K652细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA修复机制高效介导外源基因定点插入。1.2CRISPR-Cas系统的研究历史1.3

CRISPR-Cas系统的结构CRISPR-CAS系统的组成主要包括:由不连续的重复序列R(repeat)与长度相似的间区序列S(spacers)间隔排列而成的CRISPR簇，前导序列L(leader)以及一系CRISPR相关蛋白基因cas。

1.3CRISPR-Cas系统的结构CRISPR-C

1.4

CRISPR-Cas系统的类型CRISPR/Cas系统有3种类型，其中，产脓链球菌的TypeⅡ型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶，已经在人类细胞、小鼠、斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰，目前被广泛应用于真核细胞的基因组编辑中。Ⅱ型CRISPR/Cas系统包含3个主要基因位点:编码相关蛋白的位点（Cas9、Cas1、Cas2、Csn2），编码含重复片段的小RNA位点（CRISPR位点）和1个辅助小片段RNA(tracrRNA位点)。1.4CRISPR-Cas系统的类型CRISPR/Cas2CRISPR-CAS系统的作用机理2.1适应：间隔序列的获得当外源DNA片段入侵后，CRISPR/Cas识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的PAM（NGG序列），将临近PAM

的序列作为候选protospacer，然后在CRISPR基因座的5'端合成重复序列，再将该DNA的1个片段(约20bp)整合到两个重复序列之间，从而使得菌体拥有“记忆”。2CRISPR-CAS系统的作用机理2.1适应：间隔序2.2表达：表达并加工CRISPR

CRISPR区域首先转录成前体RNA(pre-crRNA)，之后被Cas蛋白剪切成更小的crRNA，即成熟的crRNA，包含1个间隔序列和部分重复序列。同时，tracrRNA

也会被转录并和crRNA形成一种双链的RNA结构，再与Cas9蛋白组成具有DNA内切酶活性的复合物。2.2表达：表达并加工CRISPR

CRISPR区2.3干扰:干扰入侵核酸

复合物在crRNA的引导下，由Cas9

蛋白的核酸结构域对外源DNA分子进行切割。

首先RNA/Cas9复合体沿外源入侵DNA进行扫描，当遇到PAM序列且DNA序列可与crRNA互补配对形成一个R环时，Cas9蛋白将分别利用HNH与RuvC结构域对DNA的互补链与非互补链进行切割，而形成DNA的双链断裂。2.3干扰:干扰入侵核酸

复合物在crRNAPAM（Protospaceradjacentmotif）

在嗜热链球菌中，PAM序列多数为5‘-NGG，而5’-NAG虽然效率低一些，但也可用于靶DNA的定位，可扩展在基因组编辑中靶DNA的选择范围。介导切割效率依次为：NGG>NGA>NAG人类基因组中每8bp就会出现一个PAM在Ⅰ型与Ⅱ型CRISPR/Cas系统中，自身基因组CRISPR序列的下游无PAM序列，从而将自身基因组DNA序列与外源DNA序列区分开，避免自我免疫。PAM（ProtospaceradjacentmotifcrRNA

成熟crRNA可分为5’手柄、3’发卡结构和间隔序列，5’手柄具有保守性，3’发卡是核酸内切酶识别位点，5’端重复序列均质性较3’端好，其与PAMs一起保护自身CRISPR序列不被误切。crRNA末端还含有一段起“种子区”作用的序列，它决定着寻找靶基因的效率，该区域仅需1个位点发生突变即极可能无法正确识别靶基因，但在种子区外发生少量突变则不容易导致识别功能失效。CRISPR/Cas9对靶点的识别需要PAM(NGG)和靠近PAM的11bp的种子序列完全保守，14bp(PAM+种子序列)序列中的任何一个碱基突变之后CRISPR/Cas9的切割效率基本降至零。crRNA

成熟crRNA可分为5’手柄、3’发卡结构和间

tracrRNA(trans-activatingcrRNA)指导RNaseⅢ和Cas9完成前体crRNA的成熟。tracrRNA对靶点的识别和切割是必需的，tracrRNA的5'端与成熟的crRNA3'端有部分序列(约13bp)能够配对进而形成茎环结构，对维持crRNA与靶点的配对可能十分重要。

tracrRNA(trans-activatingcrRCas9蛋白

900-1600个氨基酸组成的多结构域蛋白

Cas9REC--在REC识别区中的一个富含精氨酸的α-螺旋负责与RNA-DNA异源二聚体的3‘端8～12个核苷酸的结合HNH结构域--在crRNA互补链PAM元件上游3nt处切割。位于HNH结构域的H840A突变体可导致HNH结构域的失活RuvC结构域--在非互补链PAM元件上游的3～8nt处切割。位于RuvC结构域中的D10A突变体可导致RuvC结构域的失活。（RuvC则分为3个亚结构域:RuvCⅠ位于蛋白的N端，RuvCⅡ/Ⅲ分别位于HNH结构域的两侧）PAM结合区Cas9蛋白

900-1600个氨基酸组成的多结构域蛋白

CRISPR-Cas英教学讲解课件3CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建

3.1sgRNA设计目前，大多数研究将与靶DNA互补的crRNA与tracrRNA融合为一条单独的引导RNA(singleguideRNA，sgRNA).将sgRNA设计为100nt左右，包含位于5'端20nt的DNA互补区、crRNA以及位于3'端70～80nt的tracrRNA。通常设计的sgRNA具有二级发卡结构和1条3'端尾，设计的sgRNA与靶基因有1～3个碱基错配并不影响编辑效率，但是，靠近PAM元件的12个碱基要严格配对.3CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建

3.1sgRcrRNA/tracrRNA/Cas9sgRNA/Cas9crRNA/tracrRNA/Cas9sgRNA/Cas9目前(2014.10)报道的CRISPR/Cas系统中使用的gRNA有2种结构，一种是M.Jinek等最先提出的，将一部分重复序列和一部分tracrRNA的序列直接拼接到一起形成的嵌合RNA结构。目前(2014.10)报道的CRISPR/Cas系统中使用的另一种与第一种基本相同，只是3‘端更长，添加了完整的tracrRNA序列.关于2种结构的优劣，麻省理工学院张峰研究团队做了细致的研究，他们发现，3’端越长，gRNA表达丰度越高，相应的打靶效率也越高。为了保证足够的打靶活性，推荐gRNA的3’端长度不低于67nt为好，而长度为85nt时效率最高.另一种与第一种基本相同，只是3‘端更长，添加了完整的trac在设计Guide序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果您选取的Guide序列的第一个碱基不是G，需要自行加上一个G，因为这个G对于起始转录非常重要。在线工具设计：麻省理工学院的CRISPRDesign：/德国癌症研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr在设计Guide序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果3.2NLSCas9蛋白来源于细菌，因此要让Cas9蛋白高效地转运到哺乳动物细胞核内，需要在Cas9蛋白的N端或是C端加上真核细胞的核定位信号。对于添加NLS信号的位置，目前尚存在争议。L.CONG的研究发现，在Cas9蛋白的N端和C端同时添加NLS信号最能有效的指导Cas9蛋白入核。而P.Mali等在Cas9蛋白的C端添加１个NLS信号构建的CRISPR/Cas9基因编辑系统在人类的细胞中最高可以达到25%的敲除效率，表明在C端添加１个NLS信号是足以引导Cas9蛋白进入核中的。但是南京大学的研究人员却发现，无论是在Cas9蛋白的N端添加3个还是在N端、C端同时添加SV40核定位信号均不能使Cas9蛋白进入293T细胞的细胞核中，只有在N端添加核定位信号并且在核定位信号和Cas9蛋白之间加上32个氨基酸残基的接头才能指导Cas9蛋白入核。这些不一致的结果有可能是由于各个研究中FLAG标签添加位置的不同引起的，但同时也说明Cas9蛋白在折叠过程中可能干扰了NLS信号识别。3.2NLSCas9蛋白来源于细菌，因此要让Cas9蛋4载体构建、导入目的生物或细胞系、筛选

4.1载体构建Cas9蛋白和gRNA的表达框可以分开放到2个载体上，也可以直接构建在同1个载体上，方便Cas9蛋白和gRNA的协同表达。

这2种策略各有好处。比如，构建在同一载体上有利于Cas9蛋白和gRNA的协同表达，这一点非常适合于难转染的细胞。而分开放在2个表达载体上则能更方便快速的对候选的gRNA进行打靶效率和脱靶情况的检测。构建gRNA时，只要基因的序列连接到gRNA骨架上，或者直接合成带有靶序列的gRNA再连接到表达载体上即可。4载体构建、导入目的生物或细胞系、筛选

4.1载体构4.2导入目的生物或细胞系在人工培养的哺乳细胞中，可通过电穿孔(electroporation)、核转染(nucleofection)与脂质体介导转染等方法将非自主复制的质粒DNA导入细胞中，使Cas9与sgＲNA可进行瞬时表达。慢性病毒载体(lentiviralvectors)也已用于在人类或小鼠细胞中组成型表达Cas9与sgＲNA。体外转录的ＲNA也可直接注射导入斑马鱼、果蝇或小鼠的胚胎细胞中质粒越大，成功率越低4.2导入目的生物或细胞系4.3筛选

将Cas9、引导ＲNA以及一条含有突变位点的靶DNA的同源重组修复模板共同转化到目的菌株中。若在Cas9对基因组靶DNA序列产生DNA双链断裂后，可利用导入的同源重组修复模板进行DNA修复，由于修复模板在识别互补区或PAM位点中存在突变位点而不能被Cas9再次切割，因而可存活;而未能进行同源重组修复的基因组则由于Cas9的切割降解，无法存活。利用该方法可明显提高基因组编辑后的筛选效率，且在基因组中不残留筛选标记。4.3筛选5CRISPR-Cas9系统的应用基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。通过修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因5.1CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术5CRISPR-Cas9系统的应用基因组编辑技术是一种可以例子：基因敲除的实验过程1.在靶基因序列中寻找NGG序列获得其附近20多个碱基的序列，设计出sgRNA并合成该序列2.将sgRNA及cas9基因连入载体3.转化感受态，质粒小提，测序验证4.细胞培养与细胞转染5.敲除效果检测6.建立稳定敲除的细胞株例子：基因敲除的实验过程1.在靶基因序列中寻找NGG序列获得5.2CRISPR-Cas9介导的转录抑制与转录激活

抑制：在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系统中将Cas9中的切割域突变，会使Cas9蛋白失去对ＤＮＡ的切割活性，但不影响其与ＤＮＡ结合的能力。这种失去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名为DeadＣas9。将ｄCas9与gRNA在细胞中共表达，则gRNA可以介导ｄCas9蛋白与ＤＮＡ结合。如果ｄCas9结合到靶基因的阅读框内，可阻断RNA聚合酶的延伸作用；如果ｄCas9结合到靶基因的启动子区域则可阻止基因转录的起始.5.2CRISPR-Cas9介导的转录抑制与转录激活

抑制激活：将dCas蛋白与具有转录激活的蛋白质功能域融合则可构建具有转录激活活性的CRISPR-on系统。CRISPR转录激活系统的靶序列位置对激活效率有重要影响。当靶序列与启动子的距离合适时，激活效率较高；靶序列处于启动子上游较远位置激活效率相对下降；当靶序列与启动子距离过近，或处于开放阅读框内时则会产生抑制效应。也就是说使用相同的CRISPR-on系统，不同的crRNA既可以对靶基因激活，也可以抑制靶基因表达。真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子ＶＰ16结合获得。CRISPR-Cas英教学讲解课件5.3单切口酶C